МУК 4.2.3566-19. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации Komagataella (Pichia) pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394 в атмосферном воздухе городских и сельских поселений. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 24.10.2019)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 24 октября 2019 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ KOMAGATAELLA (PICHIA) PASTORIS БРЦ ВКПМ Y-4394 В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ ГОРОДСКИХ И СЕЛЬСКИХ ПОСЕЛЕНИЙ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.3566-19
1. Разработаны и подготовлены ФГБОУ ВО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России (д.б.н. Н.И. Шеина).
2. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 24 октября 2019 г.
I. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Komagataella (Pichia) pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394 в атмосферном воздухе городских и сельских поселений в диапазоне концентраций от 5 до 5000 клеток в 1 м3 воздуха.
1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль микробиологического загрязнения воздушной среды, а также санитарных лабораторий биотехнологических предприятий, микробиологических лабораторий, научно-исследовательских организаций, работающих в области гигиены окружающей среды и аккредитованных в установленном порядке на проведение микробиологических исследований.
1.3 Методические указания носят рекомендательный характер.
II. Биологическая характеристика штамма Komagataella (Pichia) pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394 и его гигиенический норматив в атмосферном воздухе городских и сельских поселений
2.1. Штамм Komagataella (Pichia) pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394, включающий рекомбинантный фрагмент ДНК, предполагается использовать в промышленном производстве фермента ксиланазы для кормовых целей.
Мезофил. Хороший рост штамма наблюдается через 24 часа при 25 — 28 °C на глюкозо-пептонном агаре (ГПА).
Штамм растет также на агаризованных средах: глюкозо-пептон-дрожжевом агаре (YPD), глицерин-пептон-дрожжевом агаре (YPG), мясопептонном агаре (МПА), АГВ среде, картофельный агаре (КА).
При росте на агаризованной среде образуются гладкие, округлые колонии с матовой поверхностью светло-бежевого цвета, край ровный. При росте в жидкой среде клетки образуют ровную интенсивную муть, пристеночных пленок не образуют, наблюдается белый осадок, коагуляция отсутствует.
На среде YPD штамм образует клетки округлой, слегка овальной формы размером 3 — 4 мкм, клетки почкуются, почкование многостороннее, истинного мицелия не образуют.
Штамм Komagataella (Pichia) pastoris депонирован в Биоресурсном Центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером БРЦ ВКПМ Y-4394.
Штамм Komagataella (Pichia) pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394 относится к микроорганизмам, непатогенным для человека согласно классификации микроорганизмов, приведенных в санитарных правилах <1>. Работа со штаммом Komagataella (Pichia) pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394 не требует специальных мер предосторожности.
<1> СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
Предельно допустимая концентрация (ПДК) Komagataella (Pichia) pastoris в атмосферном воздухе установлена в гигиенических нормативах <2>.
<2> ГН 2.1.6.3537-18 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) микроорганизмов-продуцентов, бактериальных препаратов и их компонентов в атмосферном воздухе городских и сельских поселений».
III. Пределы измерений
3.1. Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток в атмосферном воздухе городских и сельских поселений в диапазоне концентраций от 5 до 5000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
IV. Методы измерений
4.1. Метод основан на аспирации из атмосферного воздуха городских и сельских поселений клеток псевдомицелия и подсчета количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.
V. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
5.1. При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.
