МУК 4.1.3126-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств спиромезифена и его основного метаболита спиромезифена-енола в воде, почве, огурцах, томатах и томатном соке, яблоках и яблочном соке, винограде и виноградном соке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 06.11.2013)

Утверждаю

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ СПИРОМЕЗИФЕНА И ЕГО ОСНОВНОГО МЕТАБОЛИТА СПИРОМЕЗИФЕНА-ЕНОЛА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, ОГУРЦАХ, ТОМАТАХ И ТОМАТНОМ СОКЕ, ЯБЛОКАХ И ЯБЛОЧНОМ СОКЕ, ВИНОГРАДЕ И ВИНОГРАДНОМ СОКЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3126-13

1. Разработаны ФБУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора (В.Н. Ракитский, Т.В. Юдина, Н.Е. Федорова, В.Н. Волкова).

Свидетельство об аттестации МВИ № 01.00282-2008/0164.29.04.13 от 29.04.2013.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения массовой концентрации спиромезифена и его основного метаболита спиромезифена-енола в воде, почве, огурцах, томатах и томатном соке, яблоках и яблочном соке, винограде и виноградном соке в диапазоне 0,0005 — 0,005 мг/дм3 (вода); 0,05 — 0,5 мг/кг (почва, огурцы, томаты и томатный сок); 0,02 — 0,2 мг/кг (яблоки и яблочный сок, виноград и виноградный сок).

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: спиромезифен (BSN 2060).

Название действующего вещества по ИЮПАК: 3-мезитил-2-оксо-1-оксаспиро[4,4]нон-3-ен-4-ил 3,3-диметилбунатоат.

Структурная формула:

Эмпирическая формула: C_{23}H_{30}O_{4} .

Молекулярная масса: 370,49.

Бесцветное кристаллическое вещество с характерным запахом. Температура плавления 98,7 °C. Давление паров 1 \cdot 10^{- 3}\text{мПа} (20 °C), 7 \cdot 10^{- 3}\text{мПа} (при 25 °C). Растворимость в органических растворителях (при 20 °C, в г/дм3): ацетон, этилацетат, ацетонитрил, ксилол — более 250; 2-пропанол — 110; 1-октанол — 60; н-гептан — 23. Растворимость в воде при 20 °C — 0,13 мг/дм3. Коэффициент распределения в системе н-октанол-вода K_{ow}logP = 4,55 .

Основным продуктом метаболитической деградации спиромезифена в растениях, воде и почве является спиромезифен-енол (BSN 2060-enol).

Эмпирическая формула: C_{17}H_{20}O_{3} .

Молекулярная масса: 272,3.

Область применения препарата

Спиромезифен — несистемный инсектицид класса кетоенолов, обладающий и акарицидной активностью, рекомендуется для борьбы с широким спектром насекомых на различных сельскохозяйственных культурах (фрукты, овощи, виноград и др.).

1. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

Метрологические параметры

Определяемое вещество	Диапазон определяемых концентраций, мг/дм3, мг/кг	Показатель точности (границы относительной погрешности, P = 0,95) \pm \delta , %	Показатель повторяемости (среднеквадратичное отклонение повторяемости) \sigma_{r} , %	Показатель воспроизводимости (среднеквадратичное отклонение воспроизводимости) \sigma_{R} , %	Предел повторяемости (значение допустимого расхождения между двумя результатами параллельных определений) r, %	Предел воспроизводимости (значение допустимого расхождения между двумя результатами измерений, полученных в разных лабораториях) R, % (P = 0,95)
1	2	3	4	5	6	7
Вода
Спиромезифен	0,0005 — 0,005 мг/дм3	50	4,0	5,6	11	16
Спиромезифен-енол	0,0005 — 0,005 мг/дм3	50	2,5	3,5	7	10
Почва
Спиромезифен	0,05 — 0,5 мг/кг	50	3,8	7,6	11	21
Спиромезифен-енол	0,05 — 0,5 мг/кг	50	2,8	5,6	8	16
Огурцы
Спиромезифен	0,05 — 0,5 мг/кг	50	4,2	5,9	12	17
Спиромезифен-енол	0,05 — 0,5 мг/кг	50	3,4	4,8	10	14
Томаты
Спиромезифен	0,05 — 0,5 мг/кг	50	3,8	5,3	11	15
Спиромезифен-енол	0,05 — 0,5 мг/кг	50	3,7	5,0	10	14
Томатный сок
Спиромезифен	0,05 — 0,5 мг/кг	50	3,1	4,3	9	12
Спиромезифен-енол	0,05 — 0,5 мг/кг	50	2,8	3,9	8	11
Яблоки
Спиромезифен	0,02 — 0,2 мг/кг	50	4,1	5,7	11	16
Спиромезифен-енол	0,02 — 0,2 мг/кг	50	3,9	5,5	11	15
Яблочный сок
Спиромезифен	0,02 — 0,2 мг/кг	50	3,8	5,3	11	15
Спиромезифен-енол	0,02 — 0,2 мг/кг	50	4,2	5,9	12	17
Виноград
Спиромезифен	0,02 — 0,2 мг/кг	50	3,6	5,0	10	14
Спиромезифен-енол	0,02 — 0,2 мг/кг	50	3,6	5,0	10	14
Виноградный сок
Спиромезифен	0,02 — 0,2 мг/кг	50	3,5	4,9	10	14
Спиромезифен-енол	0,02 — 0,2 мг/кг	50	4,2	5,9	12	17

