МУК 4.1.3406-16. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств пропилентиомочевины в луке-репке, ботве и клубнях картофеля, томатах и томатном соке, яблоках и яблочном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

№ МУК 4.1.3406-16Действующий акт

(утв. Роспотребнадзором 29.12.2016)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 29 декабря 2016 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ПРОПИЛЕНТИОМОЧЕВИНЫ В ЛУКЕ-РЕПКЕ, БОТВЕ И КЛУБНЯХ КАРТОФЕЛЯ, ТОМАТАХ И ТОМАТНОМ СОКЕ, ЯБЛОКАХ И ЯБЛОЧНОМ СОКЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3406-16

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ «Всероссийский НИИ защиты растений» и ООО «Инновационный центр защиты растений» (В.И. Долженко, И.А. Цибульская, А.С. Комарова, Т.Д. Черменская).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. № 2).

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 декабря 2016 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.232/01.00043/2016.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации пропилентиомочевины в луке-репке, клубнях картофеля, томатах и томатном соке, яблоках и яблочном соке в диапазоне концентраций 0,01 — 0,1 мг/кг, в ботве картофеля в диапазоне концентраций 0,1 — 1,0 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Пропилентиомочевина

4-Метил-2-имидазолидинтион (ИЮПАК)

рис. 1

Брутто формула: C4H8N2S.

Молекулярная масса: 116,2.

Пропилентиомочевина является основным метаболитом при деградации пропинеба.

Белое кристаллическое вещество без запаха.

Растворима в ацетонитриле и метаноле.

Kow logP = 0,26 (20 °C); константа Генри 8·10-8 Па·м3/моль (20 °C).

Период полураспада в почве: DT₅₀ (20 °C, аэробные условия) 2,1 день.

Гигиенические нормативы для пропилентиомочевины в России не установлены.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в таблице 1, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры

Анализируемый объект	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Показатель точности <*> (границы относительной погрешности (P = 0,95), \pm \delta , %	Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), \sigma_{r} , %	Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), \sigma_{R} , %	Предел повторяемости (значение допустимого расхождения между двумя результатами параллельных определений), r, %	Предел воспроизводимости (значение допустимого расхождения между двумя результатами измерений, полученных в разных лабораториях), R, % (P = 0,95)
Ботва картофеля	0,1 — 1,0	25	10	13	28	36
Клубни картофеля	0,01 — 0,1	25	10	13	28	36
Лук-репка	0,01 — 0,1	25	10	13	28	36
Томаты	0,01 — 0,1	25	10	13	28	36
Томатный сок	0,01 — 0,1	25	10	13	28	36
Яблоки	0,01 — 0,1	25	10	13	28	36
Яблочный сок	0,01 — 0,1	25	10	13	28	36
<*> Соответствует расширенной неопределенности Uотн. (в относительных единицах) при коэффициенте охвата k = 2

Таблица 2

Полнота извлечения пропилентиомочевины, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для n = 20, P = 0,95

Анализируемый объект	Предел обнаружения, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Полнота извлечения, %	Стандартное отклонение, %	Доверительный интервал среднего результата, +/- %
Ботва картофеля	0,1	0,1 — 1,0	79,6	3,14	1,38
Клубни картофеля	0,01	0,01 — 0,1	80,3	2,97	1,30
Лук-репка	0,01	0,01 — 0,1	79,6	3,40	1,49
Томаты	0,01	0,01 — 0,1	82,0	3,29	1,44
Томатный сок	0,01	0,01 — 0,1	83,7	4,82	2,11
Яблоки	0,01	0,01 — 0,1	83,2	4,87	2,13
Яблочный сок	0,01	0,01 — 0,1	80,2	3,96	1,73

2. Метод измерений

Метод основан на определении пропилентиомочевины методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием ультрафиолетового (УФ) детектора после извлечения из образцов водным метанолом и последующей очистки с использованием окиси алюминия.

