МУК 4.1.3504-17. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств флуксапироксада в цитрусовых, плодовых косточковых (нектарины, персики), клубнике, бананах, томатах, баклажанах, салате-латук, луке-порее, сое (бобы, масло), хлопке (семена, масло), рисе, кофе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 29.12.2017)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 29 декабря 2017 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ФЛУКСАПИРОКСАДА В ЦИТРУСОВЫХ, ПЛОДОВЫХ КОСТОЧКОВЫХ (НЕКТАРИНЫ, ПЕРСИКИ), КЛУБНИКЕ, БАНАНАХ, ТОМАТАХ, БАКЛАЖАНАХ, САЛАТЕ-ЛАТУК, ЛУКЕ-ПОРЕЕ, СОЕ (БОБЫ, МАСЛО), ХЛОПКЕ (СЕМЕНА, МАСЛО), РИСЕ, КОФЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3504-17

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в цитрусовых, плодовых косточковых (нектарины, персики), клубнике, бананах, томатах, баклажанах, салате-латук, луке-порее, сое (бобы, масло), хлопке (семена, масло), рисе, кофе массовой концентрации флуксапироксада в диапазонах 0,01 — 0,1 мг/кг (растения) и 0,008 — 0,08 мг/кг (масло).

Методические указания носят рекомендательный характер.

Флуксапироксад

3-Дифторметил-1-метил-N-(3,4,5-трифтор[1,1-бифенил]-2-ил)-1H-пиразол-4-карбоксамид (ИЮПАК).

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C₁₈H₁₂F₅N₃O.

Молекулярная масса: 381,3.

Твердое порошкообразное вещество бежевого цвета без запаха. Температура плавления: 156,8 °C. Давление паров: 2,7 x 10-7 МПа (при 25 °C). Растворимость в органических растворителях при 20 °C (в г/дм3): ацетон — 250; ацетонитрил > 100; дихлорметан > 100; метанол — 53,4; толуол — 20,0; этилацетат — 123,3. Растворимость в воде при 20 °C (в мг/дм3): 3,78. Флуксапироксад гидролитически стабилен при pH 4 — 9.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LD50) для крыс > 2 000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD50) для кроликов > 2 000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LC50) для крыс > 5,1 мг/дм3.

Область применения. Флуксапироксад — системный фунгицид, относится к классу пиразолкарбоксамидов, рекомендуется для борьбы с комплексом болезней зерновых культур.

1. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Значения характеристики погрешности, нормативов оперативного контроля точности, повторяемости, воспроизводимости

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата

2. Метод измерений

Методика основана на определение вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе с тройным квадрупольным масс-спектрометрическим детектором.

Уровни флуксапироксада в цитрусовых, плодовых косточковых, клубнике, бананах, томатах, баклажанах, салате-латук, луке-порее, сое (семена), хлопке (семена), рисе, кофе определяют после экстракции из анализируемых проб смесью метанол — вода, центрифугирования, очистки переэкстракцией в этилацетат. Флуксапироксад в растительном масле определяют после экстракции образца, растворенного в гексане, ацетонитрилом.

Нижний предел измерения флуксапироксада в анализируемом объеме пробы — 0,004 нг.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1 Средства измерений

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2 Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3 Вспомогательные устройства, материалы

Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-15. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/см2), необходимо соблюдать Федеральные нормы и правила в области промышленной безопасности «Правила промышленной безопасности опасных производственных объектов, на которых используется оборудование, работающее под избыточным давлением» (утв. Приказом Ростехнадзора от 25.03.2014 № 116). Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

5. Требования к оператору

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист, имеющий опыт работы на жидкостном хроматографе, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

7.1 Очистка органических растворителей

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, приготовление градуировочных растворов, растворов внесения, установление градуировочной характеристики.

7.1.1 Очистка ацетонитрила

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 дм3 ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 часа, после чего перегоняют. Непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 дм3 ацетонитрила 10 г карбоната калия).

7.1.2 Очистка этилацетата

7.1.2.1. Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%. Навеску (25 +/- 0,1) г натрия углекислого помещают в мерную колбу вместимостью 500 см3, растворяют в бидистиллированной воде, доводят водой до метки, перемешивают. Раствор хранят в стеклянной посуде в течение 3 месяцев.

7.1.2.2. Очистка растворителя. Этилацетат промывают последовательно 5%-м водным раствором натрия углекислого, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30. Растворитель хранят в стеклянной посуде в течение 1 месяца.

7.1.3 Очистка н-гексана

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты, до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.2 Приготовление смеси метанол — вода (1:1, по объему)

В мерную колбу вместимостью 1 000 см3 помещают 500 см3 метанола, доводят до метки бидистиллированной водой, перемешивают.

