ГОСТ Р 53139-2008. Национальный стандарт Российской Федерации. Соки и соковая продукция. Идентификация. Определение аскорбиновой кислоты ферментативным методом

(утв. и введен в действие Приказом Ростехрегулирования от 18.12.2008 № 568-ст)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["ГОСТ Р 53139-2008"]:::rst
  click n0 "https://bukva.ai/docs/gost-r-53139-2008" "ГОСТ Р 53139-2008. Национальный стандарт Российской Федерации. Соки и соковая продукция. Идентификация. Определение аскорбиновой кислоты ферментативным методом (утв. и введен в дей"
  n1["ГОСТ 31717-2012"]:::doc
  click n1 "https://bukva.ai/docs/gost-31717-2012" "ГОСТ 31717-2012. Межгосударственный стандарт. Соки и соковая продукция. Идентификация. Определение аскорбиновой кислоты ферментативным методом (введен в действие Приказом Росстанда"
  n0 --> n1
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

от 18 декабря 2008 г. № 568-ст

НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

СОКИ И СОКОВАЯ ПРОДУКЦИЯ. ИДЕНТИФИКАЦИЯ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ АСКОРБИНОВОЙ КИСЛОТЫ ФЕРМЕНТАТИВНЫМ МЕТОДОМ

Juices and juice products. Identification. Determination of ascorbic acid by enzymatic method

ГОСТ Р 53139-2008

Группа Н59

Предисловие

Цели и принципы стандартизации в Российской Федерации установлены Федеральным законом от 27 декабря 2002 г. № 184-ФЗ «О техническом регулировании», а правила применения национальных стандартов Российской Федерации — ГОСТ Р 1.0-2004 «Стандартизация в Российской Федерации. Основные положения».

Сведения о стандарте

1. Подготовлен Государственным образовательным учреждением высшего профессионального образования «Московский государственный университет пищевых производств» Министерства образования и науки Российской Федерации (ГОУ ВПО МГУПП).

3. Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 18 декабря 2008 г. № 568-ст.

4. В настоящем стандарте учтены основные нормативные положения следующих международных (региональных) стандартов:

• CODEX-STAN 247-2005 «Единый стандарт на фруктовые соки и нектары» (CODEX-STAN 247-2005 «Codex general standard for fruit juices and nectars») в части требований к обеспечению качества, подлинности, необходимого состава и методов оценки показателей соков и нектаров;
• ИФУ № 5:2000 «Рекомендации к анализу витамина C» Сборник методов физико-химического анализа соков Международной федерации производителей фруктовых соков [IFU Recommendation No. 5, 2000 «Recommendations for Vitamin C Analysis», (International Federation of Fruit Juice Produces)].

5. Введен впервые.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячно издаваемых информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячно издаваемом информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.

1. Область применения

Настоящий стандарт распространяется на соки и соковую продукцию, включая соки и соковую продукцию для детского питания, в т.ч. фруктовые и овощные соки, нектары, морсы и сокосодержащие напитки, фруктовые и овощные пюре, а также на концентрированные фруктовые и овощные соки, концентрированные морсы, концентрированные фруктовые и овощные пюре и устанавливает метод ферментативного определения массовой концентрации аскорбиновой кислоты (витамина C) в виде кислоты или ее соли. Диапазон определения массовой концентрации аскорбиновой кислоты составляет от 0,0003 до 0,2 г/дм3 включительно.

2. Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 245-76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный. Технические условия

ГОСТ 841-64 Реактивы. Кислота метафосфорная. Технические условия

ГОСТ 1770-74 Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3652-69 Реактивы. Кислота лимонная моногидрат и безводная. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26313-84 Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб

ГОСТ 26671-85 Продукты переработки плодов и овощей, консервы мясные и мясорастительные. Подготовка проб для лабораторных анализов

ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-2-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим ежемесячно издаваемым информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3. Обозначения и сокращения

В настоящем стандарте применены следующие сокращения и обозначения:

МТТ — бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия;

ФМС — переносчик электронов — феназинметосульфат;

АО — аскорбатоксидаза.

