ГОСТ Р 54744-2011. Национальный стандарт Российской Федерации. Продукция соковая. Определение хинной, яблочной и лимонной кислот в продуктах из клюквы и яблок методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
(утв. и введен в действие Приказом Росстандарта от 13.12.2011 № 919-ст)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «Технический регламент на соковую продукцию из фруктов и овощей» (ТР ТС 023/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 28.01.2020 № 19). Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств» (ТР ТС 029/2012) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 07.02.2018 № 21). Документ включен в Перечень стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «Технический регламент на соковую продукцию из фруктов и овощей» (ТР ТС 023/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Комиссии Таможенного союза от 09.12.2011 № 882). Документ введен в действие с 01.01.2013.
Утвержден и введен в действие
Приказом Федерального
агентства по техническому
регулированию и метрологии
от 13 декабря 2011 г. № 919-ст
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ХИННОЙ, ЯБЛОЧНОЙ И ЛИМОННОЙ КИСЛОТ В ПРОДУКТАХ ИЗ КЛЮКВЫ И ЯБЛОК МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Juice products. Determination of quinic, malic and citric acids in products from cranberry and apples by high-performance liquid chromatography
1 января 2013 года
Предисловие
Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения».
Сведения о стандарте
1. Разработан Академическим центром сертификации и стандартизации продуктов питания ОАО «Академсертификат».
2. Внесен Техническим комитетом по стандартизации ТК 93 «Продукты переработки фруктов, овощей и грибов».
3. Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 13 декабря 2011 г. № 919-ст.
4. В настоящем стандарте учтены основные нормативные положения:
- международного стандарта CODEX-STAN 247-2005 «Общий стандарт на фруктовые соки и нектары» (CODEX-STAN 247-2005 «Codex general standard for fruit juices and nectars») в части методов анализа и отбора проб соковой продукции;
- основные нормативные положения и метрологические характеристики документа AOAC 986.13 «Хинная, яблочная и лимонная кислоты в коктейлях из клюквенного сока и в яблочном соке» (AOAC Official Method 986.13 «Quinic, Malic and Citric Acids in Cranberry Juice Cocktail and Apple Juice»).
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.
1. Область применения
Настоящий стандарт распространяется на соковую продукцию в части продуктов из клюквы и яблок и устанавливает метод определения содержания хинной, яблочной и лимонной кислот с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — метод ВЭЖХ).
2. Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ Р 51239-98. Соки фруктовые и овощные. Метод определения L-яблочной кислоты
ГОСТ Р 51940-2002. Соки фруктовые и овощные. Метод определения D-яблочной кислоты
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80). Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 4198-75. Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия
ГОСТ 6552-80. Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия
ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 26313-84. Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб.
Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочного стандарта в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3. Сущность метода
Метод основан на предварительной твердофазной экстракции пробы с помощью одноразового картриджа для удаления соединений, мешающих определению, фильтровании и хроматографическом разделении в системе для проведения ВЭЖХ.
Хинная, яблочная, лимонная кислоты в ходе хроматографического определения разделяются с использованием двух обращенно-фазовых хроматографических колонок и регистрируются с помощью спектрофотометрического детектора при длине волны 214 нм. Расчет долей органических кислот, подтверждаемых хроматограммой, осуществляется путем сравнения с градуировочными растворами стандартных веществ.
4. Приборы и реактивы
4.1 Хроматограф для ВЭЖХ
Хроматографическая система для ВЭЖХ состоит из инжектора, спектрофотометрического детектора с возможностью регистрации фракций при длине волны 214 нм с разрешением 0,1 ед. оптической плотности, программно-аппаратного комплекса для обработки результатов хроматографического разделения (например, система Waters Associates, Inc., инжектор модель 7725i, детектор модель 2487, компьютерный интегратор Hewlett-Packard 3390 или эквивалентная система).
4.2 Колонка аналитическая
Для хроматографического разделения используют аналитическую колонку [1], модель Supelcosil LC-18 (или эквивалент), с размером частиц 5 мкм, длиной 250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм с последовательно подключенным картриджем модель Radial - PakC_{18} (Waters Associates, Inc. или эквивалент) с размером частиц 5 мкм, длиной 100 мм, с использованием радиального насосного модуля.
Картридж Radial - PakC_{18} допускается заменить на любую стандартную обращенно-фазовую колонку C_{18} из нержавеющей стали с размером частиц 10 мкм.
В системе перед колонкой [1] необходимо использовать предварительную обращенно-фазовую колонку, модель Bio-Rad ODS-10 (или эквивалент). В качестве подвижной фазы используют фосфатный буфер. Скорость элюирования составляет 0,8 см3/мин. Разрешение детектора должно составлять не менее 0,1 ед. оптической плотности.
4.3 Картридж для твердофазной экстракции
Для твердофазной экстракции используют одноразовые картриджи, модель Sep - PakC_{18} (Waters Associates, Inc. или эквивалент).
4.4 Реактивы
4.4.1. Калий фосфорнокислый однозамещенный (KH_{2}PO_{4}) по ГОСТ 4198, х.ч.
4.4.2 Кислота ортофосфорная массовой долей не менее 85%, х.ч.
4.4.3. Метанол (перед применением фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм), 95%, ч.д.а.