Полнота извлечения веществ, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

Определяемое вещество	Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20
	Предел обнаружения, мг/дм3, мг/кг	Диапазон определяемых концентраций, мг/дм3, мг/кг	Средняя полнота извлечения, %	Стандартное отклонение, %	Доверительный интервал среднего результата, %
1	2	3	4	5	6
Вода
Спиромезифен	0,0005	0,0005 — 0,005	92,4	4,06	+/- 2,13
Спиромезифен-енол	0,0005	0,0005 — 0,005	97,6	2,48	+/- 1,32
Почва
Спиромезифен	0,05	0,05 — 0,5	87,5	3,82	+/- 2,02
Спиромезифен-енол	0,05	0,05 — 0,5	95,2	2,83	+/- 1,51
Огурцы
Спиромезифен	0,05	0,05 — 0,5	86,2	4,18	+/- 2,23
Спиромезифен-енол	0,05	0,05 — 0,5	93,8	3,37	+/- 1,80
Томаты
Спиромезифен	0,05	0,05 — 0,5	85,8	3,82	+/- 2,04
Спиромезифен-енол	0,05	0,05 — 0,5	96,7	3,68	+/- 1,80
Томатный сок
Спиромезифен	0,05	0,05 — 0,5	92,4	3,05	+/- 1,62
Спиромезифен-енол	0,05	0,05 — 0,5	93,1	2,81	+/- 1,50
Яблоки
Спиромезифен	0,02	0,02 — 0,2	88,3	4,10	+/- 2,18
Спиромезифен-енол	0,02	0,02 — 0,2	93,8	3,86	+/- 2,06
Яблочный сок
Спиромезифен	0,02	0,02 — 0,2	91,7	3,76	+/- 2,00
Спиромезифен-енол	0,02	0,02 — 0,2	93,3	4,24	+/- 2,26
Виноград
Спиромезифен	0,02	0,02 — 0,2	89,8	3,60	+/- 1,92
Спиромезифен-енол	0,02	0,02 — 0,2	87,7	3,61	+/- 1,92
Виноградный сок
Спиромезифен	0,02	0,02 — 0,2	91,3	3,49	+/- 1,86
Спиромезифен-енол	0,02	0,02 — 0,2	93,4	4,18	+/- 2,23

2. Метод измерений

Методика основана на определении веществ с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором. Контроль спиромезифена в образцах осуществляется по содержанию действующего вещества и его основного метаболита спиромезифена-енола после экстракции из анализируемых проб почвы, растительной продукции и соков смесью ацетонитрил-вода, последовательной очистки аликвоты экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, затем на концентрирующих патронах для твердофазной экстракции. Для концентрирования образцов воды используются патроны для твердофазной экстракции.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки с возможностью работы в градиентном режиме
Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности +/- 0,2 мг	ГОСТ Р 53228-08
Весы лабораторные общего назначения, с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г, класс точности высокий (II)	ГОСТ Р 53228-08
Колбы мерные вместимостью 2-50-2, 2-100-2, 2-250-2, 2-500-2, 2-1000-2	ГОСТ 1770-74
Меры массы	ГОСТ 7328-01
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10,0 см3	ГОСТ 29227-91
Пробирки градуированные с пришлифованной пробкой вместимостью 10 см3	ГОСТ 1770-74
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, 50, 100, 250, 500 и 1000 см3	ГОСТ 1770-74

