МУК 4.1.2881-11. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение изолята соевого белка в составе мясных продуктов. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 27.06.2011)
Примечание
Документ введен в действие с 27 июня 2011 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
27 июня 2011 года
4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИЗОЛЯТА СОЕВОГО БЕЛКА В СОСТАВЕ МЯСНЫХ ПРОДУКТОВ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.2881-11
с момента утверждения
1. Разработаны НИИ питания РАМН; ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии; ООО «Стайлаб».
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 02.06.2011 № 1).
3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 27 июня 2011 г.
4. Введены в действие с момента утверждения.
1. Область применения
1.1. Настоящие методические указания устанавливают методы определения содержания изолята белков сои (ИБС) в колбасных изделиях, мясных консервах на основе твердофазного непрямого (конкурентного) иммуноферментного анализа.
1.2. Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также могут быть использованы для проведения производственного контроля другими испытательными лабораториями, аккредитованными в установленном порядке.
2. Общие положения
2.1. ИБС, который добавляют в состав мясопродуктов в качестве связывающего вспомогательного вещества, является источником растительных белков.
2.2. Для определения ИБС в составе мясопродуктов был разработан метод непрямого (конкурентного) иммуноферментного анализа (далее — ИФА).
2.3. Разработанный метод позволяет определять ИБС при минимальной его концентрации 0,2% по массе продукта.
2.4 Для целей настоящих методических указаний в документе использованы следующие сокращения:
ИФА — иммуноферментный анализ;
НЛС — нормальная лошадиная сыворотка;
3. Отбор и хранение анализируемых проб образцов
3.1. Отбор пищевых образцов для исследования осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТ 9792-73 «Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб»; ГОСТ 8756.0-70 «Продукты пищевые консервированные. Отбор проб и подготовка их к испытанию».
3.2. Отобранные образцы продуктов герметично упаковывают в полиэтиленовые мешки, стеклянные банки с притертыми крышками, маркируют и нумеруют. Образцы доставляют в лабораторию для анализа сразу же после отбора проб. В случае необходимости допускается хранить образцы при температуре (4 +/- 2) °C в течение времени, не превышающего срока годности пищевых продуктов, или замораживать при температуре -10 — -12 °C и хранить не более 2 недель.
4. Принцип метода
Разработанный метод основан на конкуренции предварительно иммобилизованных на твердой поверхности (лунке полистирольной планшеты) антигенов и таких же антигенов, находящихся в растворе образца, за центры связывания специфичных к этим антигенам антител, вносимых в тот же раствор. В результате конкуренции количество антител, фиксируемых на твердой поверхности, оказывается в обратной зависимости по отношению к содержанию антигенов в растворе образца. После удаления раствора антител, связанных с определяемыми антигенами, добавляют раствор вторичных антивидовых антител, конъюгированных с пероксидазой. Вторичные антитела, оставшиеся в растворе, т.е. непрореагировавшие с антителами к соевому белку, удаляют. Затем добавляют в систему раствор хромогенного субстрата. Пероксидаза, конъюгированная со вторичными антителами, расщепляет хромогенный субстрат с образованием окрашенного продукта. При этом концентрация определяемого антигена, содержащегося в исследуемом образце, обратно пропорциональна концентрации продукта, образовавшегося в результате ферментативной реакции и регистрируемой оптической плотности раствора при длине волны, соответствующей максимуму поглощения продукта.
5. Средства измерений, материалы, реактивы
Фотометр иммуноферментный планшетный «ЭФОС 9305» (производства «ОАО МЗ Сапфир», Россия) со светофильтром на длину волны 492 нм ТУ 9443-001-23348869-95
Плита нагревательная «ES-H3040»
Блендер или лабораторный гомогенизатор типа Waring 800S
Диспергатор типа ULTRA-TURRAX T 18 basic или с аналогичными характеристиками
Лиофильная сушка типа Martin Christ Alpha или с аналогичными характеристиками
Анализатор потенциометрический ГОСТ 19881-74
Центрифуга лабораторная ОПН-8 с регулируемой скоростью вращения до 8000 об./мин.
Суховоздушный термостат ТСМ-80М
Аппарат лабораторный для встряхивания ТУ 64-1-2451-78
Весы аналитические лабораторные электронные с верхним пределом взвешивания 120 г 2-го класса точности +/- 0,1 мг ГОСТ 24104-88
Весы лабораторные +/- 0,1 г ГОСТ 24104-2001
Дозатор пипеточный автоматический с переменным объемом 0 — 0,02 куб. см одноканальный ТУ 64-1-2828-81
Дозатор пипеточный автоматический с переменным объемом 0,02 — 0,2 куб. см одноканальный
Дозаторы пипеточные автоматические с переменным объемом 0,2 — 1 куб. см одноканальный
Дозатор пипеточный автоматический с переменным объемом 0,05 — 0,2 куб. см восьмиканальный
Наконечники для автоматических пипеток объемом до 0,3 и до 5,0 куб. см однократного применения
Колбы конические со шлифом № 14 или 29 с притертой стеклянной пробкой вместимостью 50 куб. см ГОСТ 25336-82
Планшеты для иммуноферментного анализа однократного применения (полистирольные плоскодонные немодифицированные) ТУ 64-2-375-86
Лабораторная химическая посуда (пробирки, мерные цилиндры, мерные колбы, стаканы, флаконы) общего назначения ГОСТ 1770-74
Холодильник бытовой с морозильной камерой с температурой заморозки до -20 °C
Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72
Натрий хлористый, х.ч. <*> ГОСТ 4233-77
Азид натрия (имп.), х.ч. <*> Типа Твин-20, «Serva» (Германия) или с аналогичными характеристиками
Калий фосфорнокислый 1-замещенный, ч.д.а. <*> ГОСТ 4198-75
Калий фосфорнокислый 2-замещенный 3-водный, ч.д.а. <*> ГОСТ 2493-75
Натрий двууглекислый, х.ч. <*> ГОСТ 4201-79
Натрия гидроксид, х.ч. <*> ГОСТ 4328-77
Натрий фосфорнокислый 2-замещенный 12-водный, ч.д.а. <*> ГОСТ 4172-76
О-Фенилендиамин, ч. <*> ТУ 6-09-05-1291-84
Кислота серная, ос.ч. <*> ГОСТ 4204-77
Желатин марки П-11 ГОСТ 11293-89
Антитела диагностические против IgG (H+L) кролика, меченные пероксидазой, сухие (антивидовый конъюгат) (рабочее разведение указано производителем на каждой партии препарата), подобные «Медгамал» НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН или с аналогичными характеристиками
Кислота лимонная моногидрат, ч.д.а. <*> ГОСТ 3652-69
Антитела к соевому белку концентрированные, подобные «RIDA Antiserum Raninchen/rabbit gegen Soja protein/Glicinin to soyabean protein» art/N: R45254 (Германия) или с аналогичными характеристиками
Сыворотка нормальная лошадиная Рег. № 92/03-300200000
Экстрагент, подобный «RIDA Extraction Solution» (Германия) или с аналогичными характеристиками
Экстрагирующий буфер, подобный «RIDAS-CREEN Allergen extraction buffer» (Германия) или с аналогичными характеристиками
Перекись водорода «медицинская» 33% ТУ 6-02-570-75
Изолят белков сои «Sypro Hamburg» (Германия), содержание белка (83,4 +/- 0,3)%
<*> Допускается применение других средств измерений, оборудования и реактивов с аналогичными техническими, метрологическими и качественными характеристиками.
