МУК 4.1.3073-13. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств тебуфенпирада в воде, почве, яблоках, винограде, яблочном и виноградном соках методом капиллярной газожидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 19.07.2013)

19 июля 2013 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ТЕБУФЕНПИРАДА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, ЯБЛОКАХ, ВИНОГРАДЕ, ЯБЛОЧНОМ И ВИНОГРАДНОМ СОКАХ МЕТОДОМ КАПИЛЛЯРНОЙ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

с момента утверждения

1. Разработаны ФБУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 30 мая 2013 г. № 1).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 19 июля 2013 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации от 24.08.2012 № 0131.24.08.12

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода капиллярной газожидкостной хроматографии для определения массовых концентраций тебуфенпирада в воде в диапазоне 0,0005 — 0,005 мг/куб. дм, в почве, яблоках, винограде, яблочном и виноградном соках в диапазоне 0,01 — 0,1 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Название действующего вещества по ИСО: тебуфенпирад.

Название действующего вещества по ИЮПАК: N-(4-трет-бутилбензил)-4-хлор-3-этил-1-метилпиразол-5-карбоксамид.

Структурная формула:

                       18 24   3

Молекулярная масса: 333,8.

Белое кристаллическое вещество со слабым запахом. Температура плавления -6

64  -  66  °С.  Давление  паров 9,73 х 10   Па (при 25 °С). Растворимость в
органических  растворителях  (г/куб.  дм):  ацетон  -  819; н-гексан - 255;
ацетонитрил  -  785;  дихлорметан  >  1044;  метанол  -  818; толуол - 772.

Растворимость в воде при 25 °С (мг/куб. дм): 3,21 (pH 4); 2,39 (pH 7); 2,32

(pH  10).  Тебуфенпирад  гидролитически  стабилен  в  кислых, нейтральных и
щелочных  условиях при комнатной температуре, DT   > 28 дней (pH 5, 7 и 9).

                                            50

В почве подвержен аэробной деградации, DT > 20 — 30 дней. Коэффициент 50 распределения н-октанол — вода K log P = 4,93 (при 25 °С). ow Краткая токсикологическая характеристика Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс — 786 мг/кг; острая 50 дермальная токсичность (LD ) для крыс > 2000 мг/кг; острая ингаляционная 50 токсичность (LC ) для крыс — 3010 мг/куб. м (4 ч). 50

Область применения

Тебуфенпирад — акарицид класса пиразолов, рекомендуется для борьбы с клещами на семечковых культурах и виноградной лозе.

1. Метрологические характеристики

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 для соответствующих диапазонов концентраций.

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ

Анализируемый объект	Диапазон определяемых концентраций, мг/куб. дм (мг/кг)	Показатель точности (граница относительной погрешности), %, P = 0,95	Стандартное отклонение повторяемости, \sigma_{r} , %	Предел повторяемости, r, %	Предел воспроизводимости, R, %
1	2	3	4	5	6
Вода	от 0,0005 до 0,005 вкл.	50	4,7	13	18
Почва	от 0,01 до 0,1 вкл.	50	3,7	10	14
Яблоки (плоды)	от 0,01 до 0,1 вкл.	50	3,6	10	14
Виноград (ягоды)	от 0,01 до 0,1 вкл.	50	3,9	11	15
Яблочный сок	от 0,01 до 0,1 вкл.	50	3,6	10	14
Виноградный сок	от 0,01 до 0,1 вкл.	50	4,2	12	17

Полнота извлечения вещества, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата для всего диапазона измерений (n = 20) приведены в табл. 2.

Таблица 2

Анализируемый объект	Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20
	Предел обнаружения, мг/куб. дм (мг/кг)	Диапазон определяемых концентраций, мг/кг	Полнота извлечения вещества, %	Стандартное отклонение, %	Доверительный интервал среднего результата, +/-, %
Вода	0,0005	0,0005 — 0,005	96,23	4,63	2,47
Почва	0,01	0,01 — 0,1	86,89	3,34	1,78
Яблоки	0,01	0,01 — 0,1	87,91	3,28	1,75
Виноград	0,01	0,01 — 0,1	86,70	3,82	2,04
Яблочный сок	0,01	0,01 — 0,1	86,16	3,70	1,97
Виноградный сок	0,01	0,01 — 0,1	86,31	3,85	2,05