4. Сущность метода

Аскорбиновая кислота (витамин C) и другие редуцирующие вещества (x - H_{2}) восстанавливают бромид 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолия (МТТ) в присутствии переносчика электронов феназинметосульфата (ФМС) при pH 3,5 до комплекса МТТ-формазана. В кювете с пробой измеряют сумму редуцирующих веществ:

.

Для обеспечения специфичного определения аскорбиновой кислоты в контрольной кювете проводят окисление аналита аскорбатоксидазой (АО) в присутствии кислорода воздуха. Образующаяся дегидроаскорбиновая кислота не взаимодействует с МТТ и ФМС:

\text{Аскорбиновая}_\text{кислота} + 1/2O_{2}^{\text{АО}} \rightarrow \text{дегидроаскорбиновая}_\text{кислота} + H_{2}O .

Количество образовавшегося комплекса МТТ-формазан, эквивалентное количеству аскорбиновой кислоты в исходной пробе, определяют спектрофотометрическим измерением оптической плотности исследуемого раствора пробы при длине волны 578 нм.

5. Отбор проб

5.1. Отбор проб — по ГОСТ 26313, подготовка проб — по ГОСТ 26671.

6. Проведение определения

6.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

Гидроокись калия по ГОСТ 24363, ч.д.а., раствор молярной концентрации c(KOH) = 10 моль/дм3.

Поливинилполипирролидон (код пищевой добавки E1202) с содержанием основного вещества не менее 95% по [1].

Лимонная кислота моногидрат, C_{6}H_{8}O_{7} \cdot H_{2}O , по ГОСТ 3652, ч.д.а.

Аскорбиновая кислота, C_{6}H_{8}O_{6} , по [2], [3], х.ч.

Формалин по ГОСТ 1625, раствор с объемной долей 5%.

3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразолий бромид (МТТ) с содержанием основного вещества не менее 95% по [1].

Феназинметосульфат (феназин/ФМС) с содержанием основного вещества не менее 95% по [1].

Аскорбатоксидаза (сухой лиофилизат/АО), E 1.10.3.3 с содержанием основного вещества не менее 95% по [1].

Метафосфорная кислота, (HPO_{4})_{n} , по ГОСТ 841, раствор массовой концентрации 15 г/дм3.

Дистиллированная вода по ГОСТ 6709.

Спектрофотометр, позволяющий проводить измерения при длине волны 578 нм, или фотометр фотоэлектрический с шириной спектральной полосы не более 10 нм и допустимой абсолютной погрешностью измерений не более +/- 1%, или спектрофотометр на ртутной лампе, позволяющий проводить измерения при 578 нм.

Кюветы из оптического стекла или полимерных материалов с длиной оптического пути 1 см.

Держатель для кювет.

Иономер или pH-метр с погрешностью измерения не более +/- 0,05 pH.

Пипетки номинальной вместимостью 0,01; 0,02; 0,1; 0,2; 0,5; 1; 2; 5 и 10 см3 с относительной погрешностью дозирования +/- 1% по ГОСТ 29227 1-го класса точности или дозаторы пипеточные с аналогичными или изменяемыми объемами доз с относительной погрешностью дозирования не более +/- 1% [4], или импортные с аналогичными характеристиками.

Колбы мерные по ГОСТ 1770 вместимостью 100, 250 и 1000 см3.

Стаканы по ГОСТ 25336 вместимостью 20 и 200 см3.

Цилиндры по ГОСТ 1770 вместимостью 50 и 100 см3.

Лабораторная воронка по ГОСТ 25336 диаметром 5 см.

Часы лабораторные.

Электроплитка.

Термометр жидкостный стеклянный по ГОСТ 28498 для диапазона температур от 0 °C до 100 °C с пределом допускаемой погрешности не более +/- 1 °C.

Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более +/- 0,1 мг.

Шпатели пластиковые или палочки стеклянные оплавленные длиной от 8 до 10 см диаметром 2 — 3 мм для перемешивания содержимого кювет при проведении ферментативного определения.

Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

Водяной или воздушный термостат, обеспечивающий поддержание заданной температуры ферментативной реакции в диапазоне 30 °C — 40 °C и контроль температуры с погрешностью не более 0,5 °C.