6. Требования техники безопасности при проведении испытаний
При подготовке и проведении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76.
Помещение, в котором проводятся измерения, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Работу необходимо проводить, соблюдая правила личной гигиены и противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004-91, и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.
При работе с электроприборами необходимо соблюдать требования безопасности по ГОСТ 12.1.019-79.
Все применяемые реактивы, за исключением о-фенилендиамина, в используемых концентрациях не токсичны. о-Фенилендиамин обладает канцерогенным действием. Поэтому в случае попадания вещества на кожные или слизистые покровы следует немедленно тщательно смыть его большим количеством воды. Стоп-реагент содержит в своем составе серную кислоту. Следует избегать контакта стоп-реагента с кожей.
Необходимо провести обучение работающих безопасности труда согласно ГОСТ 12.04.004.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению работы допускается обученный персонал со средним специальным или высшим образованием, прошедший в установленном порядке инструктаж, имеющий навыки практической работы в области химического и биохимического анализа и освоивший метод анализа.
8. Условия измерений
Измерения осуществляют в оборудованной для химического анализа лаборатории в условиях параметров окружающей среды, обозначенных в инструкциях по эксплуатации применяемого оборудования. Температура воздуха (20 +/- 5) °C, атмосферное давление 84 — 106 кПа, относительная влажность воздуха не более 80%.
9. Определение ИБС в колбасных изделиях
9.1. Подготовка проб
Отбор образцов для анализа ведется в соответствии с п. 3 данного документа. Образцы, предназначенные для анализа, должны храниться в холодильнике без доступа света.
9.1.1 Подготовка реагентов для анализа
При исследовании образцов мясопродуктов для пробоподготовки необходимо приготовить следующие реагенты:
-
фосфатно-солевой буфер (PBS). Навеску (68,0 +/- 0,2) г калия фосфорнокислого 1-замещенного, взятую на лабораторных весах, переносят в мерную колбу на 500 куб. см, растворяют и доводят дистиллированной водой до метки. Навеску (228 +/- 0,2) г калия фосфорнокислого 2-замещенного 3-водного, взятую на лабораторных весах, переносят в мерную колбу на 1000 куб. см, растворяют и доводят дистиллированной водой до метки. Полученные растворы смешивают под контролем потенциометрического анализатора до достижения величины pH = 7,6 +/- 0,05. Навеску (180 +/-0,2) г натрия хлористого переносят в мерную колбу на 1000 куб. см, растворяют и доводят дистиллированной водой до метки. В мерную колбу на 2000 куб. см вносят мерным цилиндром 20 куб. см смеси растворов фосфатов и 100 куб. см раствора натрия хлористого и доводят дистиллированной водой до метки;
-
раствор экстрагирующего буфера, подобный «RIDASCREEN Allergen extraction buffer» (далее — ЭБ-2), или с аналогичными характеристиками, готовят непосредственно перед его использованием. ЭБ-2 разводят в дистиллированной воде в 20 раз (1:19), например, смешав 2,5 куб. см экстрагирующего буфера и 47,5 куб. см дистиллированной воды.
9.1.2 Приготовление проб
Пробу мясопродукта (анализируемый образец) измельчают с использованием лабораторного гомогенизатора. Далее (12,0 +/- 0,1) г гомогенизированной пробы помещают в стакан диспергатора, вносят 48 куб. см PBS и проводят размельчение образца мясопродукта до однородной массы при 24000 об./мин.
Внимание! Каждую пробу анализируют в трех параллелях, т.е. готовят три экстракта анализируемого образца.
Для получения трех экстрактов анализируемого образца берут три аликвоты по 0,25 куб. см диспергата, переносят их в три конические колбы и взвешивают на аналитических весах.
Внимание! Массу каждой аликвоты 0,25 куб. см (g) учитывают в дальнейших расчетах п. 9.6.3.1. Вносят в каждую колбу по 2,5 куб. см экстрагента, подобного «RIDA Extraction Solution» (далее — ЭБ-1). Колбы закрывают крышками и помещают на нагревательную плиту при 60 °C на 90 мин. (периодически встряхивая вручную). Затем в колбы вносят по 7,5 куб. см предварительно нагретого до 60 °C ЭБ-2 и проводят инкубацию в течение 90 мин. на нагревательной плите при 60 °C (периодически встряхивая вручную).
Далее охлаждают полученные экстракты до комнатной температуры. Экстракты готовы к проведению ИФА. Полученные экстракты допускается оставлять на 16 ч при 4 °C в холодильнике или в течение 2 недель при -20 °C. Размораживают на воздухе при комнатной температуре.
9.2. Подготовка стандартов ИБС
В качестве стандарта используют аттестованный образец ИБС с содержанием белка (83,4 +/- 0,3)%, типа выпускаемой компанией «Sypro Hamburg» или с аналогичными характеристиками. Навеску ИБС (50,0 +/- 0,1) мг растворяют в 2,5 куб. см ЭБ-1 на нагревательной плите в конической колбе при закрытой крышке при 60 °C в течение 90 мин. Затем в колбу вносят 7,5 куб. см предварительно нагретого до 60 °C ЭБ-2 и проводя инкубацию в течение 90 мин. на нагревательной плите при 60 °C.
Затем полученный раствор охлаждают до комнатной температуры и объем доводят до 100 куб. см 0,5%-м водным раствором нормальной лошадиной сыворотки (НЛС). Полученный стандарт разливают по 2,0 куб. см в стеклянные флаконы (вместимостью 6 — 12 куб. см) и после предварительного замораживания при температуре не выше -25 °C лиофильно высушивают. Условия лиофилизации являются стандартными для водных растворов белков и прописаны в инструкции по эксплуатации сушки.
9.3. Подготовка полистирольной планшеты — сенсибилизация планшеты (иммобилизация антигена, белка сои, на поверхности лунок планшета)
9.3.1 Подготовка антигена
Навеску (1,0 +/- 0,05) г ИБС переносят в стеклянный флакон (вместимостью 15 — 30 куб. см) и добавляют 10,0 куб. см PBS. Полученную смесь помещают на 3 ч на лабораторный встряхиватель при комнатной температуре. Затем взвесь центрифугируют в течение 15 мин. при 3000 об./мин. Отбирают супернатант.
9.3.2 Подготовка буфера для сенсибилизации планшеты
(0,1 М бикарбонатный буфер)
Навеску (4,00 +/- 0,05) г натрия гидроксида переносят в мерную колбу на 100 куб. см (навеску готовят на лабораторных весах), растворяют и доводят дистиллированной водой до метки. Навеску (8,40 +/- 0,05) г натрия двууглекислого помещают в стакан на 1000 куб. см, растворяют в 800 — 900 куб. см дистиллированной воды на магнитной мешалке. Добавляют раствор натрия гидроксида при перемешивании под контролем анализатора потенциометрического до достижения pH 9,7 +/- 0,1. Смесь количественно переносят в мерную колбу на 1000 куб. см и доводят дистиллированной водой до метки. Полученный раствор хранится при 4 °C в темноте в течение 1 месяца.