2. Метод измерений

Методика основана на определении тебуфенпирада с помощью капиллярной газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с электронозахватным (ЭЗД) или масс-селективным детектором (МСД) после извлечения вещества из анализируемых образцов водным ацетоном, очистки экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей и на колонке с силикагелем. Для концентрирования и очистки пробы воды использованы концентрирующие патроны для твердофазной экстракции.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Газовый хроматограф, снабженный электронозахватным детектором с пределом детектирования по Линдану 5 \cdot 10^{- 14}\text{г}/\text{с} и автоматическим пробоотборником, предназначенный для работы с капиллярной колонкой
Газовый хроматограф, снабженный масс-селективным детектором и автоматическим пробоотборником, предназначенный для работы с капиллярной колонкой
Весы аналитические с пределом взвешивания 110 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,001 г	ГОСТ Р 53228-08
Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 200 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,01 г	ГОСТ Р 53228-08
Колбы мерные вместимостью 2-100-2	ГОСТ 1770-74
Меры массы	ГОСТ OIML R 111-1-09
Микрошприц вместимостью 10 куб. мм
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 куб. см	ГОСТ 29227-91
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, 50, 100 и 250 куб. см	ГОСТ 1770-74

Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Тебуфенпирад, аналитический стандарт с содержанием основного компонента 99,7%
Азот газообразный нулевой (чистота 99,999%) в баллонах	ТУ 6-21-39-96
Ацетон, осч	ГОСТ 2603-79
Ацетонитрил для хроматографии, хч	ТУ 6-09-14-2167-84
Вода для лабораторного анализа (бидистиллированная или деионизованная)	ГОСТ Р 52501-05
н-Гексан (гексан)	ТУ 6-09-06-657-84
Гелий, вч, из баллона	ТУ 0271-001-45905715-02
Калий марганцово-кислый (перманганат калия), хч	ГОСТ 20490-75
Калий углекислый (карбонат калия, поташ), хч, прокаленный	ГОСТ 4221-76
Кальций хлористый, хч	ГОСТ 450-77
Метиловый спирт (метанол), химически чистый	ГОСТ 6995-77
Натрий серно-кислый (сульфат натрия) безводный, хч	ГОСТ 4166-76
Натрий углекислый (карбонат натрия), хч	ГОСТ 83-79
Натрий хлористый (хлорид натрия), хч	ГОСТ 4233-77
Силикагель, для колоночной хроматографии (0,200 — 0,500 мм, 40 А)
Фосфор (V) оксид (фосфорный ангидрид, пентоксид фосфора), хч	ТУ 6-09-4173-85
Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат), хч	ГОСТ 22300-76

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работы с концентрирующими патронами)
Аппарат для встряхивания	ТУ 64-1-2851-78
Баня водяная
Баня ультразвуковая с рабочей частотой 35 кГц
Бумажные фильтры средней плотности (бумажные фильтры)	ТУ 6-09-1678-76
Воронки делительные вместимостью 250 и 500 куб. см	ГОСТ 9737-93
Воронки стеклянные конусные типа В-36-80 ХС и В-56-80 ХС	ГОСТ 25336-82
Гигрометр с диапазоном измерений относительной влажности от 30 до 90%	ТУ 25-11-1645-84
Гомогенизатор
Груша резиновая	ТУ 9398-005-0576-9082-03
Колба Бунзена	ГОСТ 25336-82
Колбы конические (плоскодонные) с пришлифованной пробкой вместимостью 250 — 300 куб. см	ГОСТ 23932-90
Колбы круглодонные на шлифе (для упаривания) вместимостью 10, 50, 150, 250 и 500 куб. см	ГОСТ 9737-93
Колонка стеклянная для препаративной хроматографии длиной 25 см, внутренним диаметром 10 — 12 мм
Насос водоструйный вакуумный	ГОСТ 25336-82
Патроны концентрирующие для твердофазной экстракции, 0,4 г гидрофобного сорбента с привитыми октадецильными группами (концентрирующие патроны)	ТУ 4215-002-05451931-94
Сито с диаметром отверстий 1 мм
Стаканы химические с носиком, вместимостью 100, 200 — 250, 500 куб. см	ГОСТ 25336-82
Стекловата
Стеклянные палочки
Ректификационная колонна с числом теоретических тарелок не менее 30
Ротационный вакуумный испаритель с мембранным насосом, обеспечивающим вакуум до 10 мбар
Термометр с диапазоном измерений от 0 до 55 °С и ценой деления 0,1 °С	ГОСТ 28498-90
Установка для перегонки растворителей
Холодильник водяной обратный
Хроматографическая колонка капиллярная кварцевая длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм, содержащая сорбент: 14% цианпропилфенил-, 86% диметилполисилоксана, толщина пленки сорбента 0,5 мкм (колонка № 1)
Хроматографическая колонка капиллярная кварцевая длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, содержащая сорбент: 5% фенил-, 95% диметилполисилоксана, толщина пленки сорбента 0,25 мкм (колонка № 2)
Шприц медицинский инъекционный однократного применения вместимостью 10 куб. см ГОСТ 24861-91 (ИСО 7686-94)
	Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ Р 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07. Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.

