МУК 4.2.3436-17. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Микробиологическое измерение концентрации Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 ВКПМ B-12259 в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 22.02.2017)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 22 февраля 2017 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗМЕРЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ PAENIBACILLUS MUCILAGINOSUS PM 2906 ВКПМ B-12259 В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.3436-17
1. Разработаны и подготовлены ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России (Н.И. Шеина).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. № 2).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 22 февраля 2017 г.
1. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 ВКПМ B-12259 в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 50 000 клеток в 1 м3 воздуха.
1.2 Методические указания носят рекомендательный характер.
2. Биологическая характеристика штамма Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 ВКПМ B-12259 и его гигиенический норматив в атмосферном воздухе населенных мест
Штамм Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 выделен из окультуренных почв методом многоступенчатой аналитической селекции, не является генетически модифицированным штаммом. Предполагается использовать для производства бактериальных удобрений, а также для профилактики и лечения грибковых заболеваний в растениеводстве. Производственная активность штамма не менее 1,2 x 108 кл./мл.
Таксономическое положение штамма
| Царство | Bacteria |
|---|---|
| Подцарство | Firmicutes |
| Класс | Bacilli |
| Порядок | Bacillales |
| Семейство | Paenibacillaceae |
| Род | Paenibacillus (Ash et al. 1994) |
| Вид | mucilaginosus |
| Штамм | Pm 2906 |
Paenibacillus (лат.) — род аэробных грамположительных спорообразующих палочковидных бактерий. Ранее представители этого рода входили в рРНК третью группу рода Bacillus, в 1993 году Эш, Прист и Коллинс предложили вывести представителей группы 3 в отдельный род Paenibacillus. Название рода произошло от латинского слова «paene» («почти») — в названии рода отражено сходство с родом Bacillus (название рода можно буквально перевести как «почти бациллы»).
Род представлен палочковидными бактериями, образующими термоустойчивые эндоспоры. Некоторые виды подвижны и имеют жгутики. Большинство представителей — мезофилы, есть термофильные представители. Представители рода обитают в почве, ризосфере растений, есть эндофитные представители, колонизирующие ткани растений. Многие представители продуцируют антимикробиальные вещества, проявляющие бактерицидное и фунгицидное действие.
Штамм Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 характеризуется следующими культурально-морфологическими признаками: на среде Эшби наблюдаются слизистые, прозрачные, бесцветные или светло-серые колонии, выпуклые или слегка приплюснутые, блестящие с ровными краями.
Микроскопически различаются неподвижные крупные палочковидные клетки правильной формы с округлыми краями, располагаются одиночно или парами, окруженные слизистой оболочкой, образуют эндоспоры.
Для культивирования используется агаризованная среда Эшби, оптимальная температура (30 +/- 2) °C.
Физиолого-биохимические признаки: в качестве углерода усваивает глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, гидролизует крахмал. В качестве источника азота может быть использован аммонийный азот, карбамид, нитраты. Штамм обладает способностью растворять нерастворимые или малорастворимые соединения фосфора и калия (трикальцийфосфат, силикаты).
Штамм Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 не является зоо- и фитопатогенным, не относится к микроорганизмам, патогенным для человека (СП 1.3.2322-08), депонирован во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ B-12259.
Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест — 5 000 кл./м3.
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений количества штамма в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 50 000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
4. Методы измерений
Прямой метод основан на аспирации из атмосферного воздуха населенных мест бактерий на агаризованную среду Эшби и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы, реактивы и питательные среды.
