Методика определения нитритов и нитратов в кормах, овощах, бахчевых культурах, крови, патологическом материале, молоке и молочных продуктах

(утв. Госагропромом СССР 18.06.1986)

18 июня 1986 года

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ НИТРИТОВ И НИТРАТОВ В КОРМАХ, ОВОЩАХ,

1. Принцип метода

Метод определения нитритов основан на фотометрическом измерении интенсивности окраски азосоединения розово-малинового цвета, образующегося при реакции нитритов с альфа-нафтиламином и сульфаниловой кислотой (реактив Грисса) в кислой среде после водного извлечения их из исследуемых проб.

Реакция специфична для нитритов.

Метод определения нитратов основан на водном извлечении их из исследуемых проб, количественном восстановлении нитратов в нитриты и последующем определении нитритов с реактивом Грисса.

2. Метрологическая характеристика метода

Предел определения нитритов составляет 0,05 мг/кг (мг/л), степень определения нитритов 90 +/- 10%.

Предел определения нитратов составляет 0,5 мг/кг (мг/л), степень определения нитратов 83 +/- 17%.

3. Реактивы и растворы

Сульфаниловая кислота, ч.д.а., ГОСТ 5821-69.

Альфа-нафтиламин, ч.д.а., ГОСТ 8827-57.

Барий сернокислый, ч.д.а., ГОСТ 3158-75.

Цинковая пыль, порошок цинка.

Лимонная кислота, х.ч. или ч.д.а., ГОСТ 3652-69.

Марганец сернокислый, ч.д.а., ГОСТ 435-67.

Натрий азотистокислый (NaNO2), х.ч., ГОСТ 4197-66.

Калий азотнокислый (KNO3), х.ч., ГОСТ 4217-65.

Сульфаминовая кислота, т.ч., ТУ 6-09-2437-79 или ТУ 6-09-2437-79.

Уксусная кислота концентрированная (ледяная), ГОСТ 61-69.

12-процентный водный раствор уксусной кислоты.

1-процентный водный раствор сульфаминовой кислоты.

Уголь активированный марки Б или уголь активированный в таблетках (аптечный).

Натрий гидроокись, х.ч., ГОСТ 4328-77.

Цинк сернокислый, ч.д.а., ГОСТ 4374-77.

Приготовление реактива Грисса:

а) 0,5 г сульфаниловой кислоты растворяют в 150 мл 12-процентного раствора уксусной кислоты;

б) 0,1 г альфа-нафтиламина растворяют (при нагревании) в 20 мл дистиллированной воды, фильтруют и смешивают со 150 мл 12-процентного раствора уксусной кислоты.

Перед употреблением одну часть раствора «а» смешивают с равной по объему частью раствора «б». Растворы «а» и «б» хранят отдельно в холодильнике, при необходимости — в течение 6 мес.

    *Приготовление  стандартного раствора нитрита натрия: 0,15 г высушенного*
*до  постоянной  массы  при  температуре  80  °С  NaNO    растворяют  в  1 л*

                                                 *2*

*дистиллированной  воды, свободной от нитритов. 1 мл этого раствора содержит*
*0,1  мг (100 мкг) NO . Раствор хранят в холодильнике, он устойчив в течение*

                *2*

месяца.

Приготовление рабочего раствора нитрита натрия: 25 мл полученного стандартного раствора переносят в мерную колбу на 500 мл и доводят объем до метки дистиллированной водой. Раствор должен быть свежеприготовленным, 1 мл его содержит 0,005 мг (5 мкг) NO . Этот раствор используют для построения 2 калибровочной кривой.

    *Приготовление  стандартного  раствора  нитрата калия: растворяют 1,63 г*
*нитрата   калия,   высушенного   до   постоянной   массы   при  105  °С,  в*
*дистиллированной  воде  в  мерной  колбе на 1 л и доводят объем раствора до*
*метки   дистиллированной   водой.   1  мл  этого  раствора  содержит  1  мг*

нитрат-ионов (NO ). Раствор можно хранить в холодильнике в течение 3 мес. 3

Приготовление рабочего раствора нитрата калия: в мерную колбу на 100 мл переносят пипеткой 1 мл стандартного раствора нитрата калия и доводят объем

*раствора  в  колбе  до метки 12-процентным раствором уксусной кислоты. 1 мл*
*этого  раствора  содержит  0,01  мг  (10  мкг)  NO .  Раствор  должен  быть*

                                              3

свежеприготовленным. Этот раствор используют для построения калибровочной кривой.