4.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением до 15 МПа (150 кгс/кв. см), необходимо соблюдать «Правила устройства и безопасной эксплуатации стационарных компрессорных установок, воздухопроводов и газопроводов под давлением», ПБ-03-576-03. Запрещается открывать вентиль баллона, не установив на нем понижающий редуктор.

5. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений допускают специалиста, прошедшего обучение, освоившего методику, владеющего техникой, имеющего опыт работы на жидкостном хроматографе и подтвердившего соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к приборам.

7. Подготовка к выполнению измерений

7.1. Очистка органических растворителей

7.1.1 Ацетон

Ацетон перегоняют над небольшим количеством перманганата калия и прокаленным карбонатом калия или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.

7.1.2 Ацетонитрил

Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора (на 1 куб. дм ацетонитрила 20 г пентоксида фосфора) не менее 1 ч, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия (на 1 куб. дм ацетонитрила 10 г карбоната калия).

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, затем водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.4 Этилацетат

7.1.4.1. Приготовление раствора натрия углекислого с массовой долей 5%. Навеску (25 +/- 0,1) г натрия углекислого помещают в мерную колбу вместимостью 500 куб. см, растворяют в бидистиллированной воде, доводят водой до метки, перемешивают.

7.1.4.2. Очистка растворителя. Этилацетат промывают последовательно 5%-ным водным раствором натрия углекислого, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над прокаленным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 30.

7.2. Приготовление градуировочных растворов и раствора внесения

7.2.1. Исходный раствор тебуфенпирада для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,0100 г тебуфенпирада, растворяют в 50 — 60 куб. см ацетона, доводят ацетоном до метки, тщательно перемешивают.

Раствор хранят в холодильнике при температуре 4 — 6 °С в течение месяца.

Растворы № 1 — 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора для градуировки.

7.2.2. Раствор № 1 тебуфенпирада для градуировки и внесения (концентрация 10 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см исходного раствора тебуфенпирада с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.2.1), разбавляют ацетоном до метки.

Градуировочный раствор № 1 хранят в холодильнике при температуре 4 — 6 °С в течение месяца.

Этот раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения действующего вещества методом «внесено-найдено» и контроля качества результатов измерений методом «добавок».

7.2.3. Рабочие растворы № 2 — 5 тебуфенпирада для градуировки (концентрация 0,1 — 1,0 мкг/куб. см). В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0; 2,0; 5,0 и 10,0 куб. см градуировочного раствора № 1 с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.4.2), доводят до метки ацетоном, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией 0,1; 0,2; 0,5 и 1,0 мкг/куб. см соответственно.

7.3. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика от концентрации тебуфенпирада в растворе, устанавливают методом абсолютной калибровки по 4 растворам для градуировки № 2 — 5.

В инжектор хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений. Устанавливают площади пиков действующего вещества, на основании которых строят градуировочную зависимость.

7.4. Приготовление смесей гексан — этилацетат для очистки экстрактов на колонке с силикагелем

7.4.1. Смесь гексан — этилацетат (объемное соотношение 9:1). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 90 куб. см гексана и 10 куб. см этилацетата, перемешивают.

7.4.2. Смесь гексан — этилацетат (объемное соотношение 8:2). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помешают 80 куб. см гексана и 20 куб. см этилацетата, перемешивают.

7.4.3. Смесь гексан — этилацетат (объемное соотношение 6:4). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 60 куб. см гексана и 40 куб. см этилацетата, перемешивают.

7.5. Приготовление смесей ацетонитрил — вода для очистки водных образцов на концентрирующих патронах

7.5.1. Смесь ацетонитрил — вода (объемное соотношение 1:9). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10 куб. см ацетонитрила и 90 куб. см воды, перемешивают.