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Спиромезифен, аналитический стандарт с содержанием основного компонента 99,4%
Спиромезифен-енол, аналитический стандарт с содержанием основного компонента 99,9%
Ацетонитрил для хроматографии, х.ч.	ТУ 6-09-4326-76
Вода для лабораторного анализа (деионизованная, бидистиллированная)	ГОСТ Р 52501-05
Калий углекислый (карбонат калия, поташ), х.ч., прокаленный	ГОСТ 4221-76
Кальций хлористый (хлорид кальция), х.ч., насыщенный водный раствор	ГОСТ 450-77
Кислота ортофосфорная, х.ч., 85%	ГОСТ 6552-80
Кислота уксусная, ледяная, х.ч.	ГОСТ 61-75
Натрий сернокислый (сульфат натрия) безводный, х.ч.	ГОСТ 4166-76
Натрий углекислый (карбонат натрия), х.ч.	ГОСТ 83-79
Фосфор (V) оксид (фосфорный ангидрид, пентоксид фосфора), х.ч.	ТУ 6-09-4173-85
Циклогексан, ч.д.а.	ТУ 2631-069-44493179-99
Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат), х.ч.	ГОСТ 22300-76

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные средства измерений, устройства и материалы

Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работы с концентрирующими патронами)
Аппарат для встряхивания, об/мин, орбита до 10 мм	ТУ 64-1-2851-78
Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 — 790 мм рт. ст.	ТУ 2504-1799-75
Воронка Бюхнера	ГОСТ 9147-80
Воронка делительная вместимостью 250 см3	ГОСТ 9737-93
Воронки стеклянные конусные диаметром 36 — 40 мм и 56 — 60 мм	ГОСТ 25336-82
Гигрометр с диапазоном измерений относительной влажности от 30 до 90%	ТУ 25-11-1645-84
Груша резиновая	ТУ 9398-05-0576-9082-03
Колба Бунзена	ГОСТ 25336-82
Колбы конические (плоскодонные) с пришлифованной пробкой вместимостью 250 — 300 см3	ГОСТ 23932-90
Колбы круглодонные на шлифе (для упаривания) вместимостью 50 и 250 см3	ГОСТ 9737-93
Мембраны микропористые капроновые, размер пор 0,45 мкм	ТУ 9471-002-10471723-03
Набор для фильтрации растворителей через мембрану
Насос водоструйный вакуумный	ГОСТ 25336-82
Патроны концентрирующие для твердофазной экстракции, 60 мг гидрофильно-липофильно сбалансированного обращенно-фазного сорбента, на основе сополимера N-винилпирролидона и дивинилбензола (патрон № 1)
Патроны концентрирующие для твердофазной экстракции, 360 мг гидрофобного сорбента с привитыми монофункциональными полярными группами С18 (патрон № 2)
Ректификационная колонна с числом теоретических тарелок не менее 30
Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар
Стаканы химические, вместимостью 100 и 400 см3	ГОСТ 25336-82
Стекловата
Стеклянные палочки
Сита лабораторные (набор)
Термометр с диапазоном измерений от 0 до 55 °C и ценой деления 0,1 °C	ГОСТ 28498-90
Установка для перегонки растворителей
Фильтры бумажные средней плотности	ТУ 2642-001-05015242-07
Холодильник водяной обратный	ГОСТ 9737-93
Хроматографическая колонка стальная, длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18, зернением 5 мкм
Предколонка стальная, длиной 12,5 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18, зернением 5 мкм
Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50 — 100 мм3
Шприц медицинский инъекционный однократного применения вместимостью 10 см3 ГОСТ 24861-91
(ИСО 7886-84)	Примечание. Допускается использование вспомогательных средств измерений, устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений допускают специалиста, прошедшего обучение, освоившего методику, владеющего техникой, имеющего опыт работы на жидкостном хроматографе и подтвердившего соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Измерениям предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, градуировочных растворов, растворов внесения, смеси для экстракции, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочных характеристик, подготовка концентрирующих патронов № 1 и 2.

7.1. Очистка органических растворителей

7.1.1 Ацетонитрил

7.1.2 Этилацетат

7.1.2.1 Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%

Навеску (25 +/- 0,1) г натрия углекислого помещают в мерную колбу вместимостью 500 см3, растворяют в бидистиллированной воде, доводят водой до метки, перемешивают.

7.1.2.2. Очистка растворителя. Растворитель промывают последовательно 5%-м водным раствором натрия углекислого, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30. Хранят в темноте (в емкости из темного стекла) не более месяца.