9.3.3 Сенсибилизация планшеты
Супернатант, полученный в п. 9.3.1, разводят 0,1 М бикарбонатным буфером в 100 раз (обозначается далее как сенсибилизирующий раствор), например смешав 0,15 куб. см супернатанта с 15 куб. см 0,1 М бикарбонатного буфера. В лунки планшета вносят по 0,1 куб. см сенсибилизирующего раствора, планшету закрывают крышкой и помещают на 16 ч в холодильник при 4 °C.
9.4. Подготовка реагентов для анализа
9.4.1 Подготовка фосфатного моющего буферного раствора
(0,1%-й раствор Твина-20 в PBS)
В мерную колбу на 2000 куб. см вносят 2 куб. см Твина-20 и доводят PBS до метки. Полученный буфер хранится 48 ч в холодильнике при 4 °C.
9.4.2 Подготовка раствора желатина
(1%-й раствор желатина в PBS)
Смешивают (0,20 +/- 0,01) г желатина с 20 куб. см PBS, оставляют на 16 ч в холодильнике, после чего нагревают при 37 °C на водяной бане до полного растворения.
9.4.3 Подготовка раствора нормальной
лошадиной сыворотки в PBS (НЛС-PBS)
Смешивают 100 куб. см PBS с 0,5 куб. см НЛС.
9.4.3 Подготовка растворов антител к соевому белку
Раствор антител к соевому белку готовят в разведениях 1/2000 и 1/4000 в НЛС-PBS. Антитела вносятся в предварительно отмеренный мерным цилиндром объем НЛС-PBS с использованием пипеточного дозатора переменного объема.
9.4.4 Подготовка раствора конъюгата
Раствор конъюгата готовят в разведении, указанном изготовителем на каждой партии сухого препарата, в НЛС-PBS.
9.4.5 Подготовка субстратного буфера
(0,1 М цитратный буфер)
В стакан на 1000 куб. см вносят навески (26,3 +/- 0,2) г натрия фосфорнокислого 2-замещенного 12-водного и 5,6 г лимонной кислоты моногидрата и растворяют в 800 — 900 куб. см дистиллированной воды на магнитной мешалке. Количественно переносят в мерную колбу на 1000 куб. см, доводят до метки дистиллированной водой и измеряют pH на анализаторе потенциометрическом, значение которого должно составлять 6,0 +/- 0,05.
9.4.6 Подготовка раствора субстрата
(готовят непосредственно перед употреблением)
Навеску (21,0 +/- 0,5) мг орто-фенилендиамина, взятую на аналитических весах (за 30 мин. до проведения реакции), вносят в предварительно нагретую (до 40 — 50 °C) емкость с 40 куб. см субстратного буфера и выдерживают в темноте в течение 30 мин. (в суховоздушном термостате при 37 °C). Непосредственно перед внесением в лунки планшеты в раствор субстрата добавляют 0,15 куб. см 16% перекиси водорода.
9.4.7 Подготовка стоп-реагента
(0,5 Н раствор серной кислоты)
В мерную колбу на 1000 куб. см вносят 900 — 950 куб. см дистиллированной воды и отмеряют цилиндром 28 куб. см серной кислоты. Раствор перемешивают, охлаждают до комнатной температуры и доводят дистиллированной водой до метки.
9.5. Процедура анализа
9.5.1. Готовят стандартный раствор ИБС путем количественного перенесения лиофилизованного стандарта в мерный цилиндр и доведения конечного объема до 20 куб. см НЛС-PBS. После использования остающийся раствор стандарта следует замораживать при температуре -20 °C. Данный стандарт пригоден к повторному использованию после оттаивания (допускается пятикратное замораживание-оттаивание). В замороженном состоянии может храниться в течение 2 месяцев.
9.5.2. Готовят исходные разведения исследуемых образцов путем смешивания в отдельном флаконе 0,8 куб. см НЛС-PBS и 0,2 куб. см экстракта мясопродукта.
9.5.3. Выливают сенсибилизирующий раствор из лунок, перевернув планшет, и выбивают капли жидкости, оставшиеся в лунках, путем энергичного троекратного постукивания планшета по столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполняют лунки 0,2 куб. см раствора фосфатного моющего буфера и снова удаляют раствор из лунок. Выбивают капли жидкости, как описано выше. Повторяют процедуру промывки лунок раствором фосфатного моющего буфера еще 1 раз.
9.5.4. Добавляют в каждую лунку по 0,2 куб. см раствора желатина и инкубируют 30 мин. при комнатной температуре.
9.5.5. Выливают жидкость из лунок, перевернув планшет, и выбивают капли жидкости, оставшиеся в лунках, путем энергичного троекратного постукивания планшета по столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполняют лунки 0,2 куб. см раствора фосфатного моющего буфера и снова удаляют раствор из лунок. Выбивают капли жидкости, как описано выше. Повторяют процедуру промывки лунок раствором фосфатного моющего буфера еще 2 раза.
9.5.6. Добавляют в лунки A1 — B1 планшета по 0,1 куб. см стандартного раствора ИБС (далее — Ст. ИБС). Добавляют в лунки C1 — D1 по 0,1 куб. см исходного разведения первого экстракта из анализируемого образца (П1). Добавляют в лунки E1 — F1 по 0,1 куб. см исходного разведения второго экстракта из анализируемого образца (П2). Добавляют в лунки G1 — H1 по 0,1 куб. см исходного разведения третьего экстракта из анализируемого образца (П3).
| Раститровка | 11 | 12 | ||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |||
| A | Ст. ИБС | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/32 | 1/84 | 1/128 | 1/256 | 1/512 | Б(0) | НСС |
| B | Ст. ИБС | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/32 | 1/84 | 1/128 | 1/256 | 1/512 | Б(0) | НСС |
| C | П1 | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/32 | 1/84 | 1/128 | 1/256 | 1/512 | Б(0) | НСС |
| D | П1 | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/32 | 1/84 | 1/128 | 1/256 | 1/512 | Б(0) | НСС |
| E | П2 | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/32 | 1/84 | 1/128 | 1/256 | 1/512 | Б(0) | НСС |
| F | П2 | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/32 | 1/84 | 1/128 | 1/256 | 1/512 | Б(0) | НСС |
| G | П3 | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/32 | 1/84 | 1/128 | 1/256 | 1/512 | Б(0) | НСС |
| H | П3 | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/32 | 1/84 | 1/128 | 1/256 | 1/512 | Б(0) | НСС |
- Ст. ИБС — первое разведение стандартного раствора ИБС;
- П1, П2, П3 — параллели исходных разведений экстрактов из анализируемого колбасного изделия;
- Б(0) — столбец, соответствующий нулевому связыванию конъюгата;
- НСС — неспецифическая сорбция (ряд без внесения антител).