7.5.2. Смесь ацетонитрил — вода (объемное соотношение 2:8). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 20 куб. см ацетонитрила и 80 куб. см воды, перемешивают.

7.5.3. Смесь ацетонитрил — вода (объемное соотношение 4:6). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 40 куб. см ацетонитрила и 60 куб. см воды, перемешивают.

7.5.4. Смесь ацетонитрил — вода (объемное соотношение 6:4). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 60 куб. см ацетонитрила и 40 куб. см воды, перемешивают.

7.6. Подготовка концентрирующих патронов

Патрон устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума <*>. Сверху в патрон устанавливают медицинский шприц объемом не менее 10 куб. см, используемый в качестве емкости дня элюента.

---

<*> В отсутствие специального аллонжа жидкость продавливают через патрон с помощью шприца, скорость продавливания раствора не должна превышать 2 — 3 капли в секунду.

Концентрирующий патрон промывают последовательно 5 куб. см метанола, 10 куб. см бидистиллированной воды. Процедуру проводят с использованием вакуума, скорость потока растворителей через патрон не должна превышать 10 куб. см/мин., при этом нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

7.7. Проверка хроматографического поведения тебуфенпирада на концентрирующем патроне

В круглодонную колбу вместимостью 50 куб. см помещают 0,2 куб. см градуировочного раствора № 1 с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.2.2), растворитель упаривают досуха при температуре не выше 35 °С, остаток растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, выдерживая 1 мин. на ультразвуковой бане, добавляют 9 куб. см воды, выдерживают 30 с на ультразвуковой бане и вносят на концентрирующий патрон, подготовленный по п. 7.6. Скорость прохождения раствора через патрон не должна превышать 2 — 3 капли в секунду. Элюат отбрасывают.

Патрон промывают последовательно 10 куб. см смеси ацетонитрил — вода (1:9, по объему), 10 куб. см смеси ацетонитрил — вода (2:8, по объему) и 10 куб. см смеси ацетонитрил — вода (4:6, по объему), элюаты отбрасывают. Высушивают патрон пропусканием воздуха (с использованием вакуума) в течение 5 мин. Тебуфенпирад элюируют с патрона 15 куб. см смеси ацетонитрил — вода (6:4, по объему), собирая 3 порции элюата по 5 куб. см каждая непосредственно в круглодонные колбы вместимостью 10 куб. см. Растворы упаривают досуха при температуре не выше 40 °С. Остаток в каждой колбе растворяют в 1 куб. см ацетона и анализируют на содержание тебуфенпирада по п. 9.3. Определяют фракции, содержащие тебуфенпирад, полноту смывания с патрона и необходимый объем элюента.

Примечание. Проверку хроматографического поведения тебуфенпирада следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

7.8. Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстрактов

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 10 — 12 мм уплотняют тампоном из стекловаты, выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 4 г силикагеля в 20 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента, на который помещают слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку последовательно промывают смесью гексан — этилацетат в объемном соотношении 6:4, затем 8:2, порциями по 30 куб. см, скорость прохождения растворителя — 1 - 2 капли в секунду. Колонка готова к работе.

7.9. Проверка хроматографического поведения тебуфенпирада на колонке с силикагелем

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,5 куб. см раствора № 1 тебуфенпирада с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.4.2), упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 35 °С. Сухой остаток растворяют в 5 куб. см гексана, помещая на ультразвуковую баню на 40 — 60 с, и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.8. Колбу обмывают гексаном дважды, порциями по 3 куб. см, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку — 1 - 2 капли в секунду. Промывают колонку 20 куб. см гексана, 20 куб. см смеси гексан — этилацетат (9:1, по объему), 20 куб. см смеси гексан — этилацетат (8:2, по объему), элюаты отбрасывают.

Затем колонку промывают 100 куб. см смеси гексан — этилацетат (6:4, по объему) со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 1 куб. см ацетона и анализируют на содержание тебуфенпирада по п. 9.3.