| Наименование средств измерения | Названия документов (ГОСТ, ТУ) |
|---|---|
| Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 — 790 мм рт. ст. и с пределом допустимой погрешности +/- 2,5 мм рт. ст. | ТУ 2504-1799 |
| Весы лабораторные, аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности +/- 0,2 мг | ГОСТ Р 53228 |
| Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2 | ГОСТ 1770 |
| Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0, 2,0, 5,0, 10 см3 | ГОСТ 29227 |
| Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см3 | ГОСТ 1770 |
| Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0 — 55 °C | ТУ 25-2021.003 |
| Прибор для микробиологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) Импактор воздуха микробиологический «Флора-100» |
ТУ 64-12791-77 ТУ 64-098-33-95 |
Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
Вспомогательные устройства и материалы
| Наименование аппаратуры и материалов | Названия документов (ГОСТ, ТУ) |
| 1 | 2 |
| Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру (160 +/- 5) °C | ТУ 9452-010-00141798 |
| Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру (28 +/- 2) °C и (37 +/- 2) °C | ТУ 9452-002-00141798 |
| Автоклав электрический | ГОСТ 9586 |
| Стерилизаторы паровые медицинские | ГОСТ Р ЕН 13060; ГОСТ Р 51935 |
| Дистиллятор | ТУ 4952-007-33142130 |
| Облучатель бактерицидный настенный | ТУ 9444-015-03965956 |
| Холодильник бытовой | ГОСТ 26678 |
| Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа Биолам | ГОСТ 28489 |
| Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов | ГОСТ 23932 |
| Воронки конусные диаметром 40 — 45 мм | ГОСТ 25336 |
| Груша резиновая | ТУ 9398-005-0576 |
| Петля бактериологическая | - |
| Марля медицинская | ГОСТ 9412 |
| Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556 | |
| Бумага фильтровальная лабораторная | ГОСТ 12026 |
| Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками. | |
| Наименование реактивов и питательных сред | Названия документов (ГОСТ) |
|---|---|
| Агар микробиологический | ГОСТ 17206 |
| Вода дистиллированная | ГОСТ 6709 |
| Глюкоза | ГОСТ 6038 |
| Пептон сухой ферментативный | ГОСТ 13805 |
| Спирт этиловый технический | ГОСТ 17299 |
| Спирт этиловый ректификованный | ГОСТ Р 51652; ГОСТ 18300 |
| Дрожжевой экстракт, сухой | ГОСТ 17206 |
Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.
VI. Требования безопасности
6.1. Измерение концентрации клеток гриба в атмосферном воздухе городских и сельских поселений осуществляется в соответствии с санитарными правилами <3>. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами регламентируются ГОСТ 12.1.005, электробезопасность при работе с электроустановками — ГОСТ 12.1.019 и инструкцией — по эксплуатации прибора.
<3> СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
6.2. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованным бактерицидными лампами.
VII. Требования к квалификации операторов
7.1. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним профессиональным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
VIII. Условия измерений
8.1 Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:
- температура воздуха (20 +/- 5) °C;
- атмосферное давление 760 +/- 20 мм рт. ст.;
- влажность воздуха не более 80%.
IX. Приготовление глюкозо-пептон-дрожжевого агара (YPD)
9.1. Для приготовления глюкозо-пептон-дрожжевого агара используют отдельные компоненты среды следующего состава (г/1 000 см3): пептон — 10,0 г, глюкоза — 10,0 г, дрожжевой экстракт — 10,0 г, агар-агар — 15,0 г, дистиллированная вода — 1 000 см3.
Сухие компоненты растворяют в 1 000 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.
Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 — 500 см3 и автоклавируют при 121 °C в течение 15 мин.
Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °C не более 10 дней.
X. Проведение измерения
10.1. Отбор проб воздуха проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02 и ГОСТ Р 8.563.
Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96° этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с Инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
10.2. При выполнении анализа воздуха стерильную агаризованную среду (YPD) расплавляют, остужают до 50 — 60 °C и разливают в чашки Петри.
Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с методическими указаниями <4>. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °C не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2 — 8) °C не более 10 дней.
<4> Пункт 7.1.1 МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред».
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (28 +/- 2) °C. Через 1 — 3 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.
Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии методическими указаниями <5>. Для этого эталонный музейный штамм Komagataella (Pichia) pastoris БРЦ ВКПМ Y-4394 высевается на 2 — 3 чашки используемой среды.
<5> МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред».
Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 — 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.
XI. Вычисление результатов измерения
11.1 Расчет концентрации клеток производят по формуле:
К = (П x 1000)/С x T, кл./м3, где
К — концентрация штамма в воздухе, кл./м3;
П — количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;
1000 — коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;
С — скорость аспирации воздуха, л/мин;
XII. Оформление результатов измерений
12.1. По окончании измерения и расчета концентрации клеток микроорганизма в воздухе должен быть составлен протокол (отчет), в котором представлена необходимая информация:
- о месте отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы);
- о марке пробоотборника, который использовался исследователями, питательной среде и времени инкубации;
- о лицах, производивших отбор проб воздуха, идентификацию штамма и расчет концентрации штамма.
Основные качественные и количественные параметры измерения представляются в виде табл. 4.
Основные качественные и количественные параметры измерения
| Дата проведения | № пробы | Характеристика выросших колоний (количество типичных колоний) | Концентрация, кл./м3 | Соотношение с величиной ПДК |
|---|---|---|---|---|