Приготовление реактива для восстановления нитратов в нитриты:

а) барий сернокислый, высушенный при 100 °С до постоянной массы, — 100 г;

б) марганец сернокислый, прокаленный при 200 °С в течение часа, — 10 г;

в) цинковая пыль — 2 г;

г) лимонная кислота — 75 г;

д) сульфаниловая кислота — 4 г;

е) альфа-нафтиламин — 2 г.

Каждый реактив тщательно растирают в ступке, затем к реактиву «а» в ступке последовательно добавляют реактивы «б», «в», «д», «е», «г» и тщательно перемешивают до получения однообразной массы. Полученный реактив хранят в склянке из темного стекла, он пригоден для использования в течение 2 лет.

Приготовление 12-процентного раствора уксусной кислоты: 120 мл ледяной уксусной кислоты смешивают с 880 мл дистиллированной воды.

Приготовление 1-процентного раствора сульфаминовой кислоты: 1 г сульфаминовой кислоты растворяют в 99 мл дистиллированной воды.

Приготовление 0,5 М раствора гидроокиси натрия: 20 г NaOH растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды в мерной колбе на 1 л и доводят объем в колбе до метки дистиллированной водой.

Приготовление 5-процентного раствора сульфата цинка: 5 г сульфата цинка растворяют в 95 мл дистиллированной воды.

4. Приборы и посуда

    Химические  пробирки;  пробирки  с  притертыми  пробками;  центрифужные
пробирки;  пипетки  на  1,  5,  10,  20  мл; мерные колбы на 100 и 1000 мл;

конические колбы на 100, 250 мл; химические стаканы на 100, 200 мл; мешочки для диализа или пленка для диализа N (выпускается картонажными фабриками); 3

цилиндры  на  10, 50 и 100 мл; химические воронки; песочные часы на 2 мин.;
фотоэлектроколориметр;   центрифуга   на  5000  -  6000  об./мин.;  фильтры

обеззоленные среднепористые.

Пленку или мешочки для диализа перед использованием для анализа помещают на 30 — 40 мин. в дистиллированную воду. Во всех случаях при проведении диализа пленку следует брать с запасом по отношению к пробе так, чтобы узел мешочка при проведении диализа не был опущен в воду.

5. Построение калибровочных кривых

Калибровочная кривая для определения нитритов: в 11 химических пробирок наливают рабочий раствор нитрита натрия в количествах, указанных в таблице. Затем в пробирки наливают дистиллированную воду до объема 10 мл, приливают по 1 мл реактива Грисса и энергично встряхивают.

ТАБЛИЦА ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ ШКАЛЫ СТАНДАРТОВ НА НИТРИТЫ

Для построения калибровочной кривой через 15 мин. после начала окрашивания определяют оптическую плотность растворов на фотоэлектроколориметре при зеленом светофильтре (длина волны 540 нм), кюветы — 10 мм, раствор для сравнения — дистиллированная вода.

Затем на оси абсцисс откладывают количество нитрит-ионов (мкг), а на оси ординат — найденные значения оптической плотности растворов и проводят кривую через точки пересечения.

Эта же шкала стандартов может быть использована для визуального сравнения с опытными пробами.

Калибровочная кривая для определения нитратов. Для приготовления шкалы стандартов в 7 химических пробирок с притертыми пробками или в 7 центрифужных пробирок с притертыми пробками последовательно прибавляют по 0,3 г реактива для восстановления нитратов, затем приливают рабочий раствор и 12-процентную уксусную кислоту в количествах, указанных в таблице (общий объем составляет 10 мл).

Затем пробирки или центрифужные пробирки закрывают пробками и энергично встряхивают в течение ровно 2 мин. Через 10 мин. пробы центрифугируют в центрифужных пробирках при 5 — 6 тыс. об./мин. в течение 5 мин. Далее проводят колориметрическое определение интенсивности окраски раствора при длине волны 540 нм, кюветы — 10 мм, раствор для сравнения — 12-процентный раствор уксусной кислоты, обработанный, как пробы, сухим восстановителем и прошедший центрифугирование, — пробирка № 1.