Допускается применять другие средства измерений с метрологическими характеристиками, вспомогательные устройства с техническими характеристиками, а также реактивы, в том числе готовые наборы реактивов, по качеству не ниже перечисленных в настоящем разделе.

6.2 Приготовление растворов реактивов <1>

<1> Допускается использование готового набора реактивов для ферментативного определения аскорбиновой кислоты производства «Roche Diagnostics/R-Biopharm AG» (номер набора 10 409 677 035) согласно схеме дозирования и смешивания реактивов, прилагаемой к набору. Указанный набор реактивов является рекомендуемым для применения. Эта информация дана для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает обязательное применение этого набора реактивов.

6.2.1. Фосфатно-цитратный буферный раствор (натрий фосфорнокислый однозамещенный молярной концентрации 0,2 моль/дм3, раствор моногидрата лимонной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм3, pH 3,6)

Растворяют 35,6 г натрия фосфорнокислого однозамещенного в мерной колбе вместимостью 1000 см3 в 500 см3 дистиллированной воды, полученной непосредственно перед приготовлением раствора реактива. После полного растворения реактива объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой.

Растворяют 21,0 г лимонной кислоты моногидрата в мерной колбе вместимостью 1000 см3 в 500 см3 свежей дистиллированной воды. После полного растворения реактива объем раствора в колбе доводят до метки дистиллированной водой.

Для приготовления фосфатно-цитратного буферного раствора с pH 3,6 смешивают 31,6 частей раствора натрия фосфорнокислого однозамещенного молярной концентрации 0,2 моль/дм3 и 68,4 частей раствора моногидрата лимонной кислоты молярной концентрации 0,1 моль/дм3.

Фосфатно-цитратный буферный раствор годен для применения в течение 1 мес при условии хранения при температуре 4 °C. Перед использованием необходимо контролировать pH и температуру фосфатно-цитратного буферного раствора, значения которых должны составлять соответственно 3,6 и 20 °C — 25 °C. Контроль температуры осуществляют термометром. При отклонении от требуемого значения pH фосфатно-цитратный буферный раствор готовят заново.

6.2.2 Рабочий раствор МТТ массовой концентрации 5 мг/см3

Растворяют 200 мг МТТ в 40 см3 фосфатно-цитратного буферного раствора с pH 3,6 (см. 6.2.1). Объем рабочего раствора МТТ достаточен для проведения примерно 20 отдельных определений аскорбиновой кислоты (см. 6.4).

Рабочий раствор МТТ годен для применения в течение 1 мес при условии хранения при температуре 4 °C (без доступа света!). Перед использованием необходимо контролировать pH и температуру рабочего раствора МТТ, значения которых должны составлять соответственно 3,6 и 20 °C — 25 °C. Контроль температуры осуществляют термометром. При отклонении от требуемого значения pH рабочий раствор МТТ готовят заново.

6.2.3 Рабочий раствор ФМС массовой концентрации 0,6 мг/см3

Растворяют 30 мг ФМС в 50 см3 дистиллированной воды, полученной непосредственно перед приготовлением раствора реактива и нагретой на электроплитке до 40 °C — 50 °C. Рабочий раствор ФМС годен для применения в течение 12 мес при условии хранения при температуре 4 °C. Незначительно красное окрашивание, которое может появиться при хранении рабочего раствора ФМС, не влияет на результаты ферментативного определения аскорбиновой кислоты.

6.2.4 Рабочий раствор АО (1700 U/см3) <1>

<1> Допускается использовать в определении готовые препараты аскорбатоксидазы. Аскорбатоксидаза, иммобилизованная на пластиковом шпателе на целлюлозной подложке (рабочая активностью фермента 17 U), входит в состав готового набора реактивов для определения аскорбиновой кислоты производства «Roche Diagnostics/R-Biopharm AG» (номер набора 10 409 677 035). Пример схемы ферментативного определения с использованием готового набора реактивов приведен в таблице 3. Указанный набор реактивов является рекомендуемым для применения. Эта информация дана для сведения пользователей настоящего стандарта и не означает, что стандарт устанавливает обязательное применение этого набора реактивов.

Навеску сухого лиофилизата, соответствующую активности фермента 1700 U, растворяют в 1,0 см3 фосфатно-цитратного буферного раствора с pH 3,6 (см. 6.2.1). Раствор готовят непосредственно перед использованием.