7.2. Приготовление смеси этилацетат-циклогексан, объемное соотношение 15:85

7.3. Приготовление раствора уксусной кислоты с массовой долей 1,5% (1,5%-й раствор)

В мерную колбу вместимостью 1000 см3, содержащую 500 — 600 см3 дистиллированной воды, помещают 15 см3 ледяной уксусной кислоты, доводят водой до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

7.4. Приготовление раствора ортофосфорной кислоты с массовой долей 0,1% (0,1%-й раствор)

В мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают 500 — 600 см3 бидистиллированной или деионизованной воды, вносят 1 см3 ортофосфорной кислоты, доводят водой до метки, перемешивают.

Раствор хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 7 дней.

7.5. Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают 500 см3 ацетонитрила, добавляют 500 см3 0,1%-го раствора ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют через мембранный фильтр, дегазируют.

Подвижную фазу хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более 14 дней.

7.6. Кондиционирование хроматографической колонки для ВЭЖХ

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.5) при скорости подачи растворителя 0,8 см3/мин до установления стабильной базовой линии.

7.7. Приготовление смеси растворителей для экстракции

7.8. Подготовка концентрирующих патронов № 1 и 2

Патрон устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума и промывают последовательно 5 см3 ацетонитрила, 5 см3 бидистиллированной воды, затем 10 см3 1,5%-го раствора уксусной кислоты в воде. Скорость потока растворителей через патрон не должна превышать 2 см3/мин, при этом нельзя допускать высыхания поверхности патрона. Патрон готовят непосредственно перед использованием.

7.9. Приготовление смеси растворителей для подготовки градуировочных растворов и растворения образцов

В мерную колбу вместимостью 1000 см3 помещают 500 см3 ацетонитрила, 500 см3 деионизованной воды, перемешивают. Смесь хранят в темном месте (в емкости из темного стекла) не более месяца.

7.10. Приготовление градуировочных растворов и растворов внесения

7.10.1. Исходные растворы спиромезифена и спиромезифена-енола для градуировки (концентрация 100 мкг/см3). В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 0,0100 г спиромезифена или спиромезифена-енола, добавляют 50 — 70 см3 ацетонитрила, перемешивают, доводят ацетонитрилом до метки, вновь перемешивают. Растворы хранят в холодильнике (4 — 6 °C) в течение 6 месяцев.

Растворы № 1 — 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходных растворов для градуировки.

7.10.2 Растворы № 1 спиромезифена и спиромезифена-енола для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/см3)

В мерную колбу вместимостью 100 см3 помещают 10 см3 исходного раствора спиромезифена или спиромезифена-енола с концентрацией 100 мкг/см3 (п. 7.10.1), разбавляют ацетонитрилом до метки, перемешивают. Растворы хранят в холодильнике в течение 6 месяцев.

Растворы с концентрацией 10 мкг/см3 используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения веществ методом «внесено-найдено», а также контроле качества результатов измерений методом добавок.

7.10.3. Рабочие растворы № 2 — 5 спиромезифена и спиромезифена-енола для градуировки (концентрация каждого вещества по 0,1 — 1,0 мкг/см3)

В 4 мерные колбы вместимостью 100 см3 помещают по 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 см3 градуировочных растворов № 1 с концентрацией спиромезифена и спиромезифена-енола 10 мкг/см3 (п. 7.10.2), доводят до метки смесью ацетонитрил-вода (1:1, по объему), приготовленной по п. 7.9, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией спиромезифена и спиромезифена-енола по 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/см3 соответственно.

Растворы хранят в холодильнике в течение 3 месяцев.

7.11. Установление градуировочных характеристик

Градуировочные характеристики, выражающие зависимость площади пика от концентрации спиромезифена и спиромезифена-енола в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки.

В инжектор хроматографа вводят по 50 мм3 каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.

8. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными ГОСТами: вода - ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору проб»; почва - ГОСТ 17.4.3.01-83 «Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб», ГОСТ 28168-89 «Почвы. Отбор проб»; томаты - ГОСТ 1725-85 «Томаты свежие. Технические условия», ГОСТ Р 51810-2001 «Томаты свежие, реализуемые в розничной торговой сети. Технические условия»; огурцы - ГОСТ 1726-85 «Огурцы свежие. Технические условия»; яблоки — ГОСТ 16270-70 «Яблоки свежие ранних сортов созревания. Технические условия», ГОСТ 27572-87 «Яблоки свежие для промышленной переработки»; виноград - ГОСТ 25896-83 «Виноград свежий столовый. Технические условия»; ГОСТ 26313-84 «Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб»; «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.1979).