Затем на оси абсцисс откладывают количество нитрат-ионов (мкг), а на оси ординат — найденные значения оптической плотности растворов и проводят кривую через точки пересечения.

Эта же шкала стандартов может быть использована для визуальных определений.

6. Ход определения

Корма. Для исследования измельчают пробу кормов и берут навеску 2 — 10 ч. Извлечение нитритов и нитратов из проб кормов проводят методом диализа. Для этого точно отмеривают 50 — 100 мл дистиллированной воды и используют этот объем для всех дальнейших операций с пробой. Пробу помещают в мешочек или пленку для диализа, приливают туда небольшое количество дистиллированной воды из первоначального объема (50 или 100 мл). Воды приливают столько, чтобы она хорошо смочила пробу. Далее пленку завязывают в виде мешочка, весь оставшийся объем дистиллированной воды (от 50 или 100 мл) наливают в химический стаканчик, опускают мешочек в стакан таким образом, чтобы полностью погрузить пробу в воду, и оставляют ее для проведения диализа в течение 1,5 — 2 ч. Затем, не вынимая мешочков из стаканов, пипеткой отбирают 10 мл диализата для анализа на нитриты и 5 мл для анализа на нитраты и проводят анализ, как описано ниже.

Кровь, органы и ткани животных. Для анализа берут 20 — 50 мл крови, 2 — 10 г органов или тканей животных, помещают пробу в диализный мешочек и опускают в химический стаканчик, в который наливают соответственно 50 — 100 мл прокипяченной горячей дистиллированной воды. Через 1,5 — 2 ч пипеткой отбирают из стакана 10 мл диализата для анализа на нитриты и 5 мл для анализа на нитраты и проводят анализ, как описано ниже.

Если раствор в стакане после диализа имеет окраску или муть, анализ следует проводить после удаления пигментов или мути. Пигменты, окрашивающие диализат, удаляют путем фильтрования небольшого объема диализата через воронку с бумажным фильтром, заполненным на 2/3 активированным углем. Уголь на фильтре предварительно промывают 50 мл прокипяченной дистиллированной воды, которую отбрасывают. Затем через этот фильтр отфильтровывают объем диализата, необходимый для анализа на нитриты и нитраты. В случае необходимости проводят повторное фильтрование этого раствора через свежую порцию активированного угля, промытого водой, до полного исчезновения окраски диализата.

При наличии в диализате мути проводят осаждение белков смесью 0,5 М раствора NaOH и 5-процентного раствора сульфата цинка в объемном отношении 2:5. Для этого отбирают из стакана 30 мл диализата, переносят его в другой стаканчик или колбу, добавляют 10 — 20 мл вышеуказанной смеси. После выпадения осадка диализат фильтруют, измеряют объем фильтрата и отбирают 5 мл для анализа на нитраты и 10 мл для анализа на нитриты.

В этом случае при расчете по формуле содержания нитратов и нитритов за общий объем фильтрата следует принимать сумму объема диализата, оставшегося в первом стаканчике (20 мл), и объема фильтрата, измеренного после осаждения белков и фильтрования.

Молоко, молозиво, обрат, сухое молоко, заменитель цельного молока (ЗЦМ). Отбирают 20 — 50 мл молока или молозива, переносят в пленку для диализа и приливают туда 2 — 4 мл 12-процентной уксусной кислоты, перемешивают содержимое стеклянной палочкой, завязывают пленку и опускают ее в стакан, содержащий 50 — 100 мл горячей прокипяченной дистиллированной воды. Затем через 1,5 — 2 ч отбирают 5 мл диализата для анализа на нитраты и 10 мл для анализа на нитриты и проводят анализ, как описано ниже. В том случае, если в растворе после диализа есть муть, необходимо провести осаждение белков. Для этого отбирают 20 — 30 мл диализата, добавляют 10 — 20 мл смеси 0,5 М раствора NaOH и 5-процентного раствора сульфата цинка в объемном отношении 2:5. После выпадения осадка диализат фильтруют, измеряют объем фильтрата и отбирают пипеткой 5 мл для анализа на нитраты и 10 мл для анализа на нитриты.

Общий объем диализата при этом будет составлять сумму первоначального объема диализата, оставшегося в первом стакане и измеренного после фильтрования объема.