6.2.5 Раствор гидроокиси калия молярной концентрации c(KOH) = 10 моль/дм3

Растворяют 14,03 г гидроокиси калия в мерной колбе вместимостью 250 см3 в 150 см3 дистиллированной воды, полученной непосредственно перед приготовлением раствора реактива. После полного растворения реактива объем раствора в колбе доводят до метки.

6.2.6 Раствор формалина с объемной долей 5%

В химический стакан на 20 см3 вносят 3 см3 раствора формалина с объемной долей формальдегида 35%. Добавляют 4 см3 дистиллированной воды. Раствор перемешивают стеклянной палочкой и используют для подготовки пробы согласно 6.3.3.

6.2.7 Раствор метафосфорной кислоты массовой концентрации (HPO_{4})_{n} = 15\text{г}/\text{дм}^{3}

Растворяют 15 г метафосфорной кислоты массовой долей 33,5% в мерной колбе вместимостью 1000 см3 в 500 см3 дистиллированной воды, полученной непосредственно перед приготовлением раствора реактива. После полного растворения реактива объем раствора в колбе доводят до метки.

6.3. Подготовка пробы

Концентрированные соки и пюре перед определением восстанавливают согласно нормативным документам свежей дистиллированной водой до содержания растворимых сухих веществ согласно нормативным документам для соответствующего вида продукции.

6.3.1 Прозрачные или мутные слабоокрашенные пробы

С помощью раствора гидроокиси калия (10 моль/дм3) проводят корректировку pH пробы до значения 3,5 — 4,0. В зависимости от количества аскорбиновой кислоты пробу разбавляют дистиллированной водой или раствором метафосфорной кислоты (15 г/дм3) согласно таблице 1.

Таблица 1

6.3.2 Прозрачные или мутные сильноокрашенные пробы

Для удаления природных красящих пигментов к 10 см3 пробы добавляют 100 мг поливинилполипирролидона. Пробу перемешивают в течение 1 мин, затем фильтруют через бумажный складчатый фильтр.

Для определения аскорбиновой кислоты используют визуально прозрачный слабоокрашенный фильтрат в количестве 0,100 см3.

6.3.3 Подготовка проб, содержащих в повышенных количествах диоксид серы

К 10 см3 пробы добавляют одну каплю разбавленного раствора формалина объемной долей 5%. Пробу перемешивают и выдерживают 5 мин при комнатной температуре. Значение pH пробы при необходимости корректируют раствором гидроокиси калия (10 моль/дм3) и разбавляют согласно таблице 1. Мутные пробы дополнительно фильтруют (см. 6.3.1, 6.3.2). Сильноокрашенные пробы обрабатывают поливинилполипирролидоном согласно 6.3.2.

В определении по 4.5 используют от 0,200 до 0,500 см3 фильтрата.

6.4. Условия определения

Длина волны при фотометрическом измерении составляет 578 нм. Для измерения используют стеклянную кювету <1> с толщиной оптического слоя 1 см, равной ширине грани. Ферментативное определение проводят при температуре 37 °C. Общий объем инкубационной смеси в кювете составляет 2,70 см3.

<1> Вместо кювет из оптического стекла допускается использование одноразовых кювет из полимерных материалов.

Измерение оптической плотности инкубационной смеси проводят против воздуха (без кюветы в световом пути прибора). Проба в инкубационной смеси в кювете должна содержать от 0,5 до 20 мкг аскорбиновой кислоты в 0,1 — 1,6 см3 пробы.

6.5. Ферментативное определение

Ферментативное определение аскорбиновой кислоты в пробе проводят по схеме дозирования и смешивания реактивов, приведенной в таблице 2. Если в определении используют иммобилизованную АО и готовые наборы реактивов, дозирование и смешивание реактивов проводят по схеме таблицы 3.

Таблица 2

Схема дозирования и смешивания реактивов для ферментативного определения аскорбиновой кислоты

Таблица 3

7. Обработка результатов измерений

Значение разницы между конечным и начальным значениями оптической плотности контроля и пробы рассчитывают по формуле

\Delta A = (A_{2} - A_{1})_{\text{проб}} - (A_{2} - A_{1})_{\text{конт}} . (1)

Значение разницы оптических плотностей \Delta A должно составлять не менее 0,100.