Раствор хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

7.3 Приготовление раствора соляной кислоты с концентрацией

2 моль/дм3(2 М раствор)

В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 50 см3 бидистиллированной воды, осторожно приливают 16,6 см3 37%-й соляной кислоты, доводят до метки водой, перемешивают.

7.4 Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

Компонент А: в мерную колбу вместимостью 1 000 см3 помещают 500 см3 ацетонитрила, вносят 1,0 см3 муравьиной кислоты, доводят до метки ацетонитрилом, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр, дегазируют.

Компонент Б: в мерную колбу вместимостью 1 000 см3 помещают 500 см3 деионизированной воды, вносят 1,0 см3 муравьиной кислоты, доводят до метки деионизированной водой, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр, дегазируют.

Каждый компонент подвижной фазы хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

7.5 Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ

Промывают колонку подвижной фазой (смесь компонентов А и Б, приготовленных по п. 7.4, в соотношении 1:1) при скорости подачи растворителя 0,4 см3/мин до установления стабильной базовой линии.

7.6 Приготовление градуировочных растворов и растворов

внесения

7.6.1. Исходный раствор флуксапироксада для градуировки (концентрация 100 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают (0,0100 +/- 0,0001) г флуксапироксада, добавляют 50 — 70 см3 метанола, перемешивают, доводят метанолом до метки, вновь перемешивают. Раствор хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение 6 месяцев.

Растворы № 1 — 8 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

7.6.2. Раствор № 1 флуксапироксада для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 10 см3 исходного раствора флуксапироксада (п. 7.6.1) с концентрацией 100 мкг/см3, разбавляют метанолом до метки, перемешивают. Раствор № 1 хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение 6 месяцев.

7.6.3. Раствор № 2 флуксапироксада для градуировки и внесения (концентрация 0,1 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают по 1,0 см3 градуировочного растворов № 1 с концентрацией флуксапироксада 10,0 мкг/см3 (п. 7.6.2), доводят до метки метанолом, тщательно перемешивают, получают рабочий раствор № 2 с концентрацией флуксапироксада 0,1 мкг/см3. Раствор № 2 хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C) в течение одного месяца.

7.6.4. Рабочие растворы № 3 — 7 флуксапироксада для градуировки (концентрация 0,8 — 10 нг/см3). В 5 мерных колб вместимостью 100 см3 помещают 10,0; 5,0; 2,5; 1,0 и 0,8 см3 градуировочного раствора № 2 с концентрацией флуксапироксада 0,1 мкг/см3 (п. 7.6.3), доводят до метки смесью растворителей, приготовленной по п. 7.2, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 3 — 7 с концентрацией флуксапироксада 10,0; 5,0; 2,5; 1,0 и 0,8 нг/см3 соответственно. Растворы хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение одной недели.

7.7 Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (I) от концентрации флуксапироксада в растворе (нг/см3), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 5 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений.

8. Отбор и хранение проб

Отбор проб осуществляют в соответствии с ГОСТ Р 53596-09 «Плоды цитрусовых культур для употребления в свежем виде. Технические условия»; ГОСТ Р 54702-11 «Персики и нектарины свежие. Технические условия»; ГОСТ Р 53884-10 «Земляника, реализуемая в розничной торговле. Технические условия», ГОСТ Р 50520-93 «Земляника. Руководство по хранению в холодильных камерах»; ГОСТ Р 51603-2000 «Бананы свежие. Технические условия»; ГОСТ 1725-85 «Томаты свежие. Технические условия»; ГОСТ 13907-86 «Баклажаны свежие. Технические условия»; ГОСТ Р 54703-11 «Салат-латук, эндивий кудрявый, эндивий эскариол свежие. Технические условия»; ГОСТ 31854-12 «Лук-порей свежий, реализуемый в розничной торговле»; ГОСТ 17109-88 «Соя. Требования при заготовках и поставках»; ГОСТ 16298-81 «Хлопок-сырец машинного сбора. Технические условия»; ГОСТ 6292-93 «Крупа рисовая. Технические условия»; ГОСТ ISO 4072-15 «Кофе зеленый в мешках. Отбор проб», а также в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79).

Растительные пробы хранят при температуре (4 +/- 2) °C не более недели. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре не выше -18 °C.

Перед анализом образцы измельчают.

9. Выполнение определения

9.1 Экстракция

9.1.1 Растительные образцы

Образец массой 5 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 — 300 см3, добавляют 100 см3 смеси метанол — вода (подготовленной по п. 7.2), помещают на аппарат для встряхивания на 15 минут.

Пробам дают отстояться. Затем аликвоту экстракта объемом 10 см3 переносят в центрифужную пробирку с пробкой на 15 см3, центрифугируют 5 мин при 4 000 об./мин. Переносят 2 см3 супернатанта в центрифужную пробирку с пробкой на 50 см3, добавляют 200 мм3 2 М соляной кислоты (подготовленной по п. 7.3), 8 см3 насыщенного раствора хлорида натрия и 10 см3 этилацетата, интенсивно встряхивают в течение 1 мин, затем центрифугируют 2 мин при 4 000 об./мин.