Сухого молока, ЗЦМ для анализа берут 2 — 5 г, помещают в пленку для диализа, хорошо смачивают пробу небольшим объемом дистиллированной воды, приливают туда 2 — 4 мл 12-процентной уксусной кислоты, перемешивают стеклянной палочкой, завязывают пленку и опускают ее в стакан, содержащий 50 — 100 мл горячей дистиллированной воды, диализ проводят в течение 1,5 — 2 ч. При расчете общего объема воды необходимо учесть объем воды, взятый для смачивания пробы.

Обрата для анализа берут 20 — 50 мл, приливают к нему 20 — 50 мл дистиллированной воды, хорошо перемешивают в течение 10 мин. и отбирают 5 мл для анализа на нитраты и 10 мл для анализа на нитриты. Если в растворе есть муть или опалесценция, необходимо проводить осаждение белков, как указано выше.

Картофель, сахарная свекла, огурцы, капуста, лук, редька и другие овощи и бахчевые культуры, дающие с водой неокрашенные растворы. После измельчения проб берут навеску 2 — 10 г, помещают в колбу и заливают 50 — 100 мл дистиллированной воды. Перемешивают в течение 10 — 15 мин. и отбирают аликвотные количества для анализа на нитраты и нитриты. В том случае, если раствор имеет окраску, проводят фильтрование небольшого объема экстракта через активированный уголь, как описано выше.

7. Проведение определения

После того как в пробирку отобрано 10 мл диализата для анализа на нитриты, туда добавляют 1 мл реактива Грисса (раствор «а» смешивают с раствором «б» в равных объемных частях), встряхивают содержимое пробирки и через 15 мин. после появления окраски проводят измерение оптической плотности раствора на фотоэлектроколориметре при зеленом светофильтре (длина волны 540 нм) против дистиллированной воды в кюветах с рабочей длиной 10 мм.

Для анализа на нитраты отбирают 5 мл диализата в пробирку с притертой пробкой, в которую предварительно насыпано 0,3 г сухого восстановителя, приливают туда же 5 мл 12-процентной уксусной кислоты, закрывают пробирку пробкой и энергично встряхивают ее в течение точно 2 мин.

В параллельную пробирку насыпают 0,3 г сухого восстановителя и наливают 10 мл 12-процентной уксусной кислоты, закрывают ее пробкой и встряхивают в течение 2 мин. (пробирка для сравнения) при измерении оптической плотности пробы.

Через 10 мин. переливают содержимое пробирок в центрифужные пробирки и центрифугируют при 5 — 6 тыс. об./мин. в течение 5 мин. После этого проводят колориметрирование проб на ФЭКе при зеленом светофильтре (длина волны 540 нм, кюветы с рабочей длиной 10 мм). В качестве раствора для сравнения используют «холостой» раствор — раствор уксусной кислоты, обработанный сухим восстановителем, как описано выше.

В том случае, если в пробах устанавливается наличие большого содержания нитритов — свыше 20 мкг (интенсивная окраска в пробирке), их следует удалять, так как они несколько завышают результаты определения нитратов. Для удаления нитритов к диализату в стакане, соответственно 50 или 100 мл, прибавляют 2 — 4 мл 1-процентного раствора сульфаминовой кислоты, перемешивают раствор стеклянной палочкой и оставляют на 5 мин. После этого отбирают 5 мл диализата для анализа на нитраты и проводят анализ, как описано выше. При расчетах учитывают увеличение общего объема пробы.

После колориметрирования проб по соответствующим калибровочным кривым находят количество нитритов и нитратов, подставляют их в формулу для расчета (в мкг) и определяют содержание нитратов и нитритов.

Если при определении нитратов образуется очень интенсивная окраска, не укладывающаяся при определении оптической плотности в пределы калибровочной кривой, необходимо повторить определение, взяв меньшее аликвотное количество диализата для анализа, например 0,1 мл, и довести анализируемый объем до 10 мл 12-процентной уксусной кислотой. Далее провести анализ, как указано выше, учитывая при расчетах разведение этого раствора.

Однако если определяется очень высокое содержание нитратов (г/кг), необходимо повторить анализ данной пробы, соответственно уменьшая навеску и увеличивая объем дистиллированной воды для диализа. Можно также после проведения диализа в первый раз и установления высокого содержания нитратов прибавить в стакан к прежнему диализату, в котором находится мешочек с пробой, еще 100 мл дистиллированной воды и провести дополнительный диализ в течение часа. После этого взять аликвотное количество для анализа и провести анализ на нитраты. При расчетах необходимо учесть это разведение диализата, в данном случае в 2 раза, т.е. общий объем диализата при этом составил не 100, а 200 мл.