Идентификация пропилентиомочевины проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1 Средства измерений

Жидкостный хроматограф с УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки
	Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 150 г, предел допустимой погрешности 5 мг
Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 81/210 г, предел допустимой погрешности 0,1/0,3 мг
Колбы мерные на 10, 100 см3	ГОСТ 23932-90
Микродозаторы одноканальные переменного объема от 100 до 1 000 мм3 и от 1 до 5 см3
Цилиндры мерные на 50 и 100 см3	ГОСТ 23932-90

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2 Реактивы

Алюминия окись для хроматографии, ч, нейтральный, 100 — 200 мкм
Ацетонитрил для ВЭЖХ	ТУ 2634-002-04715285-12
Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная, деионизованная)	ГОСТ Р 52501-05
Кислота ортофосфорная 98%, хч	ГОСТ 6552-80
Метанол, хч	ГОСТ 6995-77
	Пропилентиомочевина с содержанием основного вещества 95,6%
Подвижная фаза для ВЭЖХ: смесь ацетонитрила и 0,005 М H₃PO₄ в соотношении 1:99

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3 Вспомогательные устройства и материалы

Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18, (100 x 2,1) мм, 1,7 мкм
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 50 и 100 см3	ГОСТ 9737-93
	Пробирки полипропиленовые центрифужные с крышками объемом 50 см3
Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар
Ультразвуковая ванна с рабочей частотой 37 кГц
Устройство перемешивающее (50 — 200 колебаний в минуту)	ТУ 4389-007-44330709-11
Центрифуга со скоростью вращения 4 000 об./мин

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-15.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, владеющий методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, имеющий опыт работы, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1 Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 — 0,2 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2 Приготовление растворов

7.2.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 +/- 0,01) г 98%-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм3, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки.

7.2.2. Для приготовления 75%-го водного метанола, в мерную колбу объемом 1 дм3 помещают 750 мл метанола и доводят объем до метки бидистиллированной водой.

7.2.3. Для приготовления подвижной фазы смешивают ацетонитрил с 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты в соотношении 1:99 по объему, используя мерные цилиндры.

7.3 Приготовление основного и градуировочных растворов

7.3.1. Основной раствор с концентрацией 0,5 мг/см3: точную навеску пропилентиомочевины (50 +/- 0,5 мг) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом.

7.3.2 Приготовление градуировочных растворов

Градуировочные растворы с концентрациями пропилентиомочевины 0,05; 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты.

7.3.2.1. Раствор № 1 с концентрацией 1,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,2 см3 основного раствора и доводят до метки 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты.

7.3.2.2. Раствор № 2 с концентрацией 0,5 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 5 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты.

7.3.2.3. Раствор № 3 с концентрацией 0,2 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 2 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты.

7.3.2.4. Раствор № 4 с концентрацией 0,1 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты.

7.3.2.5. Раствор № 5 с концентрацией 0,05 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 0,5 см3 раствора № 1 и доводят объем до метки 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты.

Основной раствор можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в течение 7 дней, градуировочные растворы использовать в день приготовления.

При изучении полноты определения пропилентиомочевины используют растворы вещества, приготовленные из основного раствора методом последовательного разбавления по объему 0,005 М раствором ортофосфорной кислоты.

7.4 Построение градуировочного графика

Для установления градуировочной характеристики (площадь пика — концентрация пропилентиомочевины в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации пропилентиомочевины в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии:

C = KS, где

S — площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

\frac{|C - C_{K}|}{C} \cdot 100 \leq \lambda_{\text{контр}.} , где

C — аттестованное значение массовой концентрации пропилентиомочевины в градуировочном растворе;

CK — результат контрольного измерения массовой концентрации пропилентиомочевины в градуировочном растворе;

\lambda_{\text{контр}.} — норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( \lambda_{\text{контр}.} = 10\% при P = 0,95).

