МУК 4.1.2071-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Методические указания по определению остаточных количеств Трифорина в яблоках, винограде, яблочном и виноградном соках методом газожидкостной хроматографии

(утв. Роспотребнадзором 05.05.2006)

5 мая 2006 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ТРИФОРИНА В ЯБЛОКАХ, ВИНОГРАДЕ, ЯБЛОЧНОМ И ВИНОГРАДНОМ СОКАХ МЕТОДОМ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МУК 4.1.2071-06

1 июля 2006 года

1. Подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана при участии специалистов Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. Разработчики методов указаны в каждом из них.

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают метод газожидкостной хроматографии для определения в яблоках, ягодах винограда, яблочном и виноградном соках массовых концентраций трифорина в диапазоне 0,005 — 0,05 мг/кг.

Трифорин — действующее вещество препарата САПРОЛЬ, КЭ (190 г/л), фирма-производитель «Сумитомо Корпорейшн» (Япония).

1,1'-пиперазин-1,4-диилди-[N-(2,2,2-трихлорэтил)формамид] (IUPAC).

Структурная формула не приводится.

    C  H  Cl N O
     10 14  6 4 2

Мол. масса 435

Кристаллическое вещество от белого до кремового цвета со слабым запахом чеснока. Плотность 1,554 (при 20 °C). Температура плавления-кипения 151 — 154 °C (с разложением). Давление паров при 25 °C: 80 мПа. Растворимость в органических растворителях (г/куб. дм): диметилформамид — 330; диметилсульфоксид — 476; N-метилпирролидон, ацетон — 11, дихлорметан — 1, метанол — 10. Растворимость в воде — 9 мг/куб. дм (при 20 °C). Хорошо растворим в тетрагидрофуране, слабо растворим в диоксане и циклогексаноне, нерастворим в бензоле, петролейном эфире и циклогексане. Является сильным основанием, pKa 10,6.

Устойчив к нагреванию до 180 °C. Разрушается в водных растворах при облучении ультрафиолетовым светом и дневном освещении. Разлагается в сильно кислой среде с образованием трихлорацетальдегида (хлоральгидрат) и солей пиперазина, в сильно щелочной среде с образованием хлороформа и пиперазина. DT (pH 5 — 7, 25 °C) — 3,5 дней. 50

Краткая токсикологическая характеристика:

Острая пероральная токсичность (LD ) для крыс — > 16000 мг/кг; 50

для  мышей  - >  6000  мг/кг;  для собак - > 2000 мг/кг. Острая  дермальная
токсичность  (LD  ) для  кроликов - >  10000  мг/кг.  Острая  ингаляционная

            50

токсичность LC (1 час) для крыс — > 4,5 мг/куб. дм. 50

Область применения препарата

Трифорин — фунгицид класса пиперазина.

Препарат САПРОЛЬ (190 г/л) рекомендован к применению против грибных болезней овощных (огурцов), плодовых (яблони) культур и виноградной лозы.

МДУ трифорина в яблоках и винограде — 0,01 мг/кг.

1. Метрологические характеристики метода

Метрологические характеристики метода представлены в таблицах 1 и 2.

Таблица 1

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ

Анализируемый объект	Метрологические параметры, P = 0,95, n = 15
	предел обнаружения, мг/кг	диапазон определяемых концентраций, мг/кг	среднее значение определения, %	стандартное отклонение, S, %	доверительный интервал среднего результата, +/-, %
Яблоки	0,005	0,005 — 0,05	88,06	7,08	9,8
Ягоды винограда	0,005	0,005 — 0,05	89,96	8,00	11,1
Яблочный сок	0,005	0,005 — 0,05	90,07	7,67	10,6
Виноградный сок	0,005	0,005 — 0,05	87,51	7,86	10,9

Таблица 2

ДЛЯ КАЖДОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ)