8. Расчет результатов анализа

Расчет результатов анализа проводят по формуле:

                                В х У

                                     1

Х = ------, А х У 2

где:

Х — содержание нитритов (нитрит-ионов) или нитратов (нитрат-ионов), мг/кг;

В — содержание нитрит-ионов или нитрат-ионов, найденных по соответствующим калибровочным кривым, мкг;

А — навеска анализируемого образца, г;

У — общий объем фильтрата, мл (соответственно 50, 100 мл или другие 1 объемы с учетом разведений);

У — объем фильтрата, взятый для анализа, мл (5 или 10 мл 2 соответственно).

Поскольку при диализе однородная равновесная концентрация минеральных солей устанавливается во всем объеме раствора (в стакане и в растворе в диализном мешочке), при расчете принимается во внимание весь взятый для анализа объем раствора или дистиллированной воды для анализа.

Метод основан на сравнительном измерении оптической плотности растворов исследуемой крови с исходной концентрацией оксигемоглобина (гемоглобина) и параллельной пробы крови, в которой весь оксигемоглобин окислен до метгемоглобина феррицианидом калия, с использованием фотоэлектроколориметра при красном светофильтре.

2. Реактивы и растворы

Аммиак водный (NH4OH), ГОСТ 3760-64.

Калий железосинеродистый (феррицианид калия, соль кровяная красная), ГОСТ 4206-65.

Гепарин (25000 ед.).

Трилон Б (комплексон III, хелатон, двунатриевая соль ЭДТА — двунатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты).

0,25-процентный раствор аммиака готовят, добавляя к 1 мл аммиака 99 мл дистиллированной воды. Насыщенный раствор феррицианида калия готовят, растворяя 70 г этой соли в 100 мл дистиллированной воды. Раствор можно хранить не более недели. Раствор гепарина готовят путем прибавления к 5 мл гепарина 20 мл дистиллированной воды. Раствор трилона Б готовят путем растворения 50 г препарата в 500 мл дистиллированной воды, подогревая раствор при температуре 80 °С до полного растворения. Теплый раствор фильтруют через микропористый стеклянный фильтр № 3 или 4 или через 4 слоя фильтровальной бумаги.

3. Приборы и посуда

Химические пробирки.

Пипетки на 1, 10 мл.

Химические воронки или воронки со стеклянным фильтром № 3 или 4.

Фотоэлектроколориметр.

4. Подготовка проб к анализу

Для анализа у исследуемых животных берут по 1 — 2 мл крови, помещают ее в пробирку и стабилизируют кровь, добавив туда 2 — 3 капли раствора гепарина или трилона Б, перемешивают раствор и закрывают пробирки пробками.

Анализ проб на содержание метгемоглобина лучше проводить непосредственно после доставки проб, но при необходимости стабилизированную кровь хранят в холодильнике при температуре 2 — 4 °С.

5. Ход анализа

В 2 химические пробирки наливают по 7,3 мл 0,25-процентного раствора аммиака и добавляют по 0,2 мл исследуемой крови (из одной пробы крови). В одну из пробирок (пробирка № 2) добавляют 1 — 2 капли насыщенного раствора феррицианида калия, оставляют на 10 мин. обе пробирки, а затем определяют величину светопоглощения (экстинцию) обоих растворов, используя для сравнения 0,25-процентный раствор аммиака.

    В  первой  пробирке  (пробирке N 1) определяют величину светопоглощения
раствора  крови  с  исходной концентрацией оксигемоглобина  или, что то же,
гемоглобина,  во  второй (пробирка N 2) - величину светопоглощения раствора
крови,  в  которой  весь  оксигемоглобин  (HbO )  превращен в метгемоглобин

                                          2

Как отмечено выше, содержание оксигемоглобина в исходной пробе крови соответствует содержанию гемоглобина в ней.

Поскольку в параллельной пробе крови (пробирка № 2) весь гемоглобин полностью переводится в метгемоглобин добавлением насыщенного раствора феррицианида калия, величина светопоглощения раствора с содержанием метгемоглобина практически постоянная и зависит от исходного уровня гемоглобина (оксигемоглобина).