4.4.4 Фаза подвижная ВЭЖХ — раствор 0,2 М KH_{2}PO_{4} с 2,4 ед. pH
Для приготовления подвижной фазы (фосфатного буфера) для ВЭЖХ взвешивают 27,2 г KH_{2}PO_{4} (4.4.1) в химическом стакане. В стакан добавляют дистиллированной воды (4.4.5) до объема 950 см3. С помощью pH-метра и ортофосфорной кислоты (4.4.2) доводят кислотность до 2,4 ед. pH. Раствор переносят в мерную колбу на 1000 см3 и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор фильтруют через мембранный фильтр с размером диаметра пор 0,45 мкм (4.7).
4.4.5 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
4.4.6 Кислота хинная (CAS-77-95-2), ч.д.а.
4.4.7 Кислота яблочная (CAS-6915-7), ч.д.а.
4.4.8 Кислота лимонная (CAS-77-92-9), ч.д.а.
4.4.9. Ацетонитрил, ч.д.а. (перед применением фильтруют через мембранный фильтр с размером диаметра пор 0,45 мкм).
4.5 Посуда лабораторная стеклянная по ГОСТ 25336.
4.6. Колбы мерные по ГОСТ 1770 вместимостью 100 и 1000 см3.
4.7. Фильтры мембранные размером 25 мм и размером диаметра пор 0,45 мкм.
4.8 Шприц медицинский вместимостью 10 см3.
Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.
5. Отбор проб
Отбор проб — по ГОСТ 26313.
6. Подготовка к определению
6.1. Перед подготовкой кондиционируют картридж (4.3) путем элюирования через него 10 см3 смеси ацетонитрила (4.4.9) и дистиллированной воды в соотношении 50:50 с помощью медицинского шприца вместимостью 10 см3. После удаления шприца через картридж пропускают 10 см3 воздуха. Затем проводят экстракцию 10 см3 пробы. Отбрасывают первые 4 — 5 см3 элюата и собирают следующие 4 — 5 см3. Полученную пробу фильтруют через мембранный фильтр и применяют для анализа методом ВЭЖХ.
6.2 Приготовление градуировочных растворов
В подходящей лабораторной емкости взвешивают с точностью 0,1 мг по 0,200 г хинную (4.4.6), яблочную (4.4.7) и лимонную кислоту (4.4.8). Переносят смесь кислот в мерную колбу на 100 см3. Объем в колбе доводят дистиллированной водой до метки. Раствор фильтруют через мембранный фильтр (4.7).
7. Проведение определения
7.1 Подготовка хроматографической системы
Хроматографическую систему последовательно кондиционируют метанолом (4.4.3) или смесью из метанола и дистиллированной воды в соотношении 70:30, затем дистиллированной водой и фосфатным буфером (4.4.4). В конце рабочего дня проводят очистку системы, используя перечисленные выше реактивы в обратном порядке.
Предупреждение: запрещен контакт метанола с фосфатным буфером!
7.2 Условия определения
Для проведения хроматографического разделения выполняют следующие условия:
- скорость потока 0,8 см3/мин;
- спектрофотометрическое детектирование фракций при 214 нм, комнатной температуре и разрешении детектора 0,1 ед. оптической плотности.
Система колонок считается подготовленной, если в соковой продукции из клюквенного сока и яблочном соке регистрируется видимое разделение между первым пиком сахарозы и хинной кислотой. В хроматографическую систему для проверки линейности измерений вводят от 5 до 20 мкл градуировочных растворов (4.1) после каждых двух разделений растворов проб, для хроматографического разделения проб используют по 5 мкл, полученных в ходе твердофазной экстракции (4.2). Проводят по два параллельных определения для градуировочных растворов и проб.
В хроматограмме регистрируется такая последовательность выхода кислот — хинная, яблочная, лимонная и фумаровая кислоты.
8. Обработка результатов определения
Процентную долю хинной, лимонной, яблочной или фумаровой кислоты в анализируемой пробе K, %, вычисляют по формуле
K = \frac{PA}{PA^{i}} \times \frac{V^{i}}{V} \times C , (1)
где PA — площадь пика, полученная при анализе пробы;
PA^{i} — площадь пика, полученная при анализе градуировочного раствора;
V^{i} — объем градуировочного раствора;
C — концентрация градуировочного раствора, %.
Примечание. Градуировочный раствор яблочной кислоты (L- или D,L-яблочной кислоты) <1> после разделения показывает в хроматограмме двойной пик, в котором второй — фумаровая кислота. Количество фумаровой кислоты, присутствующей в градуировочном растворе яблочной кислоты, настолько мало, что градуировочный раствор яблочной кислоты можно считать более чем на 99,9% свободным от фумаровой кислоты. Примеси не влияют на результаты определения.
<1> В связи с тем, что описанный в настоящем стандарте хроматографический метод не позволяет получить сведения об изомерах яблочной кислоты при необходимости идентификации продукции с целью выявления ее фальсификации путем добавления D-яблочной и/или D,L-яблочной кислоты, проводят дополнительное определение проб методом ферментативного анализа согласно ГОСТ Р 51239 и ГОСТ Р 51940.
(справочное)
И ЛИМОННОЙ КИСЛОТ В КОКТЕЙЛЕ НА ОСНОВЕ КЛЮКВЕННОГО СОКА [1]
А.1. Хроматограмма с результатами определения хинной, яблочной и лимонной кислот в коктейле на основе клюквенного сока приведена на рисунке А.1.
Порядок выхода компонентов пробы (номера пиков):
4 — аскорбиновая и шикимовая кислоты;
Примечание. Пик № 4, выходящий из аналитической колонки после пика яблочной кислоты (пик № 3), относится к аскорбиновой (витамин C) и шикимовой кислотам, которые не учитываются в определении.
БИБЛИОГРАФИЯ
[1] Journal of AOAC, 1986. — 69. — p. 594.