5.1 Средства измерений
| Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 — 790 мм рт. ст. и с пределом допустимой погрешности +/- 2,5 мм рт. ст. | ТУ 2504-1799-75 |
|---|---|
| Весы лабораторные, аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности +/- 0,2 мг | ГОСТ Р 53228-08 |
| Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2 | ГОСТ 1770-74 |
| Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0, 2,0, 5,0, 10 см3 | ГОСТ 29227-91 |
| Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см3 | ГОСТ 1770-74 |
| Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0 — 55 °C | ТУ 25-2021.003-88 |
| Аспирационный аппарат и устройство для отбора проб воздуха |
Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
5.2 Вспомогательные устройства и материалы
| Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру (160 +/- 5) °C | ТУ 9452-010-00141798-02 |
| Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру (30 +/- 2) °C и (37 +/- 2) °C | ТУ 9452-002-00141798-97 |
| Автоклав электрический | ГОСТ 9586-75 |
| Стерилизаторы паровые медицинские | ГОСТ Р ЕН 13060-11, ГОСТ Р 51935-02 |
| Дистиллятор | ТУ 4952-007-33142130-2000 |
| Облучатель бактерицидный настенный | ТУ 9444-015-03965956-08 |
| Холодильник бытовой | ГОСТ 26678-85 |
| Микроскоп биологический с иммерсионной системой | |
| Лупа с увеличением x10 | ГОСТ 25706-83 |
| Пробирки типов П1, П2 | ГОСТ 25336-82 |
| Спиртовки лабораторные стеклянные | ГОСТ 23932-90 |
| Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов | ГОСТ 23932-90 |
| Воронки конусные диаметром 40 — 45 мм | ГОСТ 25336-82 |
| Груша резиновая | ТУ 9398-005-0576-9082-03 |
| Петля бактериологическая | |
| Марля медицинская | ГОСТ 9412-77 |
| Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81 | |
| Бумага фильтровальная лабораторная | ГОСТ 12026-76 |
| Примечание. Допускается применение оборудования и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками. | |
5.3 Реактивы и питательные среды
| Агар микробиологический | ГОСТ 17206-96 |
| Вода дистиллированная ГОСТ 6709-90 | |
| Глюкоза | ГОСТ 6038-79 |
| Калий сернокислый, хч | ГОСТ 4145-74 |
| Калий фосфорнокислый двузамещенный, хч | ГОСТ 2493-75 |
| Кальций углекислый, хч | ГОСТ 4530-76 |
| Магний сернокислый, хч | ГОСТ 4523-77 |
| Маннит | ГОСТ 8321-74 |
| Натрий хлористый, хч | ГОСТ 4233-77 |
| Сахароза | ГОСТ 5833-75 |
| Спирт этиловый технический | ГОСТ 17299-78 |
| Спирт этиловый ректификованный | ГОСТ Р 51652-2000 или ГОСТ 18300-87 |
| Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками. | |
6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации штамма в атмосферном воздухе населенных мест соблюдают требования, изложенные в следующих документах.
6.1. Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней: СП 1.3.2322-08.
6.2. Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. Дополнения и изменения № 1 к СП 1.3.2322-08: СП 1.3.2518-09.
6.3. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.
6.4. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:
| - температура воздуха | (20 +/- 5) °C; |
|---|---|
| - атмосферное давление | (760 +/- 20) мм рт. ст.; |
| - влажность воздуха | не более 80%. |
9. Приготовление питательных сред
Для приготовления агаризованной среды Эшби используют компоненты следующего состава: маннит, сахароза или глюкоза — 20,0 г, калий сернокислый — 0,2 г, калий фосфорнокислый двузамещенный — 0,2 г, кальций углекислый — 5,0 г, магний сернокислый — 0,2 г, натрий хлористый — 0,2 г, агар-агар — 15,0 г. Сухие компоненты растворяют в 1 000 см3 дистиллированной воды, перемешивают и нагревают до полного растворения агара.
Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 — 500 см3 и автоклавируют при 121 °C в течение 15 мин.
Готовые среды хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °C в течение 14 дней, не более.
10. Проведение измерения
10.1 Отбор проб воздуха
Отбор проб воздуха проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» и Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».
Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависят от предполагаемой концентрации микроорганизма.
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96%-м этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенки крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
10.2 Выполнение анализа
При выполнении анализа воздуха прямым методом стерильную агаризованную среду Эшби расплавляют, остужают до 50 — 60 °C и разливают в чашки Петри.
Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °C не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре 2 — 8 °C не более 10 дней.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (30 +/- 2) °C. Через 1 — 2 суток проводят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.
Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316-08. Для этого эталонный музейный штамм Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 ВКПМ B-12259 высевается на 2 — 3 чашки используемой среды.
Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 — 3 пассажа во избежание потери заданных ей ростовых свойств.
11. Вычисление результатов измерений
Расчет концентрации клеток проводят по формуле:
\text{К } = \frac{\text{П } \cdot 1000}{\text{С } \cdot \text{Т}} \text{кл}./\text{м}^{3}, где
К — концентрация Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 ВКПМ B-12259 в воздухе, кл./м3;
П — количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;
1 000 — коэффициент перерасчета на 1 м3 воздуха;
С — скорость аспирации воздуха, л/мин;
12. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по следующей форме.
Протокол N ___ количественного микробиологического анализа штамма Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 ВКПМ B-12259 в атмосферном воздухе населенных мест
1. Дата проведения анализа ________________________________________________
2. Рабочее место (профессия работающего) __________________________________
3. Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы) ____________________________
4. Вид пробоотборника _____________________________________________________
5. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб ____
6. Питательная среда, время инкубации _____________________________________
7. Результаты испытания ростовых свойств питательной среды ________________
8. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний) __________________________________________
9. Результаты идентификации микроорганизмов Paenibacillus mucilaginosus Pm 2906 ВКПМ B-12259 (микроморфологические признаки) ___________________
10. Результаты расчета концентрации штамма ________________________________
11. Соотношение полученных результатов с уровнем \text{ПДК}_{\text{а}.\text{в}.} ____________________
12. Отбор пробы проведен (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _______________
13. Идентификация штамма и расчет концентрации проведены (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _________________________________________________