9.5.7 Добавляют в лунки A12 — H12 по 0,1 куб. см НЛС-PBS.
9.5.8. Добавляют в лунки A2 — H11 по 0,1 куб. см кроличьей антисыворотки против соевого белка в разведении 1:4000 в НЛС-PBS.
9.5.9. Добавляют немедленно после этого в лунки A1 — H1 по 0,1 куб. см антисыворотки в разведении 1:2000 в НЛС-PBS и титруют ряды 1 — 10 в серии двоичных разведений с помощью 8-канальной пипетки с установленным объемом 0,1 куб. см.
9.5.10. Планшет инкубируют на встряхивателе 2 ч при комнатной температуре, после чего выливают жидкость из лунок, перевернув планшет, и выбивают капли жидкости, оставшиеся в лунках, путем энергичного троекратного постукивания планшета по столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполняют лунки 0,2 куб. см раствора фосфатного моющего буфера и снова удаляют раствор из лунок. Выбивают капли жидкости, как описано выше. Повторяют процедуру промывки лунок раствором фосфатного моющего буфера еще 3 раза.
9.5.11. Добавляют в каждую лунку по 0,1 куб. см раствора конъюгата. Оставляют на инкубацию в течение 90 мин. при комнатной температуре.
9.5.12. Выливают жидкость из лунок, перевернув планшет, и выбивают капли жидкости, оставшиеся в лунках, путем энергичного троекратного постукивания планшета по столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполняют лунки 0,2 куб. см раствора фосфатного моющего буфера и снова удаляют раствор из лунок. Выбивают капли жидкости, как описано выше. Повторяют процедуру промывки лунок раствором фосфатного моющего буфера еще 4 раза.
9.5.13. Добавляют в каждую лунку по 0,1 куб. см раствора субстрата. Оставить инкубировать на 20 мин. при 37 °C в воздушном термостате.
9.5.14. Добавляют в каждую лунку по 0,1 куб. см стоп-реагента. В течение не более 60 мин. после добавления стоп-реагента измеряют оптическую плотность в каждой лунке при длине волны 492 нм на планшетном фотометре.
9.6. Обработка результатов
Расчеты производятся с использованием пакета программ Microsoft Excel.
Среднее значение оптических плотностей растворов в лунках ряда A12 - H12 (НСС ) вычитается из значений всех оптических плотностей растворов в
ср
остальных лунках (с использованием либо функции автоматического вычета фона прибора «Эфос9305», либо вручную).
9.6.1. Построение калибровочной кривой стандартного раствора ИБС
Рассчитывают % связывания конъюгата для каждого разведения стандартного раствора ИБС по формуле (J(n) (%)):
Б (n) - Бn
0
J(n) (%) = 100 x ----------, (1) Б (n) 0
Б (n) — среднее значение (из двух параллельных измерений) оптической 0 плотности для нулевого связывания;
Бn — среднее значение (из двух параллельных измерений) оптической плотности для каждого разведения стандартного раствора ИБС.
Строят калибровочную кривую стандартного раствора ИБС в координатах: ось абсцисс - % связывания конъюгата (J (%)), ось ординат - десятичный логарифм концентрации стандартного раствора ИБС (мкг/мл) (Lg C ).
(мкг/мл)
9.6.2. Расчет концентрации стандартного раствора ИБС, соответствующей 50%-му связыванию конъюгата
9.6.2.1 По калибровочной кривой стандартного раствора ИБС методом
линейной интерполяции рассчитывают логарифм концентрации стандартного раствора ИБС, соответствующей 50%-му связыванию конъюгата (Lg (ИБС, 50%)):
Lg C - Lg C
2cm 1cm
Lg (ИБС, 50%) = Lg C + (50 - J ) x -----------------, (2)
1cm 1cm J - J
2cm 1cm
Lg C — десятичный логарифм концентрации стандартного раствора ИБС, 1cm соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается более 50% конъюгата;
Lg C — десятичный логарифм концентрации стандартного раствора ИБС, 2cm соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается менее 50% конъюгата;
J - % связывания конъюгата, соответствующий Lg C ; 1cm 1cm J - % связывания конъюгата, соответствующий Lg C . 2cm 2cm
9.6.2.2 Рассчитывают концентрацию стандартного раствора ИБС (C
ИБС 50%
(мкг/мл)), соответствующую 50%-му связыванию конъюгата, по формуле:
Lg (ИБС, 50%)
9.6.3. Расчет концентрации раствора исследуемого образца, соответствующей 50%-му связыванию конъюгата
9.6.3.1 Рассчитывают концентрацию раствора исследуемого образца,
соответствующую первому разведению (ряд 1 полистирольной планшеты), по формуле:
g
C (мкг/мл) = 1000 x ---, (4) 250
C (мкг/мл) — концентрация раствора исследуемого образца в первом разведении;
g — масса 0,25 куб. см диспергата, мг (п. 9.1.2 «Приготовление проб»).
9.6.3.2 Рассчитывают % связывания конъюгата для каждого разведения
раствора анализируемого образца по формуле (J(n) (%)):
Б (n) - Бn
0
J(n) (%) = 100 x ----------, (5) Б (n) 0
Б (n) — среднее значение (из двух параллельных измерений) оптической 0 плотности для нулевого связывания;
Б(n) — среднее значение (из двух параллельных измерений) оптической плотности для каждого разведения раствора анализируемого образца.
Далее строят кривую раститровки двоичных разведений раствора исследуемого образца в координатах: ось абсцисс — % связывания конъюгата (J
(%)), ось ординат - десятичный логарифм концентрации раствора исследуемого образца (Lg C ).