6. Колориметрирование проб

Определение светопоглощения растворов крови в обеих пробирках проводят на фотоэлектроколориметре (ФЭК) при красном светофильтре. У ФЭК различных марок длина волны, соответствующая максимуму пропускания при красном светофильтре, бывает различной. Так, у ФЭК-56 при работе с красным светофильтром № 8 длина волны составляет 597 нм, у спектрофотоэлектроколориметров ФЭК-56 ПМ и ФЭК-КФК-2 длины волн при работе с красным светофильтром лежат в интервале 600 — 670 нм.

Определение светопоглощения растворов крови в обеих пробирках проводят с использованием ФЭК различных марок при красном светофильтре в вышеприведенном интервале длин волн, используя для сравнения 0,25-процентный раствор аммиака, в кюветах с рабочей длиной 10 мм.

    Различия,  связанные  с  измерением   экстинций   растворов  крови  при
различающихся  длинах волн при работе на ФЭК различных марок, корригируются
путем  введения  в  расчетную  формулу  коэффициента - величины приведенной
экстинции  раствора  крови  с  исходным  уровнем  оксигемоглобина  (Е  HbO

                                                                      2

привед.), как показано в разделе, — расчет результатов анализа. При расчете

этой  приведенной  величины  используют  измеренные  опытным путем величины
светопоглощения  раствора крови с исходным уровнем оксигемоглобина (Е HbO )

                                                                     2

• пробирка № 1 и величины светопоглощения раствора крови с предельным содержанием метгемоглобина (Е МтHb) — пробирка № 2.

7. Расчет результатов анализа

    Предварительно  опытным  путем  на  большой  группе животных двух видов
установлена  средняя  величина  светопоглощения  раствора  крови с исходным
уровнем   оксигемоглобина  (Е  HbO )  и  средняя  величина  светопоглощения

                              2

раствора крови с полученным уровнем метгемоглобина (Е МтHb) для овец и коров.

В пробах крови овец первая величина (Е HbO ) составила 0,15, вторая 2 (Е МтHb) — 0,57; для крупного рогатого скота эти величины составляют соответственно 0,17 и 0,79.

Поскольку гемоглобин в пробе крови полностью переводится в метгемоглобин добавлением насыщенного раствора феррицианида калия, изменение светопоглощения, равное 0,42 (0,57 — 0,15) для овец и 0,62 (0,79 — 0,17) для крупного рогатого скота, соответствует 100% содержания метгемоглобина.

Все эти данные были необходимы для выведения коэффициентов при расчете содержания метгемоглобина в крови животных по данной методике.

По методике проводят определение светопоглощения растворов исследуемой крови с исходным уровнем оксигемоглобина (пробирка № 1) и полученным уровнем метгемоглобина (пробирка № 2) и рассчитывают содержание метгемоглобина в крови по нижеприведенным формулам, используя установленные коэффициенты и расчетное приведенное значение светопоглощения раствора оксигемоглобина с учетом коррекции измерения этой величины при красном светофильтре с различающимися длинами волн:

                 Х = (Е  - Е ) х 2,38 х 100 (1) для овец,
                       2    1

        Х = (Е  - Е ) х 1,61 х 100 (2) для крупного рогатого скота,
              2    1

где:

Х — содержание метгемоглобина в исследуемой пробе крови, %;

Е — приведенное значение светопоглощения раствора оксигемоглобина 2 (Е HbO ), расчет его приводится ниже; 2

Е — среднее значение величины светопоглощения раствора 1 оксигемоглобина, равное 0,15 для овец и 0,17 для крупного рогатого скота;

    2,38 и 1,61 - расчетные  коэффициенты,  найденные  из  средних  величин
светопоглощения  растворов  оксигемоглобина  и  метгемоглобина  для  овец и

крупного рогатого скота (расчет их также приводится далее).

Значение Е — приведенное значение светопоглощения раствора 2

оксигемоглобина  (Е  HbO   =  Е )  -  находят из пропорции с использованием
                        2      2
измеренных  величин  светопоглощения  раствора крови с исходным содержанием

оксигемоглобина (пробирка № 1) и метгемоглобина (пробирка № 2) в опыте.