Фракции, содержащие тебуфенпирад, объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание. Проверку хроматографического поведения тебуфенпирада следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

8. Отбор и хранение проб

Отбор проб производится в соответствии с правилами, определенными: ГОСТ Р 51592-2000 «Вода. Общие требования к отбору, проб», ГОСТ 17.4.3.01-83 «Охрана природы. Почвы. Общие требования к отбору проб», ГОСТ 28168-89 «Почвы. Отбор проб», ГОСТ 16270-70 «Яблоки свежие ранних сортов созревания. Технические условия», ГОСТ 21122-75 «Яблоки свежие поздних сортов созревания. Технические условия», ГОСТ 27572-87 «Яблоки свежие для промышленной переработки», ГОСТ 25896-83 «Виноград свежий столовый. Технические условия», ГОСТ 28472-90 «Виноград свежий ручной уборки для консервирования. Требования при заготовках и поставках», ГОСТ 26313-84 «Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб», «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (от 21.08.79 № 2051-79).

Отобранные пробы воды хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 5 суток. Почву подсушивают в темноте до постоянного веса и хранят в защищенном от света месте при комнатной температуре не более месяца. Для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °С. Перед анализом образцы воды фильтруют через неплотный бумажный фильтр, почвы просеивают через сито с диаметром отверстий 1 мм.

Пробы яблок и винограда хранят в полиэтиленовой таре в холодильнике не более 5 дней, для длительного хранения образцы замораживают и хранят при температуре -18 °С, соки анализируют в день приготовления. Перед анализом образцы плодов яблок и ягод винограда измельчают с помощью гомогенизатора.

9. Выполнение определения

9.1. Вода

Пробу отфильтрованной воды объемом 200 куб. см вносят на концентрирующий патрон, подготовленный по п. 7.6, со скоростью пропускания 2 — 3 капли в секунду, используя разряжение, создаваемое водоструйным насосом. Промывают патрон последовательно 10 куб. см смеси ацетонитрил — вода (1:9, по объему), 10 куб. см смеси ацетонитрил — вода (2:8, по объему) и 10 куб. см смеси ацетонитрил — вода (4:6, по объему), элюаты отбрасывают. Высушивают патрон пропусканием воздуха (с использованием вакуума) в течение 5 мин. Тебуфенпирад элюируют с патрона 15 куб. см смеси ацетонитрил — вода (6:4, по объему). Пробу переносят в круглодонную колбу вместимостью 50 куб. см и упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С, остаток растворяют в 1 куб. см ацетона и анализируют на содержание тебуфенпирада по п. 9.3.

9.2. Почва, яблоки, виноград, яблочный и виноградный соки

9.2.1 Экстракция

9.2.1.1. Почва. Образец почвы массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, вносят 40 куб. см воды, выдерживают 5 мин. при комнатной температуре, добавляют 60 куб. см ацетона и экстрагируют 3 мин. на ультразвуковой бане, затем помещают на аппарат для встряхивания на 1 ч.

Пробам дают отстояться, затем надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной бумажный фильтр. Экстракцию повторяют еще два раза, используя 70 и 50 куб. см смеси ацетон — вода (3:2, по объему), выдерживая каждый раз по 1 мин. на ультразвуковой бане и 30 мин. на аппарате для встряхивания. Осадок на фильтре промывают 20 куб. см той же смеси растворителей. Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в колбу для упаривания на 500 куб. см и упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °С до водного остатка (объем 90 — 100 куб. см). Далее очищают перераспределением в системе несмешивающихся растворителей по п. 9.2.2, затем на колонке с силикагелем по п. 9.2.3.

9.2.1.2. Плоды яблок, ягоды винограда. Образец измельченных проб яблок и винограда массой 20 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см, добавляют 100 куб. см смеси ацетон — вода (2:1, по объему), интенсивно встряхивают (или гомогенизируют) в течение 1 мин., затем помещают на 1 мин. на ультразвуковую баню и далее на аппарат для встряхивания на 1 ч. Пробам дают отстояться, затем надосадочную жидкость фильтруют на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной бумажный фильтр. Растительный остаток еще дважды экстрагируют 50 куб. см той же смеси, выдерживая по 1 мин. на ультразвуковой бане и 30 мин. на аппарате для встряхивания, раствор фильтруют на воронке Бюхнера. Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в колбу для упаривания на 500 куб. см и упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 35 °С до водного остатка (объем 60 — 65 куб. см), затем очищают перераспределением в системе несмешивающихся растворителей по п. 9.2.2, далее на колонке с силикагелем по п. 9.2.3.

