МУК 4.1.3514-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств касугамицина в капусте, томатах и томатном соке, плодах и соке яблок методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 29.12.2017)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 29 декабря 2017 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ КАСУГАМИЦИНА В КАПУСТЕ, ТОМАТАХ И ТОМАТНОМ СОКЕ, ПЛОДАХ И СОКЕ ЯБЛОК МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ С МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3514-17

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ «Всероссийский НИИ защиты растений» (В.И. Долженко, А.С. Комарова) и ООО «Инновационный центр защиты растений» (И.А. Цибульская, Т.Д. Черменская), Санкт-Петербург, Пушкин.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 ноября 2017 г. № 1).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 декабря 2017 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство об аттестации методики (метода) измерений № 88-16207-035-RA.RU.310657-2017.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием для определения массовой концентрации касугамицина в капусте, томатах и томатном соке, плодах и соке яблок в диапазоне концентраций 0,05 — 0,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Касугамицин гидрохлорид

[5-амино-2-метил-6-(2,3,4,5,6-пентагидроксициклогексилокси)тетрагидропиран-3-ил]амино- \alpha -иминоуксусная кислота гидрохлорид (IUPAC).

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₄H₂₅N₃O₉ x HCl.

Молекулярная масса: 415,8.

Химически чистое вещество представляет собой бесцветное кристаллическое вещество. Температура плавления: 202 — 204 °C. Давление пара при 25 °C: < 1,3 x 10-2 МПа.

Растворимость (в г/дм3 при 25 °C): вода — 125, метанол — 0,003, в ацетоне и ксилоле < 0,001.

Стабилен при комнатной температуре. Стабилен в слабых кислотах и нестабилен в сильных кислотах и щелочах. DT50 (50 °C): 47 дней (pH 5), 14 дней (pH 9).

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность LD50 для крыс более 5 000 мг/кг, острая дермальная токсичность LD50 для кроликов более 2 000 мг/кг. Не оказывает раздражающего действия на кожу и слизистую оболочку глаз кролика, не обладает мутагенными и тератогенными свойствами, не влияет на репродукцию крыс.

Область применения препарата. Системный фунгицид и бактерицид, получаемый ферментацией Streptomyces kasugaensis. Используется для контроля грибных и бактериальных заболеваний на рисе, овощных и плодовых культурах. Не фитотоксичен для риса, томатов, сахарной свеклы, картофеля и др.

В России для касугамицина гигиенические нормативы не установлены.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительные интервалы среднего результата для полного диапазона концентраций (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

Полнота извлечения касугамицина, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для n = 20, P = 0,95

2. Метод измерений

Метод основан на определении касугамицина с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием масс-спектрометрического детектора после извлечения из образцов подкисленным метанолом.

Идентификация касугамицина проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1 Средства измерений

3.2 Реактивы

Примечание. Допускается использование других реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3 Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается использование вспомогательных устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см2), необходимо соблюдать Федеральные нормы и правила в области промышленной безопасности «Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением» (утв. приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 № 116). Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1 Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,2 — 0,3 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2 Приготовление растворов

7.2.1 Приготовление компонентов подвижной фазы для ВЭЖХ

Компонент A — раствор 0,5%-й (по объему) муравьиной кислоты в воде. В мерную колбу вместимостью 1 000 см3 помещают 300 — 400 см3 бидистиллированной воды, вносят 5,0 см3 муравьиной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.

Компонент B — раствор 0,5%-й (по объему) муравьиной кислоты в метаноле. В мерную колбу вместимостью 1 000 см3 помещают 300 — 400 см3 метанола, вносят 5,0 см3 муравьиной кислоты, доводят метанолом до метки, перемешивают.

7.2.2. Раствор для экстракции и приготовления растворов — 1%-й раствор муравьиной кислоты в метаноле: 10 см3 муравьиной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм3 и доводят объем до метки метанолом.

7.3 Приготовление основного и градуировочных растворов

7.3.1. Основной раствор касугамицина с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску касугамицина гидрохлорида (55 +/- 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в метаноле и доводят объем до метки метанолом.

7.3.2 Приготовление градуировочных растворов

Градуировочные растворы с концентрациями касугамицина 0,002; 0,005; 0,01; 0,02 и 0,05 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя 1%-й раствор муравьиной кислоты в метаноле.

7.3.2.1. Раствор № 1 с концентрацией 1,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,2 см3 основного раствора и доводят до метки 1%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле.

7.3.2.2. Раствор № 2 с концентрацией 0,05 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 0,5 см3 раствора № 1 и доводят до метки 1%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле.

7.3.2.3. Раствор № 3 с концентрацией 0,02 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 0,2 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки 1%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле.

7.3.2.4. Раствор № 4 с концентрацией 0,01 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 0,1 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки 1%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле.

7.3.2.5. Раствор № 5 с концентрацией 0,005 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1,0 см3 раствора № 2 и доводят объем до метки 1%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле.

7.3.2.6. Раствор № 6 с концентрацией 0,002 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1,0 см3 раствора № 3 и доводят объем до метки 1%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле.

Основной раствор касугамицина можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в течение 6 месяцев, градуировочные растворы — в течение недели.