Искомую массовую концентрацию аскорбиновой кислоты в исходной пробе, г/дм3, рассчитывают по общей формуле

c = \frac{V \cdot MW}{\epsilon \cdot d \cdot v \cdot 1000} \cdot \Delta A , (2)

v — объем пробы, см3;

MW — молекулярный вес аскорбиновой кислоты или аскорбата (176,13 и 175,12 г/моль соответственно);

d — длина оптического пути кюветы, см;

\epsilon — молярный коэффициент оптической плотности формазана (при измерении и длине волны 578 нм составляет 16,9 дм3/ммоль x см).

c = \frac{2,70 \cdot 176,13}{16,9 \cdot 1 \cdot 0,100 \cdot 1000} \cdot \Delta A = 0,2814 \cdot \Delta A . (3)

Если перед ферментативным определением проба подвергалась разбавлению, то результат, полученный по формуле (3), умножают на коэффициент разбавления F.

В случае концентрированных соков или пюре результат определения выражают в г/100 г продукта. Расчет осуществляют с учетом навески, взятой для получения восстановленного продукта (см. 6.3), по формуле

где c — массовая концентрация аскорбиновой кислоты в исследованной пробе, рассчитанная по формуле (2), г/дм3;

m — навеска концентрированного сока или пюре, взятая для получения восстановленного продукта (см. 6.3), г.

8. Дополнительные указания

8.1. Факторы, влияющие на определение

Если общая разница оптических плотностей \Delta A менее 0,100, то необходимо повторно провести определение, используя бо́льшую навеску или увеличенный объем пробы, дозируемой в инкубационную смесь (до 1,490 см3 по схеме дозирования таблицы 2 или до 1,500 см3 по схеме дозирования таблицы 3). В этом случае объем воды, добавляемой в кювету, должен быть уменьшен на соответствующее значение для сохранения общего объема инкубационной смеси (2,70 см3) в кювете с неизменными контролем и пробой. Увеличенный объем пробы необходимо принимать во внимание при расчете конечного результата согласно формуле (3).

8.2. Специфичность определения

Метод специфичен для определения общей аскорбиновой кислоты, включающей D- и L-изомеры.

В анализе коммерческих препаратов аскорбиновой кислоты (например, витаминов) в свежеприготовленных растворах можно ожидать, что степень повторного нахождения искомого вещества составит 94% — 100%. На качество результатов определения степени повторного нахождения влияет срок хранения коммерческого препарата аскорбиновой кислоты и растворитель, используемый для получения растворов. Рекомендуется использовать раствор метафосфорной кислоты (см. 4.1) с доведением pH пробы до 3,5 — 4,0.

На стабильность аскорбиновой кислоты в водных растворах сильно влияет присутствие ионов металлов, например железа и меди, а также наличие в пробе кислорода. В этом случае ожидаемая степень повторного нахождения будет составлять менее 100%, что обусловливается частичной потерей аскорбиновой кислоты.

С помощью настоящего ферментативного метода нельзя определить L-аскорбилпальмитат, так как в ходе щелочного гидролиза происходит спонтанное разрушение свободной аскорбиновой кислоты.

8.3. Причины возможных ошибок при проведении определения

Сахароза, содержащаяся в соках и соковой продукции, не мешает определению, если ее концентрация в кювете не превышает 30 мг.

Определению аскорбиновой кислоты мешает D-сорбит (при концентрации более 20 мг в кювете), который ингибирует аскорбатоксидазу, а также этанол в высоких концентрациях, превышающих 100 мг/кювета. Влияние большинства мешающих факторов на результат определения исключается путем увеличения длительности инкубации контрольной пробы с аскорбатоксидазой до 10 мин.

Диоксид серы в высоких концентрациях, превышающих 50 мкг/кювета, взаимодействует с МТТ и ФМС и вызывает тем самым медленно текущую реакцию. В этом случае пробу подвергают предварительной обработке согласно 6.3.3.