9.2.1.3. Яблочный и виноградный соки. Пробу сока массой 20 г вносят в коническую колбу на 250 — 300 куб. см, добавляют 100 куб. см ацетона, помещают на аппарат для встряхивания на 30 мин. и выдерживают 1 ч в холодильнике (4 — 6 °С).

Выпавший осадок отфильтровывают на воронке Бюхнера с помощью разряжения, создаваемого водоструйным насосом, через двойной бумажный фильтр, фильтр с осадком дополнительно дважды промывают ацетоном порциями по 20 куб. см. Объединенный отфильтрованный экстракт переносят в колбу для упаривания на 250 куб. см, добавляют 30 куб. см воды, упаривают на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °С до водного остатка (объем 40 — 45 куб. см) и очищают перераспределением в системе несмешивающихся растворителей по п. 9.2.2, затем на колонке с силикагелем по п. 9.2.3.

9.2.2 Очистка экстрактов перераспределением в системе несмешивающихся растворителей

Водный остаток в колбе, полученный по пп. 9.2.1.1, 9.2.1.2 и 9.2.1.3, переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, колбу дополнительно обмывают деионизованной водой (20, 50 или 70 куб. см соответственно для почвы, фруктов и сока), которую также переносят в воронку, вносят 5 г хлористого натрия, перемешивают. Затем в воронку вносят 50 куб. см гексана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин., после полного разделения фаз верхний гексановый слой переносят в коническую колбу на 250 — 300 куб. см. Экстракцию тебуфенпирада повторяют еще дважды порциями гексана объемом 20 куб. см. Объединенный гексановый экстракт фильтруют через слой (около 2 см) безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в конусную воронку, круглодонную колбу для упаривания вместимостью 250 куб. см, упаривают досуха и дополнительно очищают на колонке с силикагелем по п. 9.2.3.

9.2.3 Очистка экстракта на колонке с силикагелем

Остаток, полученный по п. 9.2.2, находящийся в круглодонной колбе, растворяют в 5 куб. см гексана, помещая на ультразвуковую баню на 1 мин. Раствор наносят на колонку, подготовленную по п. 7.8. Колбу обмывают дважды гексаном порциями по 3 куб. см, которые также наносят на колонку. Скорость прохождения растворителя через колонку — 1 - 2 капли в секунду. Последовательно промывают колонку 20 куб. см гексана, 20 куб. см смеси гексан — этилацетат в объемном соотношении 9:1 и 20 куб. см смеси гексан — этилацетат (8:2, по объему), элюаты отбрасывают.

Тебуфенпирад элюируют с колонки 50 куб. см смеси гексан — этилацетат в объемном соотношении 6:4 со скоростью 1 — 2 капли в секунду, собирая элюат в круглодонную колбу вместимостью 150 куб. см, раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °С, остаток растворяют в 1 куб. см ацетона и анализируют на содержание тебуфенпирада по п. 9.3.

9.3. Условия хроматографирования

9.3.1 Газовый хроматограф, снабженный электронозахватным детектором

Колонка капиллярная № 1 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,32 мм, толщина пленки сорбента 0,5 мкм.

Температура: детектора 300 °С;

испарителя 280 °С.

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура 60 °С, выдержка 1 мин., нагрев колонки со скоростью 40 град./мин. до температуры 100 °С, выдержка 0,5 мин., нагрев колонки со скоростью 10 град./мин. до температуры 250 °С, выдержка 7 мин., нагрев колонки со скоростью 40 град./мин. до температуры 280 °С.

Газ 1 (азот): давление 67 кПа, скорость 35,707 см/с, поток 2,094 куб. см/мин.

Газ 2 (азот): деление потока 1:2,9; сброс 6,1 куб. см/мин.

Хроматографируемый объем: 1 куб. мм.

Линейный диапазон детектирования: 0,1 — 1,0 нг.

9.3.2 Хроматограф газовый с масс-селективным детектором

Колонка капиллярная № 2 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщина пленки сорбента 0,25 мкм.

Температура детектора: квадруполя 150 °С, источника 230 °С, переходной камеры 280 °С.

Температура испарителя: 250 °С.

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура 100 °С, выдержка 1 мин., нагрев колонки со скоростью 10 град./мин. до температуры 250 °С, выдержка 7 мин., нагрев колонки со скоростью 30 град./мин. до температуры 280 °С, выдержка 6 мин.

Газ 1 (гелий): поток в колонке 1,3 куб. см/мин.

m/z 318 — количественный анализ;

m/z 171;

m/z 276.