(мкг/мл)
9.6.3.3. По кривой раститровки двоичных разведений раствора исследуемого образца методом линейной интерполяции рассчитывают логарифм концентрации раствора исследуемого образца, соответствующий 50%-му
связыванию конъюгата (Lg (П, 50%)):
Lg C - Lg C
2П 1П
Lg (П, 50%) = Lg C + (50 - J ) x ---------------, (6)
1П 1П J - J
2П 1П
Lg C — десятичный логарифм концентрации раствора исследуемого 2П образца, соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается менее 50% конъюгата;
Lg C — десятичный логарифм концентрации раствора исследуемого 1П образца, соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается более 50% конъюгата;
J - % связывания метки, соответствующий Lg C ; 2П 2П J - % связывания метки, соответствующий Lg C . 1П 1П
9.6.3.4 Концентрацию раствора исследуемого образца, соответствующую
50%-му связыванию конъюгата, рассчитывают по формуле:
Lg (П, 50%)
9.6.4. Расчет содержания ИБС в анализируемом образце колбасного изделия
Рассчитывают содержание ИБС в исследуемом образце (г на 100 г колбасного изделия) по формуле:
C
ИБС 50%
ИБС (г/100 г) = 100 x --------. (8) C П 50%
9.7. Пример расчета содержания ИБС в анализируемом образце (колбасном изделии)
По калибровочной кривой стандартного раствора ИБС (содержание белка в стандарте ИБС (83,8 +/- 0,3) %) определяют концентрацию стандартного раствора ИБС и ее десятичный логарифм, соответствующие ближайшему разведению (C и Lg C ), при которых связывается более 50% конъюгата 1cm 1cm (J ):
1cm
Далее аналогичным образом определяют концентрацию стандартного раствора ИБС и ее десятичный логарифм, соответствующие ближайшему разведению (C и 2cm
Lg C ), при которых связывается менее 50% конъюгата (J ):
2cm 2cm
J = 39,2%;
2cm
По формуле (2) рассчитывают десятичный логарифм концентрации стандартного раствора ИБС, соответствующей 50%-му связыванию конъюгата (Lg (ИБС, 50%)):
(-0,107 - 0,194)
Lg (ИБС, 50%) = 0,194 + (50 — 53,5) x ---------------- = 0,121. (39,2 — 53,5)
По формуле (3) рассчитывают концентрацию стандартного раствора ИБС (C (мкг/мл)), соответствующую 50%-му связыванию конъюгата: ИБС 50%
0,121
По калибровочной кривой раститровки двоичных разведений раствора исследуемого образца определяют концентрацию раствора исследуемого образца и ее десятичный логарифм, соответствующие ближайшему разведению (C и Lg
1П
C ), при которых связывается более 50% конъюгата (J ): 1П 1П J = 51,3%;
1П
Далее аналогичным образом определяют концентрацию раствора исследуемого
образца и ее десятичный логарифм, соответствующие ближайшему разведению (C и Lg C ), при которых связывается менее 50% конъюгата (J ): 2П 2П 2П J = 39,9%;
2П
По формуле (6) рассчитывают десятичный логарифм концентрации раствора исследуемого образца, соответствующей 50%-му связыванию конъюгата (Lg (П, 50%)):
(1,837 - 2,138)
Lg (П, 50%) = 2,138 + (50 — 51,53) x --------------- = 2,103. (39,9 — 51,3)
По формуле (7) рассчитывают концентрацию раствора исследуемого образца (C (мкг/мл)), соответствующую 50%-му связыванию конъюгата: П 50%
2,103
Рассчитывают содержание ИБС в исследуемом образце (г/100 г) по формуле (8):
1,32
ИБС (г/100 г) = 100 x ------ = 1,04 г/100 г. 126,97
Для каждого из трех взятых экстрактов анализируемого образца (п. 9.1.2
"Приготовление проб") строят свою кривую раститровки двоичных разведений раствора исследуемого образца и рассчитывают содержание ИБС , как описано
(N)
выше:
Среднее значение содержания ИБС в анализируемом образце соответственно равно:
0,95 + 1,04 + 1,04
ИБС = ------------------ = 1,01 г/100 г. ср 3
10. Определение соевого белка в мясных консервах
10.1. Подготовка проб
Отбор образцов для анализа ведут в соответствии с п. 3 настоящих методических указаний. Образцы, предназначенные для анализа, должны храниться в холодильнике без доступа света.
10.1.1 Подготовка реагентов для пробоподготовки
Проводится так же, как и в п. 9.1.1 «Подготовка реагентов для пробоподготовки».
10.1.2 Приготовление проб
Пробу мясопродукта (анализируемый образец) измельчают с использованием лабораторного гомогенизатора. Далее (12,0 +/- 0,1) г гомогенизированной пробы помещают в стакан диспергатора, вносят 48 куб. см PBS и проводят размельчение образца мясопродукта до однородной массы при 24000 об./мин.
Внимание! Каждую пробу анализируют в четырех параллелях, т.е. готовят четыре экстракта анализируемого образца.
Для получения четырех экстрактов анализируемого образца берут четыре аликвоты по 0,25 куб. см диспергата, переносят их в четыре конические колбы и взвешивают на аналитических весах.
Внимание! Массу каждой аликвоты 0,25 куб. см (g) учитывают в дальнейших расчетах п. 10.6.3.1. В каждую колбу вносят по 2,5 куб. см ЭБ-1. Колбы закрывают крышками и помещают на нагревательную плиту при 60 °C на 90 мин. (периодически встряхивая). Затем в колбы вносят по 7,5 куб. см предварительно нагретого до 60 °C ЭБ-2 и проводят инкубацию в течение 90 мин. на нагревательной плите при 60 °C (периодически встряхивая).
Далее охлаждают полученные экстракты до комнатной температуры. Экстракты готовы к проведению ИФА. Допускается оставлять полученные экстракты на 16 ч при 4 °C в холодильнике или в течение 2 недель при -20 °C. Размораживают на воздухе при комнатной температуре.
10.2. Подготовка стандартных образцов
В работе используются два стандартных образца с известным содержанием ИБС.
Первый стандарт готовят, как в п. 9.2 «Подготовка стандартов ИБС».
Для приготовления второго стандартного образца (Rf-стандарта) используются мясные консервы с известным содержанием ИБС (4%). Предварительно измельченный образец консервов взвешивают и лиофильно высушивают. Далее лиофилизованный образец взвешивают, измельчают в фарфоровой ступке и рассчитывают отношение масс консервов после и до лиофилизации (K ). Навеску лиофильно высушенных консервов для экстракции
влаж
в ЭБ-1 и ЭБ-2 рассчитывают по следующей формуле:
g (г) = (12,0 +/- 0,1 г) x K . (9) Rf влаж
Навеску g диспергируют в 48,0 куб. см PBS с помощью диспергатора (24000 об./мин.). 0,25 см полученной взвеси переносят в коническую колбу и вносят 2,5 куб. см ЭБ-1. Инкубацию ведут при 60 °C 90 мин. Затем в колбу вносят 7,5 куб. см предварительно нагретого до 60 °C ЭБ-2 и проводят инкубацию в течение 90 мин. на нагревательной плите при 60 °C.
После охлаждения до комнатной температуры образец растворяют в соотношении 1:4 в 0,5%-м водном растворе НЛС, разливают по 2,0 куб. см во флаконы и лиофильно высушивают. Лиофильно высушенный образец используют в дальнейшем при проведении ИФА.
10.3. Подготовка полистирольной планшеты (сенсибилизация планшеты)
Проводится так же, как и в п. 9.3 «Подготовка полистирольной планшеты (сенсибилизация планшета)».
10.4. Подготовка реагентов для анализа
Проводится так же, как и в п. 9.2 «Подготовка реагентов для анализа».
10.5. Процедура анализа
10.5.1. Готовят раствор первого стандартного образца путем количественного перенесения лиофилизованного стандарта в мерный цилиндр и доведения конечного объема до 20 куб. см НЛС-PBS. После использования остающийся раствор стандарта следует замораживать при -20 °C. Данный стандарт пригоден к повторному использованию после оттаивания (допускается пятикратное замораживание-оттаивание). В замороженном состоянии может храниться в течение 2 месяцев.
10.5.2. Готовят раствор второго стандартного образца путем внесения во флакон с высушенным стандартом (Rf-стандартом) 2 куб. см НЛС-PBS.