При изучении полноты определения касугамицина используют метанольные растворы веществ, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему метанолом.

7.4 Построение градуировочного графика

Для каждого из градуировочных растворов регистрируют хроматограммы в условиях, указанных в п. 9.2, и определяют абсолютное время удерживания и площадь пика касугамицина (в усл. ед.), соответствующего MRM (380 \rightarrow 200) . Одновременно в режиме автоматической обработки данных определяют соотношение площадей пиков для касугамицина, соответствующих MRM (380 \rightarrow 112) и MRM (380 \rightarrow 70) (S112/S70).

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика — концентрация касугамицина в растворе) в хроматограф вводят по 3 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации касугамицина в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

C = K S, где

S — площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

\frac{|C - C_{\text{к}}|}{\text{С}} \cdot 100 \leq \lambda_{\text{контр}.} , где

C — аттестованное значение массовой концентрации касугамицина в градуировочном растворе;

Cк — результат контрольного измерения массовой концентрации касугамицина в градуировочном растворе;

\lambda_{\text{контр}.} — норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( \lambda_{\text{контр}.} = 10\% при P = 0,95).

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб проводится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79). Пробы капусты отбирают в соответствии с ГОСТ 1724-85 «Капуста белокочанная свежая, заготовляемая и поставляемая. Технические условия (с Изменениями № 1 — 4)»; томатов — в соответствии с ГОСТ 1725-85 «Томаты свежие. Технические условия»; яблок — в соответствии с ГОСТ 27572-87 «Яблоки свежие для промышленной переработки». Пробы капусты, томатов и томатного сока, яблок и яблочного сока хранят до анализа в герметичной таре в морозильной камере при температуре не выше -18 °C, сок хранят в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в стеклянной таре с притертой пробкой в течение недели.

9. Проведение определения

9.1 Определение касугамицина в капусте, томатах и томатном

соке, плодах и соке яблок

Навеску измельченной матрицы или сока 10 г помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку вместимостью 50 см3 и добавляют 40 см3 1%-го раствора муравьиной кислоты в метаноле. Пробирку плотно закрывают и помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4 000 об./мин. Измеряют объем полученного экстракта с помощью мерного цилиндра (Vэкстр.). От верхнего слоя отбирают 1 см3 и переносят в градуированные пробирки вместимостью 10 см3. Добавляют 1%-й раствор муравьиной кислоты в метаноле до объема (100/Vэкстр.) соответствующего содержанию матрицы 0,1 г в 1 см3, и фильтруют через фильтр в виалы для хроматографирования. Виалы помещают в автосамплер хроматографа для анализа методом ВЭЖХ-МС по п. 9.2.

9.2 Условия хроматографирования

9.2.1 Хроматографические условия измерений

Хромато-масс-спектрометр, состоящий из высокоэффективного жидкостного хроматографа и масс-спектрометра с тройным квадруполем.

Аналитическая колонка с обращенной фазой, ионными группами и длинной гидрофобной цепью (150 x 2,1 мм), 5 мкм. Температура колонки (45 +/- 1) °C. Скорость потока элюента 0,2 см3/мин. Объем вводимой пробы 3 мм3. Время удерживания касугамицина — (6,9 +/- 0,2) мин.

Режим элюирования — градиентный:

9.2.2 Масс-спектрометрические условия измерений

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание касугамицина в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

X = \frac{S_{x} \cdot K \cdot V}{P} \cdot \frac{100}{f} , где

Sx — площадь пика касугамицина на хроматограмме испытуемого образца, (AU);

K — градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

f — полнота извлечения касугамицина, приведенная в табл. 2, %;

V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3 (1 см3);

P — навеска анализируемого образца, г (аликвота, равная 0,1 г).

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор касугамицина с концентрацией 0,05 мкг/см3, разбавляют 1%-м раствором муравьиной кислоты в метаноле.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

\frac{2|X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r , где (1)

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r — значение предела повторяемости (r = 2,8 \times \sigma_{r}) .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(\overline{X} \pm \Delta)\text{мг}/\text{кг} при вероятности P = 0,95, где

\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \frac{\delta \cdot \overline{X}}{100} , где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе менее нижней границы определения» (например: менее 0,05 мг/кг <>, где <> — 0,05 мг/кг — предел определения касугамицина в капусте).

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода «добавок».

Величина добавки Cд должна удовлетворять условию:

C_{\text{д}} = \Delta_{\text{л},\text{Х}} + \Delta_{\text{л},\text{Х }\prime} , где

\pm \Delta_{\text{л},\text{Х}}( \pm \Delta_{\text{л},\text{Х }\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, при этом:

\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta , где

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \frac{\delta \cdot \overline{X}}{100} , где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:

\text{К}_{\text{к}} = \overline{\text{Х}}\prime - \overline{\text{Х}} - \text{С}_{\text{д}} , где

\overline{\text{Х}}\prime , \overline{\text{Х}} , Cд — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},\text{Х }\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},\text{Х}}^{2}}

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

|Кк| <= К, (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

\frac{2|X_{1} - X_{2}|100}{(X_{1} + X_{2})} \leq R , где (3)

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.