Ионы металлов в концентрациях более 100 мкг/кювета могут понизить pH системы и тем самым ингибировать действие аскорбатоксидазы.

Нитрит, который может содержаться в некоторых овощных соках, не мешает определению. Однако его присутствие в системе может привести к спонтанному распаду аскорбиновой кислоты.

Ионы оксалата в концентрациях от 30 мкг/кювета способны оказывать значительное ингибирующее действие на аскорбатоксидазу. Высокую концентрацию оксалата устраняют путем добавления ионов кальция до концентрации 30 мкг/кювета и выше, а также созданием в системе слабокислой среды (pH 5 — 6).

8.4. Выявление и устранение мешающих факторов при проведении анализа. Контроль ферментативного определения

8.4.1 Общие указания

Если разница оптических плотностей \Delta A менее 0,100, следует провести повторную подготовку пробы к определению, увеличив ее навеску или уменьшив разбавление. Значение pH пробы в любом определении должно находиться в интервале от 3,5 до 4,0.

8.4.2 Операции с контрольной пробой

Содержимое кюветы с контрольной пробой интенсивно перемешивают стеклянной или пластиковой палочкой (или шпателем с иммобилизованной \text{АО}^{2} ) в течение предварительной реакции.

После внесения рабочего раствора ФМС реакция проявляет повышенную чувствительность к свету, поэтому инкубирование при температуре 37 °C необходимо проводить в полной темноте. Для чего кюветы, находящиеся, например, в держателе, помещенном в водяной или воздушный термостат, накрывают плотной светонепроницаемой тканью. Попадание света приводит к возникновению нежелательной медленно текущей реакции.

В случае медленно текущей реакции, вызванной попаданием света, значение оптической плотности A_{2} системы определяют в соответствии с рекомендациями 6.4.5. Так как кюветы с пробой и контрольной пробой содержат одинаковый объем инкубационной смеси, медленно текущие реакции в них идентичны. От экстраполяции в этом случае можно отказаться. Однако необходимо принимать во внимание, что оптическую плотность A_{2} в кювете с контрольной пробой и в кювете с пробой необходимо измерять непосредственно одну за другой.

Если разница оптических плотностей (A_{2} - A_{1}) контрольной пробы менее 0,020, то следует соблюдать следующие правила: рабочий раствор МТТ должен храниться в темноте; при использовании рабочего раствора МТТ его нельзя подвергать прямому облучению солнечным или электрическим светом; содержимое кюветы с контрольной пробой необходимо интенсивно перемешивать стеклянной или пластиковой палочкой (или шпателем с иммобилизованной АО) с целью насыщения инкубационной смеси воздухом; после внесения в инкубационную смесь рабочего раствора ФМС кюветы с контрольной пробой и пробой защищают от солнечного или электрического света.

8.4.3 Стабильность аскорбиновой кислоты

Водные растворы аскорбиновой кислоты нестабильны. При анализе твердых проб рекомендуется проводить выделение аскорбиновой кислоты раствором метафосфорной кислоты концентрации 15 г/дм3. После экстрагирования pH вытяжки корректируют раствором гидроокиси калия (10 моль/дм3) до 3,5 — 4,0.

Для стабилизации аскорбиновой кислоты не рекомендуется применять растворы оксалатов, так как их ионы ингибируют аскорбатоксидазу.

Разбавление пробы дистиллированной водой или метафосфорной кислотой проводят непосредственно перед определением. В этом случае нет необходимости в проведении корректировки pH до 3,5 — 4,0.

8.4.4 Медленно текущие реакции

Из практики применения метода следует, что оптическая плотность инкубационной смеси может увеличиваться даже после окончания ферментативной реакции (возникает медленно текущая реакция). В этом случае расчет значения конечной оптической плотности проводят экстраполированием на момент внесения в инкубационную смесь рабочего раствора ФМС (см. 6.2.3).