10.5.3. Готовят исходные разведения исследуемых образцов путем смешивания в отдельном флаконе 0,8 куб. см НЛС-PBS и 0,2 куб. см экстракта мясопродукта.
10.5.4. Выливают сенсибилизирующий раствор из лунок, перевернув планшет, и выбивают капли жидкости, оставшиеся в лунках, путем энергичного троекратного постукивания планшета по столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполняют лунки 0,2 куб. см раствора фосфатного моющего буфера и снова удаляют раствор из лунок. Выбивают капли жидкости, как описано выше. Повторяют процедуру промывки лунок раствором фосфатного моющего буфера еще 1 раз.
10.5.5. Добавляют в каждую лунку по 0,2 куб. см раствора желатины и инкубируют 30 мин. при комнатной температуре.
10.5.6. Выливают жидкость из лунок, перевернув планшет, и выбивают капли жидкости, оставшиеся в лунках, путем энергичного троекратного постукивания планшета по столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполняют лунки 0,2 куб. см раствора фосфатного моющего буфера и снова удаляют раствор из лунок. Выбивают капли жидкости, как описано выше. Повторяют процедуру промывки лунок раствором фосфатного моющего буфера еще 2 раза.
10.5.7. Добавляют в лунки A1 — B1 планшет по 0,1 куб. см раствора первого стандартного образца. Добавляют в лунки C1 — D1 планшет по 0,1 куб. см раствора второго стандартного образца. Добавляют в лунки E1 — F1 первой планшеты по 0,1 куб. см исходного разведения первого экстракта из анализируемого образца. Добавляют в лунки G1 — H1 первой планшеты по 0,1 куб. см исходного разведения второго экстракта. Добавляют в лунки E1 — F1 второй планшеты по 0,1 куб. см исходного разведения третьего экстракта из анализируемого образца. Добавляют в лунки G1 — H1 второй планшеты по 0,1 куб. см исходного разведения четвертого экстракта.
| 1 | Раститровка планшеты 1 | 11 | 12 | |||||||||
| 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | ||||
| A | Ст. ИБС | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/32 | 1/84 | 1/128 | 1/256 | 1/512 | Б(0) | НСС |
| B | Ст. ИБС | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/32 | 1/84 | 1/128 | 1/256 | 1/512 | Б(0) | НСС |
| C | Rf-ст | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/32 | 1/84 | 1/128 | 1/256 | 1/512 | Б(0) | НСС |
| D | Rf-ст | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/32 | 1/84 | 1/128 | 1/256 | 1/512 | Б(0) | НСС |
| E | П1 | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/32 | 1/84 | 1/128 | 1/256 | 1/512 | Б(0) | НСС |
| F | П1 | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/32 | 1/84 | 1/128 | 1/256 | 1/512 | Б(0) | НСС |
| G | П2 | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/32 | 1/84 | 1/128 | 1/256 | 1/512 | Б(0) | НСС |
| H | П2 | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/32 | 1/84 | 1/128 | 1/256 | 1/512 | Б(0) | НСС |
| 1 | Раститровка планшеты 2 | 11 | 12 | |||||||||
| 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | ||||
| A | Ст. ИБС | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/32 | 1/84 | 1/128 | 1/256 | 1/512 | Б(0) | НСС |
| B | Ст. ИБС | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/32 | 1/84 | 1/128 | 1/256 | 1/512 | Б(0) | НСС |
| C | Rf-ст | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/32 | 1/84 | 1/128 | 1/256 | 1/512 | Б(0) | НСС |
| D | Rf-ст | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/32 | 1/84 | 1/128 | 1/256 | 1/512 | Б(0) | НСС |
| E | П3 | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/32 | 1/84 | 1/128 | 1/256 | 1/512 | Б(0) | НСС |
| F | П3 | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/32 | 1/84 | 1/128 | 1/256 | 1/512 | Б(0) | НСС |
| G | П4 | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/32 | 1/84 | 1/128 | 1/256 | 1/512 | Б(0) | НСС |
| H | П4 | 1/2 | 1/4 | 1/8 | 1/16 | 1/32 | 1/84 | 1/128 | 1/256 | 1/512 | Б(0) | НСС |
- Ст. ИБС — первое разведение раствора первого стандартного образца;
- Rf-ст — первое разведение раствора второго стандартного образца;
- П1, П2, П3, П4 — параллели экстрактов анализируемых мясных консервов;
- Б(0) — столбец, соответствующий нулевому связыванию;
- НСС — неспецифическая сорбция (ряд без внесения антител).
10.5.8 Далее по пунктам 9.5.7 - 9.5.14.
10.6. Обработка результатов
Расчеты производятся с использованием пакета программ Microsoft Excel.
Среднее значение оптических плотностей растворов в лунках ряда A12 - H12 (НСС ) вычитается из значений всех оптических плотностей растворов в
ср
остальных лунках (с использованием либо функции автоматического вычета фона прибора «Эфос9305», либо вручную).
10.6.1. Построение калибровочной кривой раствора первого стандартного образца
Рассчитывают % связывания конъюгата для каждого разведения раствора первого стандартного образца по формуле (J(n) (%)):
Б (n) - Бn
0
J(n) (%) = 100 x ----------, (по формуле 5) Б (n) 0
Б (n) — среднее значение (из двух параллельных измерений) оптической 0 плотности для нулевого связывания;
Б(n) — среднее значение (из двух параллельных измерений) оптической плотности для каждого разведения раствора первого стандартного образца.
Строят калибровочную кривую раствора первого стандартного образца в координатах: ось абсцисс - % связывания конъюгата (J (%)), ось ординат - десятичный логарифм концентрации раствора первого стандартного образца (мкг/мл) (Lg C ).
(мкг/мл)
10.6.2. Расчет концентрации раствора первого стандартного образца, соответствующей 50%-му связыванию конъюгата
10.6.2.1 По калибровочной кривой раствора первого стандартного образца
методом линейной интерполяции рассчитывают логарифм концентрации раствора первого стандартного образца, соответствующей 50%-му связыванию конъюгата
(Lg (ИБС, 50%)):
Lg C - Lg C
2cm 1cm
Lg (ИБС, 50%) = Lg C + (50 - J ) x -----------------, (10)
1cm 1cm J - J
2cm 1cm
Lg C — десятичный логарифм концентрации раствора первого 1cm стандартного образца, соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается более 50% конъюгата;
Lg C — десятичный логарифм концентрации раствора первого 2cm стандартного образца, соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается менее 50% конъюгата;
J - % связывания конъюгата, соответствующий Lg 1 ; 1cm cm J - % связывания конъюгата, соответствующий Lg 2 . 2cm cm
10.6.2.2 Рассчитывают концентрацию раствора первого стандартного
образца (C (мкг/мл)), соответствующую 50%-му связыванию конъюгата, ИБС 50% по формуле:
Lg (ИБС, 50%)
10.6.3. Расчет концентрации раствора второго стандартного образца, соответствующей 50%-му связыванию конъюгата
10.6.3.1 Рассчитывают концентрацию раствора второго стандартного
образца, соответствующую первому разведению (ряд 1 полистирольной планшеты), по формуле:
g
Rf
C (мкг/мл) = 1000 x ---, (12) Rf 250
C (мкг/мл) — концентрация раствора второго стандартного образца в Rf первом разведении;
g — масса 0,25 куб. см диспергата, мг (п. 10.2 «Подготовка Rf стандартных образцов»).