Среда	Внесено трифорина, мг/кг	Обнаружено трифорина, мг/кг	Полнота извлечения, %
Яблоки (плоды)	0,005	-3 -4 4,5950 x 10 +/- 3,4279 x 10	82,68
	0,01	-3 -4 8,9612 x 10 +/- 2,6668 x 10	89,61
	0,05	-3 0,0413406 +/- 3,9898 x 10	91,90
Виноград (ягоды)	0,005	-3 -4 4,4685 x 10 +/- 2,0131 x 10	89,37
	0,01	-3 -4 9,0769 x 10 +/- 7,1318 x 10	90,77
	0,05	-3 0,0448695 +/- 6,2427 x 10	89,74
Яблочный сок	0,005	-3 -4 4,8074 x 10 +/- 3,0951 x 10	96,15
	0,01	-3 -4 8,3250 x 10 +/- 4,3141 x 10	83,25
	0,05	-3 0,0454005 +/- 3,3181 x 10	90,80
Виноградный сок	0,005	-3 -4 4,8723 x 10 +/- 1,3092 x 10	97,45
	0,01	-3 -4 8,2851 x 10 +/- 4,5551 x 10	82,85
	0,05	-3 0,0411724 +/- 7,5070 x 10	82,34

2. Метод измерений

Методика основана на определении вещества с помощью газожидкостной хроматографии (ГЖХ) с детектором электронного захвата ионов (ДЭЗ) после превращения трифорина в хлоральгидрат при нагревании с разбавленной серной кислотой, его отгонки с водой и последующей переэкстракции в этилацетат.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

Нижний предел измерения хлоральгидрата в хроматографируемом объеме пробы 0,0015 нг.

В предлагаемых условиях определения метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в технологии выращивания яблок и винограда.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Газовый хроматограф «Кристалл-2000М», снабженный детектором электронного захвата ионов с пределом -14

детектирования по линдану 5 x 10    г/с,
предназначенный для работы с капиллярной колонкой       Номер

                                                    Госреестра 14516-95

Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104

Весы лабораторные общего назначения с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г ГОСТ 7328

Колбы мерные 2-25-2, 2-50-2, 2-100-2, 2-500-2 ГОСТ 1770

Меры массы ГОСТ 7328

Микрошприц МШ-1 ГОСТ 20292

Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0: 2,0; 5,0 и 10 куб. см ГОСТ 29227

Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 15 куб. см ГОСТ 29227

Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25, 50, 100, 200 и 1000 куб. см ГОСТ 1770

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Трифорин с содержанием действующего вещества 99,8% (фирма «БАСФ», Германия)

Хлоральгидрат (трихлорацетальдегид), 98,5% (фирма «Акрос Органикс», Бельгия

Вода бидистиллированная, деионизованная или перегнанная над KMnO 4

Кислота серная концентрированная, х.ч. ГОСТ 4204

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Азот газообразный из баллона, ос.ч.

Аквадистиллятор ГОСТ 22340

Аллонж изогнутый с отводом АИО-14/23-29/32-50 ГОСТ 9737

Баня масляная

Бумажные фильтры «красная лента» обеззоленные ТУ 6-09-2678-77

Воронки делительные вместимостью 150 — 200 куб. см ГОСТ 25336

Воронки конусные диаметром 30 — 37 мм ГОСТ 25336

Гомогенизатор

Груша резиновая

Капилляр на шлифе 14/23 ГОСТ 9737

Колба Клайзена (видоизмененная, яйцевидной формы) вместимостью 100 — 150 куб. см с дефлегматором елочным длиной 40 — 50 мм ГОСТ 9737

Колба коническая (Эрленмейера) КН-1-100-29/32 вместимостью 100 куб. см ГОСТ 9737

Колонка капиллярная DB-5 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщина пленки сорбента 0,25 мкм

Лед

Ректификационная колонна с числом теоретических тарелок не менее 50

Стаканы химические вместимостью 100 и 400 куб. см ГОСТ 25336

Стеклянные палочки

Термометр контактный ГОСТ 9871

Термометр лабораторный со шлифом ГОСТ 16590

Холодильник водяной прямой (Либиха) ХПТ-1-200-14-14 ГОСТ 25336-82

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, изложенные в технической документации на газовый хроматограф.