Линейный диапазон детектирования: 0,1 — 1,0 нг.

Пробу вводят в испаритель хроматографа не менее двух раз. Устанавливают площади пиков вещества, находят среднее значение, с помощью градуировочной характеристики определяют концентрацию тебуфенпирада в хроматографируемом растворе.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор с концентрацией 1,0 мкг/куб. см, разбавляют ацетоном не более чем в 50 раз.

10. Обработка результатов анализа

                                C · V

X = -----, m

где:

C — концентрация тебуфенпирада, найденная по градуировочной характеристике в соответствии с величиной площади хроматографического пика, мкг/куб. см;

V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предел повторяемости:

                         2 · |X  - X | · 100
                               1    2
                         ------------------- <= r,                      (1)
                              (X  + X )
                                1    2

где:

    X , X  - результаты параллельных определений, мг/кг, мг/куб. дм;
     1   2

r — значение предела повторяемости (табл. 1), при этом r = 2,8\sigma_{r} .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

Примечание. Идентификация и расчет концентрации вещества в пробах могут быть проведены с помощью компьютерной программы обработки хроматографических данных, включенной в аналитическую систему.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(\overline{X} \pm \Delta),\text{мг}/\text{кг},\text{мг}/\text{дм}^{3},\text{при вероятности }P = 0,95,

где:

\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений признанных приемлемыми, мг/кг, мг/куб. дм;

\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} ,

где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде:

«содержание тебуфенпирада в пробе воды менее 0,0005 мг/куб. дм, пробах почвы, яблок, винограда и соков — менее 0,01 мг/кг» <*>.

---

<*> 0,0005 мг/куб. дм, 0,01 мг/кг — пределы обнаружения в воде и указанных средах соответственно.

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1-6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1 Контроль стабильности градуировочной характеристики.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят в начале и по окончании каждой серии анализов.

При контроле стабильности градуировочной характеристики проводят измерения не менее трех образцов концентраций для градуировки, содержание тебуфенпирада в которых должно охватывать весь диапазон концентраций от 0,1 до 1,0 мкг/куб. см.

Градуировочная характеристика считается стабильной, если для каждого из используемого для контроля градуировочного раствора сохраняется соотношение:

                          |X - C| · 100

A = ------------- <= B, C

где:

X — концентрация тебуфенпирада в пробе при контрольном измерении, мкг/куб. см;

C — известная концентрация градуировочного раствора тебуфенпирада, взятая для контроля стабильности градуировочной характеристики, мкг/куб. см;

B — норматив контроля погрешности градуировочной характеристики, % (B = 10% при P = 0,95).

Если величина расхождения (A) превышает 10%, делают вывод о невозможности применения градуировочной характеристики для дальнейших измерений. В этом случае выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики и повторяют контроль ее стабильности с использованием других градуировочных растворов тебуфенпирада, предусмотренных МВИ. При повторном обнаружении нестабильности градуировочной характеристики устанавливают ее заново согласно п. 7.3.

Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится методом «добавок».

Величина добавки C должна удовлетворять условию: д

C_{\text{д}} \geq \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X\prime},

где \pm \Delta_{\text{л},X} ( \pm \Delta_{\text{л},X\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг, мг/куб. дм,

при этом:

\Delta_{\text{л}} = \pm (0,84 \cdot \Delta),

\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} ,

где \delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

Результат контроля процедуры K рассчитывают по формуле: к

                                  _    _
                             K  = X' - X - C ,
                              к             д

         _    _
    где  X',  X,  C   -  среднее  арифметическое  результатов  параллельных

               д

определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг, мг/куб. дм.

Норматив оперативного контроля точности K рассчитывают по формуле:

K = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}} .

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (K ) с нормативом к контроля (K).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию:

|K | <= K, (2) к

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (2) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (2) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

13.3. Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости.

Расхождение между результатами измерений, выполненных в условиях воспроизводимости (разное время, разные операторы, разные лаборатории), не должно превышать предел воспроизводимости (R):

                         2 · |X  - X | · 100
                               1    2
                         ------------------- <= R,                      (3)
                              (X  + X )
                                1    2

где:

    X , X  - результаты измерений, выполненных в условиях воспроизводимости
     1   2

(разное время, разные операторы, разные лаборатории), мг/кг, мг/куб. дм; R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций, табл. 1), %.

---