10.6.3.2 Рассчитывают % связывания конъюгата для каждого разведения
раствора второго стандартного образца по формуле (J (n) (%)): Rf
Б (n) - Бn
0
J (n) (%) = 100 x ----------, (13) Rf Б (n)
0
Б (n) — среднее значение (из двух параллельных измерений) оптической 0 плотности для нулевого связывания;
Б(n) — среднее значение (из двух параллельных измерений) оптической плотности для каждого разведения раствора второго стандартного образца.
Далее строят калибровочную кривую раствора второго стандартного образца
в координатах: ось абсцисс - % связывания конъюгата (J (%)), ось ординат - десятичный логарифм концентрации раствора второго стандартного образца (Lg C ).
Rf(мкг/мл)
10.6.3.3 По калибровочной кривой раствора второго стандартного образца
методом линейной интерполяции рассчитывают логарифм концентрации раствора второго стандартного образца, соответствующий 50%-му связыванию конъюгата
(Lg (Rf, 50%)):
Lg C - Lg C
2Rf 1Rf
Lg (Rf, 50%) = Lg C + (50 - J ) x -----------------, (14)
1Rf 1Rf J - J
2Rf 1Rf
Lg C — десятичный логарифм концентрации раствора второго 2Rf стандартного образца, соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается менее 50% конъюгата;
Lg C — десятичный логарифм концентрации раствора второго 1Rf стандартного образца, соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается более 50% конъюгата;
J - % связывания метки, соответствующий Lg C ; 2Rf 2Rf J - % связывания метки, соответствующий Lg C . 1Rf 1Rf
10.6.4. Расчет коэффициента открытия ИБС в мясных консервах
10.6.4.1 Рассчитывают концентрацию раствора второго стандартного
образца (Rf-стандарта), соответствующую 50%-му связыванию конъюгата, по формуле:
Lg (Rf, 50%)
10.6.4.2 Рассчитывают содержание ИБС в Rf-стандарте в % по формуле
(это кажущееся содержание ИБС по калибровочной кривой раствора первого стандартного образца содержание):
C
ИБС 50%
% ИБС = 100 x --------. (16) C Rf 50%
10.6.4.3 Рассчитывают коэффициент открытия ИБС в мясных консервах по
формуле:
% ИБС
K = -----. (17) откр.ИБС 4
10.6.5. Расчет концентрации раствора исследуемого образца, соответствующей 50%-му связыванию конъюгата
10.6.5.1 Рассчитывают концентрацию раствора исследуемого образца,
соответствующую первому разведению (ряд 1 полистирольной планшеты), по формуле:
g
C (мкг/мл) = 1000 x ---, (18) 250
C (мкг/мл) — концентрация раствора исследуемого образца в первом разведении;
g — масса 0,25 куб. см диспергата, мг (п. 10.1.2 «Приготовление проб»).
10.6.5.2 Рассчитывают % связывания конъюгата для каждого разведения
раствора анализируемого образца по формуле (J(n) (%)):
Б (n) - Бn
0
J(n) (%) = 100 x ----------, (19) Б (n) 0
Б (n) — среднее значение (из двух параллельных измерений) оптической 0 плотности для нулевого связывания;
Б(n) — среднее значение (из двух параллельных измерений) оптической плотности для каждого разведения раствора анализируемого образца.
Далее строят кривую раститровки двоичных разведений раствора исследуемого образца в координатах: ось абсцисс — % связывания конъюгата (J
(%)), ось ординат - десятичный логарифм концентрации раствора исследуемого образца (Lg C ).
(мкг/мл)
10.6.5.3. По кривой раститровки двоичных разведений раствора исследуемого образца методом линейной интерполяции рассчитывают логарифм концентрации раствора исследуемого образца, соответствующий 50%-му
связыванию конъюгата (Lg (П, 50%)):
Lg C - Lg C
2П 1П
Lg (П, 50%) = Lg C + (50 - J ) x ---------------, (20)
1П 1П J - J
2П 1П
Lg C — десятичный логарифм концентрации раствора исследуемого 2П образца, соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается менее 50% конъюгата;
Lg C — десятичный логарифм концентрации раствора исследуемого 1П образца, соответствующей ближайшему разведению, при котором связывается более 50% конъюгата;
J - % связывания метки, соответствующий Lg C ; 2П 2П J - % связывания метки, соответствующий Lg C . 1П 1П
10.6.5.4 Концентрацию раствора исследуемого образца, соответствующую
50%-му связыванию конъюгата, рассчитывают по формуле:
Lg (П, 50%)
10.6.6. Расчет содержания ИБС в анализируемом образце мясных консервов
Рассчитывают содержание ИБС в исследуемом образце (в г на 100 г мясных консервов) по формуле:
ИБС = 100 x C / C / K . (22) ИБС 50% П 50% откр.ИБС
10.7. Пример расчета содержания ИБС в анализируемом образце (мясных консервах)
По калибровочной кривой раствора первого стандартного образца определяют концентрацию раствора ИБС и ее десятичный логарифм, соответствующие ближайшему разведению (C и Lg C ), при которых 1cm 1cm связывается более 50% конъюгата (J ):
1cm
Далее аналогичным образом определяют концентрацию раствора первого стандартного образца и ее десятичный логарифм, соответствующие ближайшему разведению (C и Lg C ), при которых связывается менее 50% конъюгата 2cm 2cm (J ):
2cm
По формуле (10) рассчитывают десятичный логарифм концентрации раствора первого стандартного образца, соответствующей 50%-му связыванию конъюгата (Lg (ИБС, 50%)):
(0,189 - 0,490)
Lg (ИБС, 50%) = 0,490 + (50 — 61,6) x --------------- = 0,223. (48,6 — 61,6)
По формуле (11) рассчитывают концентрацию раствора первого стандартного образца (C (мкг/мл)), соответствующую 50%-му связыванию конъюгата: ИБС 50%
0,223
По калибровочной кривой раствора второго стандартного образца определяют концентрацию раствора Rf-стандарта и ее десятичный логарифм, соответствующие ближайшему разведению (C и Lg C ), при которых 1Rf 1Rf связывается более 50% конъюгата (J ):
1Rf
Далее аналогичным образом определяют концентрацию раствора первого стандартного образца и ее десятичный логарифм, соответствующие ближайшему разведению (C и Lg C ), при которых связывается менее 50% конъюгата 2Rf 2Rf (J ):
2Rf
По формуле (14) рассчитывают десятичный логарифм концентрации раствора второго стандартного образца, соответствующей 50%-му связыванию конъюгата (Lg (Rf, 50%)):
(1,563 - 1,864)
Lg (Rf, 50%) = 1,864 + (50 — 51,8) x --------------- = 1,831. (34,8 — 51,8)
По формуле (15) рассчитывают концентрацию раствора второго стандартного образца (C (мкг/мл)), соответствующую 50%-му связыванию конъюгата: Rf 50%
1,831
По формуле (16) рассчитывают содержание ИБС в Rf-стандарте в % (это кажущееся содержание ИБС по калибровочной кривой раствора первого стандартного образца):
1,67
ИБС = 100 x ----- = 2,46 г/100 г. Rf 67,82
По формуле (17) рассчитывают коэффициент открытия ИБС в мясных консервах:
2,46
K = ---- = 0,615. откр.ИБС 4 По калибровочной кривой раститровки двоичных разведений раствора исследуемого образца определяют концентрацию раствора исследуемого образца и ее десятичный логарифм, соответствующие ближайшему разведению (C и
1П
Lg C ), при которых связывается более 50% конъюгата (J ):
1П 1П
J = 57,4%;
1П
Далее аналогичным образом определяют концентрацию раствора исследуемого образца и ее десятичный логарифм, соответствующие ближайшему разведению (C и Lg C ), при которых связывается менее 50% конъюгата 2П 2П (J ):
2П
По формуле (20) рассчитывают десятичный логарифм концентрации раствора исследуемого образца, соответствующей 50%-му связыванию конъюгата, (Lg (П, 50%)):
(2,165 - 2,466)
Lg (П, 50%) = 2,466 + (50 — 57,4) x --------------- = 2,270. (46,1 — 57,4)
По формуле (21) рассчитывают концентрацию раствора исследуемого образца (C (мкг/мл)), соответствующую 50%-му связыванию конъюгата: П 50%
2,270
Рассчитывают содержание ИБС в исследуемом образце (в г/100 г) по формуле (22):
ИБС = 100 x 1,67 / 186,1 / 0,615 = 1,46 г/100 г.