4.2. Помещение должно соответствовать требованиям пожаробезопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать норм, установленных ГН 2.2.5.1313-03 «Предельно допустимые концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны». Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на газовом хроматографе.

К проведению пробоподготовки допускают оператора с квалификацией «лаборант», имеющего опыт работы в химической лаборатории.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка этилацетата ректификационной перегонкой на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50 (при необходимости), приготовление раствора серной кислоты, градуировочных растворов и растворов внесения, установление градуировочной характеристики.

7.1. Приготовление 10% раствора серной кислоты

В мерную колбу вместимостью 500 куб. см помещают 200 — 250 куб. см деионизованной воды, вносят 52 куб. см концентрированной серной кислоты, перемешивают, доводя водой до метки, вновь перемешивают.

7.2. Приготовление градуировочных растворов

7.2.1. Исходный раствор хлоральгидрата (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г хлоральгидрата, растворяют в 50 — 70 куб. см этилацетата, доводят этилацетатом до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Растворы № 1 — 6 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.2.2. Раствор № 1 хлоральгидрата для градуировки (концентрация 15 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 15,0 куб. см исходного раствора с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.2.1), доводят до метки этилацетатом, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

7.2.3. Раствор № 2 хлоральгидрата для градуировки (концентрация 0,15 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 1,0 куб. см раствора № 1 с концентрацией 15 мкг/куб. см (п. 7.2.2), доводят до метки этилацетатом, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике в течение 15-ти дней.

7.2.4. Рабочие растворы № 3 — 6 хлоральгидрата для градуировки (концентрация 0,0015 — 0,015 мкг/куб. см).

В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 1,0, 2,0, 5,0 и 10,0 куб. см раствора № 2 с концентрацией 0,15 мкг/куб. см (п. 7.2.3), доводят до метки этилацетатом, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 3 — 6 с концентрацией хлоральгидрата 0,0015, 0,003, 0,0075 и 0,015 мкг/куб. см, соответственно.

Растворы хранят в холодильнике не более 7-ми дней.

7.3. Приготовление растворов внесения

7.3.1. Исходный раствор трифорина (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,01 г трифорина, растворяют в 50 — 70 куб. см ацетона, доводят ацетоном до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Растворы № 1, 2 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного раствора.

7.3.2. Раствор № 1 трифорина для внесения (концентрация 1 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 1,0 куб. см исходного раствора с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.3.1), доводят до метки ацетоном, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике в течение 15-ти дней.

7.3.3. Раствор № 2 трифорина для внесения (концентрация 0,1 мкг/куб. см).

В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 10,0 куб. см раствора № 1 с концентрацией 1,0 мкг/куб. см (п. 7.3.2), доводят до метки ацетоном, тщательно перемешивают.

Раствор хранится в холодильнике в течение 10-ти дней.

Растворы 1 и 2 используют для внесения трифорина в образцы объектов контроля при оценке полноты извлечения действующего вещества из исследуемых проб.

7.4. Установление градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади (высоты) пика от концентрации хлоральгидрата в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки № 3 — 6.

В испаритель хроматографа вводят по 1 куб. мм каждого градуировочного раствора № 3 — 6 и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.1. Осуществляют не менее 3-х параллельных измерений.

8. Отбор проб

Отбор проб осуществляется по требованиям ГОСТ на соответствующий вид продукции: яблоки - ГОСТ 16270-70 «Яблоки свежие ранних сортов созревания. ТУ» и ГОСТ 21122-75 «Яблоки свежие поздних сортов созревания»; ГОСТ 27572-87 «Яблоки свежие для промышленной переработки. ТУ»; виноград - ГОСТ 25896 «Виноград свежий столовый. ТУ»; яблочный и виноградный соки - ГОСТ 26313-84 «Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб».

Отобранные пробы яблок, ягод винограда, яблочного и виноградного соков замораживают и хранят при температуре -18 °C.

Перед анализом образцы яблок и ягод винограда измельчают для приготовления усредненной пробы.