Экстраполяцию проводят графическим способом или согласно следующей схеме: по истечении 15 мин после добавления в кюветы рабочего раствора ФМС (см. 6.2.3) проводят измерение оптической плотности (A_{2}) , измерения повторяют каждые две минуты до тех пор, пока приращение \Delta A/\Delta t не будет принимать постоянные значения. Измерения останавливают и действительное значение конечной оптической плотности инкубационной смеси на момент внесения рабочего раствора ФМС (см. Приложение А) рассчитывают по формуле

A_{2}(t_{0}) = A_{2}(t_{15}) - \frac{15 \cdot \Delta A/\Delta t}{2} . (5)

Затем по формуле (1) рассчитывают значение разницы между значениями конечной и начальной оптической плотности контроля и пробы.

8.5. Контроль ферментативного определения

Контроль определения осуществляют при необходимости проверки качества реактивов, оценки уровня квалификации персонала лаборатории, осуществляющего анализ аскорбиновой кислоты, а также для выявления и устранения случайных и систематических ошибок определения.

8.5.1 Приготовление стандартного раствора аскорбиновой кислоты

Берут навеску в 200 мг аскорбиновой кислоты и количественно переносят ее в мерную колбу вместимостью 100 см3. Объем раствора в колбе доводят до метки метафосфорной кислотой (15 г/дм3), затем тщательно перемешивают. Переносят 10 см3 приготовленного раствора в другую мерную колбу вместимостью 100 см3, затем доводят объем раствора до метки метафосфорной кислотой (15 г/дм3). Содержимое колбы тщательно перемешивают.

Схема дозирования и смешивания реактивов для ферментативного

По формуле (1) рассчитывают разницу значений оптических плотностей для кювет «Проба + стандарт (внутренний)», «Стандарт (внешний)» и «Проба». Степень повторного нахождения (ПН, %) для аскорбиновой кислоты, содержащейся в стандартном растворе (см. 6.5.1), рассчитывают по формуле

\text{ПН } = \frac{2 \cdot \Delta A_{\text{проба} + \text{стандарт}} - \Delta A_{\text{проба}}}{\Delta A_{\text{стандарт}}} \cdot 100 . (6)

Ферментативное определение проведено без ошибок, если степень повторного нахождения аскорбиновой кислоты находится в интервале от 95% до 100%.

8.6. Граница чувствительности метода

Граница чувствительности метода составляет 0,30 мг/дм3 при \Delta A = 0,015 (при 578 нм) и максимальном объеме пробы v в 1,490 (или 1,600) см3.

8.7. Линейность определения

Линейность определения сохраняется в интервале от 0,5 мкг аскорбиновой кислоты в кювете (0,3 мг аскорбиновой кислоты/дм3 пробы; объем пробы — v = 1,600 см3) до 20 мкг аскорбиновой кислоты в кювете (0,2 г аскорбиновой кислоты/дм3 пробы; объем пробы v = 0,100 см3).

9. Метрологические характеристики метода

В параллельном определении возможны различия между значениями оптических плотностей, которые будут составлять от 0,005 до 0,010. Это соответствует объему пробы v = 0,100 см3 и концентрации аскорбиновой кислоты от 1,5 до 3 мг/дм3. При использовании в определении навески пробы в 1 г/100 см3 (= 10 г/дм3) ожидаемые различия между параллельными определениями составят 0,015 — 0,030 г/100 г. Метрологические характеристики метода приведены в Приложении Б.

Приложение А (справочное)

ИНФОРМАЦИЯ О МЕДЛЕННО ТЕКУЩИХ РЕАКЦИЯХ

Медленно текущая реакция начинается в отправной точке суммарной реакции (рисунок А.1). В этот момент времени в инкубационной смеси отсутствуют продукты ферментативной реакции, в том числе продукты медленно текущей реакции, которые могли бы привести к изменению оптической плотности системы. Для количественного определения общей разницы оптических плотностей значение конечной оптической плотности инкубационной смеси экстраполируют на момент начала основной реакции — внесение фермента или добавление рабочего реактива (рабочего раствора ФМС в ферментативном определении аскорбиновой кислоты). Контроль медленно текущей реакции позволяет получить только один количественный результат — значение оптической плотности в начальной точке суммарной реакции (основная + побочная реакции). Присутствие в инкубационной смеси медленно текущей реакции регистрируют с момента завершения основной реакции.

Приложение Б (справочное)

Метрологические характеристики метода, полученные в трех лабораториях, приведены в таблицах Б.1 и Б.2.

БИБЛИОГРАФИЯ