                       Е    Е               Е  х Е
                        2    4               3    4
                       -- = --, откуда Е  = -------,
                       Е    Е           2      Е
                        3    5                  5

где:

Е — искомая величина — приведенное значение оптической плотности 2 раствора оксигемоглобина;

Е — среднее значение оптической плотности раствора метгемоглобина, 3 соответственно 0,57 для овец для расчета Е в формулу (1) и 0,79 для 2 крупного рогатого скота в формулу (2);

Е — измеренное значение оптической плотности раствора оксигемоглобина 4 (пробирка № 1);

Е — измеренное значение оптической плотности раствора метгемоглобина 5 (пробирка № 2).

Значение Е подставляют в формулу (1) или (2) для расчета содержания 2 метгемоглобина в крови овец или крупного рогатого скота.

Если приведенное значение оптической плотности раствора оксигемоглобина (Е ) будет равно или меньше средней величины оптической плотности раствора 2 оксигемоглобина (Е в формулах № 1 и 2), что объясняется индивидуальными 1

колебаниями  содержания  гемоглобина  в  крови, содержание метгемоглобина в
крови  в  этом  случае  будет  равно  или  меньше  2,38 для овец и 1,61 для

крупного рогатого скота.

Коэффициенты 2,38 и 1,61 были рассчитаны из средних показателей оптической плотности растворов метгемоглобина и оксигемоглобина в крови овец и коров соответственно по формулам:

100 х 0,01         100 х 0,01

---------- = 2,38, ---------- = 1,61, 0,42 0,62

где:

0,42 — изменение светопоглощения растворов крови овец с содержанием мет- и оксигемоглобина (0,57 — 0,15), соответствующее 100-процентному содержанию метгемоглобина в крови овец;

0,01 — наименьший показатель оптической плотности, т.е.:

0,42 — 100 0,01 — Х.

Подобным образом рассчитан коэффициент для крупного рогатого скота.

Метод предназначен для химико-токсикологических, клинических и других исследований свернувшейся (сгустков) и несвернувшейся (цельной) крови на долю метгемоглобина в процентах по отношению к общему гемоглобину.

Методы основаны на уменьшении величины оптической плотности содержащегося в исследуемом растворе крови метгемоглобина (гемоглобина) вследствие перевода его в цианметгемоглобин (гемоглобинцианид) и вычисления процентного соотношения этой величины к такому же показателю 100-процентного метгемоглобина того же раствора крови.

Принцип определения — фотоколориметрический по прямому определению 630 (установлению) величины уменьшения оптической плотности (Д ДЕЛЬТА) раствора крови в одной кювете.

Погрешность метода — не более 0,075% при нормальном и 0,227% при 71,1-процентном содержании метгемоглобина от общего гемоглобина.

Выявляемость метода при оптической плотности 0,001 составляет не более 0,3%.

1. Оборудование, реактивы и растворы

1.1 Оборудование:

колориметр-нефелометр фотоэлектрический типа ФЭК-56 М или другие приборы подобного типа с наличием светофильтра с длиной волны 625 — 670 нм;

центрифуга лабораторная на 4 — 8 тыс. об./мин. типа ЦЛН-2 или ЦУМ-1 и др.;

колбы мерные вместимостью 25 куб. см;

пипетки на 1, 5 и 10 куб. см;

стаканчики стеклянные на 50 куб. см;

пипетки глазные;

палочки стеклянные или пластмассовые.

1.2 Реактивы и растворы:

ацетонциангидрин по ТУ 6-09-3558-81 или ГОСТ 13198-77, 10-процентный раствор (объем/объем). Годен до 1 года;

вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72;

калий железосинеродистый (соль красная кровяная) по ГОСТ 4206-75, х.ч., 10-процентный раствор. Годен 30 дней при хранении в темном месте.

2. Подготовка к анализу

2.1 Приготовление раствора крови.

2.1.1. Из сгустка крови. От свежего трупа животного (в том числе птицы) или из патматериала (из сердца, крупных сосудов) берут в стаканчик сгусток крови массой около 1 г, добавляют 9 куб. см воды и сгусток тщательно разминают чистым никелированным пинцетом до обесцвечивания комков фибрина. Затем комки фибрина удаляют, а в стаканчик с гемолизатом эритроцитов приливают 15 куб. см воды.