Отобранные пробы воды хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более суток. Почву подсушивают в темноте до постоянного веса и хранят в защищенном от света месте при комнатной температуре не более месяца. Пробы растительной продукции хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 7 суток. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °C.

Перед анализом образцы воды фильтруют через неплотный бумажный фильтр, почвы — просеивают через сито с диаметром отверстий 1 мм, плодов огурцов, томатов, яблок, ягод винограда — измельчают.

9. Выполнение определения

9.1. Вода

9.2. Почва, огурцы, томаты, яблоки, ягоды винограда

9.2.1 Экстракция

9.2.2 Очистка экстракта перераспределением в системе

В делительную воронку вносят 70 см3 смеси этилацетат-циклогексан (15:85, по объему), приготовленной по п. 7.2, интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После полного разделения фаз верхний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия толщиной 1,5 см, помещенный в конусной воронке, носик которой уплотнен тампоном из стекловаты. Процедуру экстракции водной фазы смесью этилацетат-циклогексан (15:85, по объему) повторяют еще дважды порциями по 70 см3. Объединенный органический экстракт, пропущенный через безводный сульфат натрия, упаривают при температуре 35 °C на ротацитонном вакуумном испарителе досуха. Остаток в колбе растворяют в 0,5 см3 ацетонитрила, вносят 9,5 см3 1,5%-го раствора уксусной кислоты, перемешивают, подвергают последовательной очистке на концентрирующих патронах № 1 по п. 9.2.3, затем на патронах № 2 по п. 9.2.4.

9.2.3 Очистка экстракта на концентрирующем патроне № 1

Пробу, полученную по п. 9.2.2, вносят с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, на концентрирующий патрон № 1, подготовленный по п. 7.8, со скоростью пропускания раствора 2 — 3 капли в секунду. Патрон промывают 2 см3 смеси ацетонитрил-1,5% уксусная кислота (1:9, по объему), элюат отбрасывают. Высушивают патрон пропусканием воздуха (с использованием вакуума) в течение 3 мин. Вещества элюируют с патрона 3 см3 ацетонитрила, собирая элюат в круглодонную колбу для упаривания вместимостью 50 см3. Растворитель упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 35 °C досуха. Остаток растворяют в 0,5 см3 ацетонитрила, вносят 9,5 см3 1,5%-го раствора уксусной кислоты, перемешивают, подвергают очистке на концентрирующем патроне № 2 по п. 9.2.4.

9.2.4 Очистка экстракта на концентрирующем патроне № 2

9.3. Томатный, яблочный и виноградный соки

Образец сока массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 — 300 см3, добавляют 120 см3 смеси для экстракции (ацетонитрил-вода в объемном соотношении 8:2), приготовленной по п. 7.7, интенсивно встряхивают (или гомогенизируют) в течение 3 мин, затем помещают в холодильник (4 — 6 °C) на 1 ч.

Надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной фильтр средней плотности. Остаток на фильтре промывают 30 см3 смеси для экстракции (дважды по 15 см3), раствор также фильтруют на воронке Бюхнера. Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в мерный цилиндр с пришлифованной пробкой вместимостью 250 см3, доводят объем до 150 см3, перемешивают, 1/2 часть раствора, эквивалентную 10 г пробы, переносят в колбу для упаривания на 250 см3. Упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C до водного остатка (около 15 см3), очищают в системе несмешивающихся растворителей по п. 9.2.2, затем на концентрирующих патронах № 1 по п. 9.2.3 и № 2 по п. 9.2.4.

9.4. Условия хроматографирования

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах.

Жидкостный хроматограф с быстросканирующим ультрафиолетовым детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником, термостатом колонки и системой градиентного элюирования.

Рабочие длины волн: 250 и 230 нм (режим сканирования спектров поглощения в диапазоне 190 — 320 нм) <*>.

---

<*> Примечание. Сканирование поглощения веществ повышает надежность идентификации.

Хроматографическая колонка стальная, длиной 150 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми монофункциональными полярными группами С18, зернением 5 мкм.