Для каждого из четырех взятых экстрактов анализируемого образца (п. 10.1.2 «Приготовление проб») строят свою кривую раститровки двоичных разведений раствора исследуемого образца и рассчитывают содержание ИБС , (N) как описано выше:
Среднее значение содержания ИБС в анализируемом образце соответственно равно:
ИБС = (1,46 + 1,49 + 1,52 + 1,54) / 4 = 1,50 г/100 г. ср
11. Оценка приемлемости результатов параллельных определений
11.1 Проверяют приемлемость полученных результатов параллельных
определений. Расхождение между минимальным и максимальным из полученных N (N = 3 для колбасных изделий, N = 4 для мясных консервов) результатов параллельных определений анализируемой пробы не должно превышать предела
повторяемости r , приведенного в табл. 1 для колбасных изделий и табл. 2 m для мясных консервов.
Результаты считают приемлемыми при выполнении условия:
(x - x ) <= r , (23) max min m где x , x - максимальное и минимальное значения n результатов max min
параллельных определений соответственно, г/100 г.
Если выполняется условие приемлемости (23), за результат измерений принимают среднее арифметическое n параллельных определений.
11.2 Если условие (23) не выполняется, получают еще n результатов
параллельных определений анализа. За результат измерений принимают среднее арифметическое значение результатов 2n определений, если выполняется
условие:
(x - x ) <= CR (2n); (24) max min 0,95 CR (2n) = f(2n) сигма , (25) 0,95 r
x , x - максимальное и минимальное значения из полученных 2n max min
результатов параллельных определений ИБС, г/100 г;
CR — значение критического диапазона для уровня вероятности 0,95 P = 0,95;
f(n) — коэффициент критического диапазона (f(6) для колбасных изделий = 4,0; f(8) для мясных консервов = 4,3).
Если условие (24) не выполняется, выполнение анализов прекращают, выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.
12. Оформление результатов измерений
Результат количественного определения ИБС в мясных продуктах методом конкурентного ИФА представляют в виде:
(X +/- ДЕЛЬТА), г/100 г ИБС в мясном продукте, при доверительной вероятности P = 0,95, где X - результат измерений, полученный в соответствии с настоящей методикой; ДЕЛЬТА - абсолютная погрешность
измерений, г/100 г при доверительной вероятности P = 0,95.
Результаты анализа оформляют протоколом.
13. Контроль качества результатов измерений
13.1. Контроль промежуточной (внутрилабораторной) прецизионности
При контроле промежуточной (внутрилабораторной) прецизионности абсолютное значение разности двух результатов анализа |X - X | одной и той 1 2 же пробы, полученных в условиях промежуточной (внутрилабораторной) прецизионности, не должно превышать предела промежуточной (внутрилабораторной) прецизионности R , т.е. с доверительной вероятностью
m
P = 0,95 должно выполняться условие:
|X - X | <= R . (26) 1 2 m
Значения R приведены в табл. 3 для колбасных изделий и табл. 4 для m мясных консервов.
ОСНОВНЫЕ МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ МЕТОДИКИ
КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИБС МЕТОДОМ НЕПРЯМОГО ИФА
В КОЛБАСНЫХ ИЗДЕЛИЯХ
| Метрологическая характеристика (p = 0,95) | Диапазон концентраций ИБС, г/100 г | |
| 0,2 — 1,0 | 1,0 — 10 | |
| Предел повторяемости (r ), г/100 г m | 0,1 | 0,6 |
| Предел воспроизводимости (R ), г/100 г m | 0,2 | 0,9 |
| Предел точности (ДЕЛЬТА), г/100 г | 0,1 | 0,5 |
ОСНОВНЫЕ МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ МЕТОДИКИ
КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИБС МЕТОДОМ НЕПРЯМОГО ИФА
В МЯСНЫХ КОНСЕРВАХ
| Метрологическая характеристика (p = 0,95) | Диапазон концентраций ИБС, г/100 г | |
| 0,2 — 1,0 | 1,0 — 10 | |
| Предел повторяемости (r ), г/100 г m | 0,1 | 0,6 |
| Предел воспроизводимости (R ), г/100 г m | 0,2 | 0,6 |
| Предел точности (ДЕЛЬТА), г/100 г | 0,1 | 0,3 |
Если указанное соотношение не выполняется, выполнение анализов прекращают, выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным
результатам, и устраняют их.
13.2. Контроль правильности результатов анализа
Контроль правильности результатов анализа проводят раз в год путем анализа контрольных образцов. В качестве контрольных образцов могут быть
использованы образцы мясных продуктов с заранее известным содержанием ИБС.
Абсолютное значение разности результата анализа контрольного образца (X) и принятого опорного значения (X ) не должно превышать критического
am
значения K, т.е. с доверительной вероятностью P = 0,95 должно выполняться условие:
Критическое значение K вычисляют по формуле:
_________________
/ 2 2 K = \/ДЕЛЬТА + ДЕЛЬТА , (28)
am
ДЕЛЬТА — погрешность установления опорного значения содержания ИБС в am контрольном образце;
ДЕЛЬТА — граница интервала, в котором с вероятностью P = 0,95 находится погрешность результата анализа X. Значения ДЕЛЬТА приведены в табл. 3 для колбасных изделий и табл. 4 для мясных консервов.
Результат вычислений округляют до первого значащего знака после запятой.