2.1.2. Из цельной крови. В мерную колбу на 25 куб. см наливают около 20 куб. см воды, 1 куб. см (точно) гепаринизированной (декальцинированной трилоном Б или оксалатной) крови, промывают внутренний канал пипетки несколько раз содержимым колбы (избегая образования пены), объем гемолизата эритроцитов в колбе доводят водой до метки и тщательно перемешивают (разведение крови в 25 раз).

2.1.3. Гемолизаты из стабилизированной крови или сгустка крови переносят в капроновые центрифужные патроны, центрифугируют 15 — 20 мин. при 8 тыс. об./мин. и исследуют не позднее 1 ч после центрифугирования.

3. Проведение анализа

3.1. Устанавливают в рабочее положение светофильтр с длиной волны 630 нм. В левый кюветодержатель помещают 10-миллиметровую кювету с водой, а в правый — такую же кювету с 4 куб. см центрифугата раствора крови и устанавливают правый измерительный барабан прибора точно на ноль (по красной шкале). Открывают световое окно с помощью рукоятки шторки и вращением левого барабана добиваются установки стрелки микроамперметра на ноль.

В кювету с раствором крови вносят одну каплю раствора ацетонциангидрина

(АЦГ)  и  перемешивают  содержимое  кюветы  стеклянной  палочкой.  При этом
взаимодействие  метгемоглобина  с  АЦГ  с  образованием  цианметгемоглобина
заканчивается  через 2 - 3 мин. Через 2 - 3 мин. после прибавления раствора
АЦГ  открывают  световое  окно  прибора  и  правым  измерительным барабаном
устанавливают  стрелку  микроамперметра  на  ноль. По красной шкале правого

                                                                 630

барабана отсчитывают показатель уменьшения оптической плотности (Д ДЕЛЬТА) 1 раствора крови.

3.2. Правую кювету освобождают от содержимого и 4 — 5 раз тщательно промывают водой. Затем ополаскивают кювету 0,5 куб. см раствора крови, наливают 4 куб. см того же раствора крови и устанавливают кювету в правый кюветодержатель. К раствору крови в кювете добавляют одну каплю 10-процентного раствора красной кровяной соли (ККС), перемешивают другой чистой стеклянной палочкой и оставляют стоять 3 мин. За это время весь кровяной пигмент превращается в метгемоглобин.

Устанавливают правый измерительный барабан точно на ноль, а левый (не открывая светового окна) устанавливают на отметку 0,4 — 0,6 по красной шкале. Открывают шторку светового окна и левым барабаном точно устанавливают стрелку микроамперметра на ноль.

К раствору крови в кювете прибавляют одну каплю раствора АЦГ, содержимое кюветы перемешивают стеклянной палочкой, устанавливают первый барабан на отметку 0,4 (грубая наводка, без открытия светового окна).

Через 2 — 3 мин. после прибавления раствора АЦГ открывают световое окно

и  устанавливают  правым измерительным барабаном стрелку микроамперметра на
ноль.  По  красной  шкале  правого  барабана  снимают показатель уменьшения

                       630

оптической плотности (Д ДЕЛЬТА) раствора крови, в котором весь гемоглобин 2

4. Обработка результатов

4.1 Долю метгемоглобина (в %) к общему гемоглобину (общему пигменту) крови вычисляют по формуле:

                                 630
                             Д  ДЕЛЬТА х 100
                              1

MetHb = ---------------, 630 Д ДЕЛЬТА 2

где:
    630

Д ДЕЛЬТА — показатель уменьшения оптической плотности раствора крови 1 после прибавления АЦГ; 630

Д ДЕЛЬТА — показатель уменьшения оптической плотности 100-процентного 2

5. Оценка результатов

5.1. Для постановки диагноза при отравлении животных и птицы метгемоглобинобразующими ядами определение доли метгемоглобина к общему гемоглобину является решающим диагностическим показателем.

Обнаружение в крови более 30% метгемоглобина указывает на возможность отравления, а более 60% — на возможную причину падежа животного от отравления метгемоглобинобразующими веществами (ядами).

5.2. Обнаружение в крови животного нормального содержания (до 5%) метгемоглобина исключает потребность проведения химико-токсикологических исследований патматериала на метгемоглобинобразующие вещества (нитриты, бертолетову соль, красную кровяную соль, анилин и др.). Однако для исключения отравления животных нитрат-ионами (без их редукции в нитриты) необходимо патматериал исследовать на нитраты.