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ Р 51783-01 «Лук репчатый свежий, реализуемый в розничной торговой сети. Технические условия»; ГОСТ 7194-81 «Картофель свежий. Правила приемки и методы определения качества»; ГОСТ 1725-85 «Томаты свежие. Технические условия»; ГОСТ 27572-87 «Яблоки свежие для промышленной переработки». Пробы овощей хранят до анализа в герметичной полиэтиленовой упаковке в морозильной камере при -18 °C в течение 6 месяцев. Перед анализом пробы измельчают, не размораживая. Пробы яблок хранят до анализа в герметично закрытом двойном полиэтиленовом пакете в морозильной камере при температуре не выше -18 °C в течение 6 месяцев. Пробы яблочного и томатного сока хранят в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в стеклянной таре с притертой пробкой в течение недели.

9. Проведение определения

9.1 Определение пропилентиомочевины в ботве и клубнях

картофеля, луке-репке, плодах томата и яблок

Навеску исследуемого материала 20 г помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку, добавляют 50 см3 75%-го водного метанола и экстрагируют в ультразвуковой ванне 10 мин. Растворитель декантируют и экстракцию повторяют еще с 50 см3 75%-го водного метанола. 35 см3 объединенного экстракта переносят в чистую пробирку и добавляют 10 см3 окиси алюминия. Пробирку помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют при 4 000 об./мин 10 мин. После этого отбирают 25 см3 экстракта (аликвота, соответствующая 5 г) в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы и 10 мм3 вводят в хроматограф.

Пробы ботвы растворяют в 10 см3 подвижной фазы и 10 мм3 вводят в хроматограф.

9.2 Определение пропилентиомочевины в томатном и яблочном

соках

Из представительной пробы сока отбирают 10 г и переносят в пробирку с 3 см3 окиси алюминия. Пробирку помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют при 4 000 об./мин 10 мин. После чего отбирают 5 см3 (аликвота, соответствующая 5 г) в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы и 10 мм3 вводят в хроматограф.

9.3 Условия хроматографирования

Ультраэффективный жидкостной хроматограф УФ детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами C18, (100x2,1) мм, 1,7 мкм. Температура колонки 30 +/- 1 °C. Подвижная фаза: ацетонитрил и 0,005 М ортофосфорная кислота в соотношении 1:99. Скорость потока элюента: 0,2 см3/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора 233 нм. Объем вводимой пробы 10 мм3. Время удерживания пропилентиомочевины 3,7 +/- 0,1 мин.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание пропилентиомочевины в пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:

X = Sx·K·V/P, где

Sx — площадь пика пропилентиомочевины на хроматограмме испытуемого образца, (AU);
K — градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;
V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3;
P — навеска анализируемого образца, г.

Содержание остаточных количеств пропилентиомочевины в образце вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор пропилентиомочевины с концентрацией 1,0 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r

где X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r — значение предела повторяемости (r = 2,8\sigma_{r}) .

При невыполнении условия выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(\overline{X} \pm \Delta) мг/кг при вероятности P = 0,95,

где \overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг;

\Delta = \delta*X/100 ,

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.

В случае если содержание компонента меньше нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание вещества в пробе „менее нижней границы определения“ (например: менее 0,01 мг/кг <>, где <> — 0,01 мг/кг — предел обнаружения пропилентиомочевины в луке).»

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки Cд должна удовлетворять условию:

C_{\text{д}} = \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X'} ,

где \pm \Delta_{\text{л},X} ( \pm \Delta_{\text{л},X'}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой, соответственно), мг/кг; при этом:

\Delta_{\text{л}} = \pm 0.84\Delta

где \Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \delta*X/100 ,

Результат контроля процедуры Kк рассчитывают по формуле:

Kк = X' — X - Cд,

где X', X, Cд — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки, соответственно, мг/кг.

Норматив контроля K рассчитывают по формуле:

K = \sqrt{\Delta_{\text{л},X'}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}} (1)

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Kк) с нормативом контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

|Kк| <= K, (2)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости (R):

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq R , (3)

где X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, таблица 1), %.