Режим элюирования (градиентный), пробег 20 мин (табл. 3):

Таблица 3

Время, мин	Содержание растворителя в подвижной фазе, % (по объему)
	ацетонитрил	0,1% ортофосфорная кислота
0,0	50	50
8,5	50	50
8,6	85	85
16,5	85	85
16,6	50	50

Линейный диапазон детектирования 5 — 50 нг.

Для достоверности идентификации спиромезифена и спиромезифена-енола их детектирование возможно при длине волны 230 нм, поскольку в данной области интенсивность поглощения веществ ~ в 2 (спиромезифен-енол) или 3 (спиромезифен) раза выше, чем при 250 нм. Соблюдение соотношения площадей пиков при этих волнах подтверждает наличие остаточных количеств действующего вещества и его метаболита в пробе.

Образцы, дающие пики, большие, чем градуировочные растворы с концентрацией 1,0 мкг/см3, разбавляют смесью растворителей, приготовленной по п. 7.9 (не более чем в 50 раз).

10. Обработка результатов анализа

10.1 Вода

,

где А, Б — концентрации спиромезифена и спиромезифена-енола, соответственно, найденные по градуировочным графикам в соответствии с величинами площадей хроматографических пиков, мкг/см3;

V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, см3;

W — объем анализируемого образца, см3;

K — коэффициент пересчета содержания метаболита спиромезифена-енола на эквивалент спиромезифена, по соотношению молекулярных масс (равен 1,36).

10.2 Почва, огурцы, томаты, томатный сок, яблоки,

яблочный сок, виноград, виноградный сок

Содержание спиромезифена в пробах почвы, огурцов, томатов, томатного сока, яблок, яблочного сока, винограда и виноградного сока с учетом его основного метаболита спиромезифена-енола в эквиваленте действующего вещества (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

,

где А, Б — концентрации спиромезифена и спиромезифена-енола, соответственно, найденные по градуировочным графикам в соответствии с величинами площадей хроматографических пиков, мкг/см3;

C — коэффициент, учитывающий объем экстракта, взятого для анализа, C = 2;

K — коэффициент пересчета содержания метаболита спиромезифена-енола на эквивалент спиромезифена, по соотношению молекулярных масс (равен 1,36).

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

где X_{1} , X_{2} — результаты параллельных определений, мг/дм3, мг/кг;

r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8\sigma_{r} .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(\overline{X} \pm \Delta)\text{мг}/\text{дм}^{3} , мг/кг, при вероятности P = 0,95,

где \overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/дм3, мг/кг;

где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание спиромезифена и спиромезифена-енола в пробах воды — менее 0,0005 мг/дм3; почвы, огурцов, томатов, томатного сока — менее 0,05 мг/кг; яблок, яблочного сока, винограда и виноградного сока — менее 0,02 мг/кг» <*>.

---

<*> — 0,0005 мг/дм3; 0,05 мг/кг и 0,02 мг/кг — пределы обнаружения в пробах воды; почвы, огурцов, томатов, томатного сока, а также яблок, яблочного сока, винограда и виноградного сока соответственно.

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1 — 6)-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1 Контроль стабильности градуировочной характеристики

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание спиромезифена и спиромезифена-енола в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,1 до 1,0 мкг/см3.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого градуировочного раствора, используемого для контроля, сохраняется соотношение:

где X — концентрация спиромезифена и спиромезифена-енола в пробе при контрольном измерении, мкг/см3;

C — известная концентрация градуировочного раствора спиромезифена и спиромезифена-енола, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/см3;

B — норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (равен 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10% для спиромезифена или спиромезифена-енола, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов спиромезифена и спиромезифена-енола, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.11.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом добавок.

Величина добавки C_{\text{д}} должна удовлетворять условию:

где \pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/дм3, мг/кг.

Допустимо характеристику погрешности результатов анализа при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения \Delta_{\text{л}} = \pm 0,8\Delta , с последующим уточнением по мере накопления информации,

\Delta_{\text{л}} = \pm 0,8\Delta ,

,

где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Контроль проводят путем сравнения результата контрольной процедуры \text{К}_{\text{к}} с нормативом контроля К.

Результат контроля процедуры \text{К}_{\text{к}} рассчитывают по формуле:

где , , C_{\text{д}} — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/дм3, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле

\text{К} \sqrt{= \Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}} .

Проводят сопоставление результата контрольной процедуры (\text{К}_{\text{к}}) с нормативом контроля (К).

Если результат контрольной процедуры удовлетворяет условию

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предела воспроизводимости (R)

, (4)

---