Переносят 8 см3 верхней фазы в круглодонную колбу на 50 см3 и упаривают досуха при 40 °C. Остаток растворяют в 1 мл смеси метанол — вода (подготовленной по п. 7.2) при помощи ультразвуковой бани, фильтруют и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2.

9.1.2 Растительное масло

Образец масла массой 5 г помещают в делительную воронку вместимостью 250 см3, добавляют 50 см3 гексана и 50 см3 ацетонитрила, интенсивно встряхивают в течение 1 мин, затем сливают ацетонитрильную фазу (нижняя) в новую делительную воронку.

Промывают ацетонитрильную фазу 50 см3 гексана, сливают ацетонитрильную фазу (нижняя) в мерную колбу на 100 см3 и доводят до метки ацетонитрилом.

Переносят аликвоту 2 см3 в круглодонную колбу на 50 см3 и упаривают досуха при 40 °C. Остаток растворяют в 1 мл смеси метанол — вода (подготовленной по п. 7.2) при помощи ультразвуковой бани, фильтруют и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.2.

9.2 Условия хроматографирования

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

Жидкостный хроматограф с тандемным масс-спектрометрическим детектором (тройной квадруполь с источником ионизации, оснащенным соосной подачей горячего азота для эффективной десольвации ионов).

Источник ионизации: электростатическое распыление.

Режим работы: регистрация дочерних положительных ионов после разрушения материнских ионов (регистрация «перехода»).

Материнский ион (масса/заряд): 382,1.

Дочерние ионы (масса/заряд): 362,2 (количественный расчет), 342,2

Напряжение на фрагментаторе, В: 119.

Энергия разрушения (соударения), В: 9 (382,1 \rightarrow 362,2) , 17 (382,1 \rightarrow 342,2) .

Скорость сканирования: 200 мс.

Давление на распылителе: 35 psi.

Скорость осушающего газа 1 (азот): 10 дм3/мин.

Температура газа 1: 250 °C.

Скорость газа 2 (азот): 11 дм3/мин.

Температура газа 2: 340 °C.

Температура квадруполей (1 и 3): 100 °C.

Хроматографическая колонка стальная длиной 50 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазовым сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, зернением 1,8 мкм.

Температура колонки: 40 °C.

Скорость потока элюента: 0,4 см3/мин.

Объем вводимой пробы: 5 мм3.

Подвижная фаза: 0,1%-й раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле — 0,1%-й раствор муравьиной кислоты в воде (50:50, изократический режим элюирования).

Линейный диапазон детектирования: 0,004 — 0,05 нг.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 10,0 нг/см3, разбавляют подвижной фазой (не более чем в 50 раз).

10. Обработка результатов анализа

Содержание флуксапироксада в растительных пробах и пробах масла (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

X = \frac{A \cdot V \cdot K}{1000 \cdot m} , где

A — концентрация флуксапироксада, найденная по градуировочному графику в соответствии с величинами площадей хроматографических пиков, нг/см3;

V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;

m — масса анализируемого образца, г;

C — коэффициент, учитывающий объем экстракта, взятого для анализа, C = 62,5 (растения), C = 50 (масло).

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости:

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r , где (1)

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8 \cdot \sigma_{r} .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(\overline{X} \pm \Delta) , мг/кг при вероятности P = 0,95, где

\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} , где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание флуксапироксада в растительных пробах — менее 0,01 мг/кг <*>; в пробах масла — менее 0,008 мг/кг <*>».

<*> 0,01 мг/кг; 0,008 мг/кг — пределы обнаружения флуксапироксада в растительных пробах и пробах масла соответственно.

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1 Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее двух образцов концентраций для градуировки, содержание флуксапироксада в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,8 до 10,0 нг/см3.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

A = \frac{(X - C) \cdot 100}{C} \leq B , где

X — концентрация флуксапироксада в пробе при контрольном измерении, нг/см3;

C — известная концентрация градуировочного раствора флуксапироксада, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, нг/см3;

B — норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов флуксапироксада, предусмотренных МИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.7.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом «добавок».

Величина добавки Cд должна удовлетворять условию:

\text{С}_{\text{д}} \geq \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X\prime} , где

\pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно) мг/кг, при этом:

\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta , где

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} , где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:

\text{К}_{\text{к}} = \overline{X}\prime - \overline{X} - \text{С}_{\text{д}} , где

\overline{X}\prime , \overline{X} , Cд — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

\text{К} = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л },X}^{2}}

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

|Кк| <= К, (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R):

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq R , где (3)

X₁, X₂ - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг;

R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Методические указания разработаны ФБУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Н.Е. Федорова, В.В. Баюшева).