9. Выполнение определения

Аналитический образец измельченных яблок, ягод винограда, яблочного или виноградного сока массой 10 г помещают в химический стакан вместимостью 100 куб. см, вносят 20 куб. см деионизованной воды, гомогенизируют в течение 2-х минут. Полученную массу переносят в колбу Клайзена, ополаскивая стакан 2-мя порциями воды по 20 куб. см, к содержимому добавляют 15 куб. см 10% серной кислоты, перемешивают. К колбе присоединяют прямой холодильник с аллонжем, термометр, капилляр (конец которого должен быть опущен практически до дна перегонной колбы). Через капилляр из баллона со сжатым газом пропускают азот с объемным расходом 20 — 40 куб. см/мин. В приемную коническую колбу вместимостью 100 куб. см (на шлифе) вносят 10 куб. см деионизованной воды, подсоединяют ее к аллонжу таким образом, чтобы конец его трубки находился в растворе. Приемник устанавливают в баню с ледяной водой. Колбу Клайзена помещают в масляную баню и выдерживают при 140 °C в течение часа. В процессе нагревания образующийся при кислотном разложении трифорина хлоральгидрат отгоняется вместе с водяным паром, объем жидкости в приемнике достигает 70 — 80 куб. см. По окончании процесса систему охлаждают, отсоединяют приемную колбу (не останавливая поток азота для предотвращения переброса жидкости). Водный раствор из приемной колбы переносят в делительную воронку вместимостью 150 — 200 куб. см, порционно вносят 25 г хлористого натрия, перемешивая до полного растворения соли. Затем в делительную воронку вносят 8 куб. см этилацетата, интенсивно встряхивают в течение 2-х мин. После полного разделения фаз верхний органический слой переносят в мерную колбу вместимостью 25 куб. см, фильтруя его через слой безводного сульфата натрия толщиной 1 см, помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке. Операцию экстракции повторяют еще дважды, используя по 8 куб. см этилацетата и встряхивая 1 мин. Общий объем раствора в мерной колбе доводят этилацетатом до метки (25 куб. см), перемешивают и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.1.

9.1 Условия хроматографирования

Измерения выполняют при следующих режимных параметрах:

Газовый хроматограф «Кристалл-2000М», снабженный детектором электронного захвата ионов.

Колонка капиллярная DB-5 длиной 30 м, внутренним диаметром 0,25 мм, толщина пленки сорбента 0,25 мкм.

Температура детектора: 320 °C,

испарителя: 200 °C.

Температура термостата колонки программированная. Начальная температура — 40 °C, выдержка — 1 мин., нагрев колонки со скоростью 3 градуса в минуту до температуры 55 °C, выдержка — 3 минуты, нагрев со скоростью 5 градусов в минуту до температуры 75 °C, выдержка — 5 минут. Продувка при нагреве до 270 °C (10 мин.).

Скорость газа 3 (азот) 31,6 см/сек., давление 95 кПа, поток 1,3 куб. см/мин.

Газ 4: деление потока 1:10; сброс 13,5 куб. см/мин.

Газовый режим при продувке:

Газ 3 (азот): давление 95 кПа.

Газ 4: деление потока 1:15, сброс 20 куб. см/мин.

Хроматографируемый объем: 1 куб. мм.

Ориентировочное время выхода хлоральгидрата: 4,1 мин.

Образцы, дающие пики большие, чем градуировочный раствор хлоральгидрата с концентрацией 0,015 мкг/куб. см, разбавляют этилацетатом.

10. Обработка результатов анализа

Содержание трифорина в пробе (X, мг/кг) рассчитывают по формуле:

                            A x V x K x B

X = -------------, m

где:

A — концентрация хлоральгидрата, найденная по градуировочному графику в соответствии с величиной площади (высоты) хроматографического пика, мкг/куб. см;

V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

m — масса анализируемого образца, г;

K — коэффициент пересчета содержания хлоральгидрата на трифорин, равный 1,31 (по соотношению молекулярных масс).

11. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-1-6.2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

12. Разработчики

Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (ФНЦГ им. Ф.Ф. Эрисмана); Роспотребнадзор.

---