ГОСТ 9.052-88. Межгосударственный стандарт. Единая система защиты от коррозии и старения. Масла и смазки. Методы лабораторных испытаний на стойкость к воздействию плесневых грибов
(утв. и введен в действие Постановлением Госстандарта СССР от 25.03.1988 № 754)
Примечание
С 1 июля 2003 года до вступления в силу технических регламентов акты федеральных органов исполнительной власти в сфере технического регулирования носят рекомендательный характер и подлежат обязательному исполнению только в части, соответствующей целям, указанным в пункте 1 статьи 46 Федерального закона от 27.12.2002 № 184-ФЗ. Документ введен в действие с 1 января 1989 года. Взамен ГОСТ 9.052-75.
Утвержден и введен в действие Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 25 марта 1988 г. № 754
ЕДИНАЯ СИСТЕМА ЗАЩИТЫ ОТ КОРРОЗИИ И СТАРЕНИЯ
МЕТОДЫ ЛАБОРАТОРНЫХ ИСПЫТАНИЙ НА СТОЙКОСТЬ К ВОЗДЕЙСТВИЮ ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ
Unified system of corrosion and ageing protection. Oils and greases. Laboratory test methods for mould resistance
75.100 ОКСТУ 0009
Дата введения 1 января 1989 года
ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ
1. РАЗРАБОТАН И ВНЕСЕН Министерством высшего и среднего специального образования СССР.
2. УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 25 марта 1988 г. № 754.
4. ССЫЛОЧНЫЕ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ
| Обозначение НТД, на который дана ссылка | Номер пункта, подпункта, приложения |
|---|---|
| ГОСТ 9.048-89 | 1.3.3, 1.4, 1.5.1, 1.5.2, 1.5.3, 1.6.1, 2.4, 2.6.1, 3.4, 3.6.1, 4.4, приложение |
| ГОСТ 61-75 | Приложение |
| ГОСТ 1770-74 | Приложение |
| ГОСТ 2517-85 | 1.2.1 |
| ГОСТ 4523-77 | Приложение |
| ГОСТ 6709-72 | Приложение |
| ГОСТ 10652-73 | Приложение |
| ГОСТ 16317-87 | Приложение |
| ГОСТ 25336-82 | Приложение |
| ГОСТ 29329-92 | Приложение |
5. Ограничение срока действия снято по протоколу № 3-93 Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (ИУС 5-6-93)
Настоящий стандарт распространяется на масла и смазки и устанавливает методы лабораторных испытаний на стойкость к воздействию плесневых грибов:
1 — для установления грибостойкости масел и смазок при отсутствии минеральных и органических загрязнений;
2 — для установления грибостойкости смазок в условиях, имитирующих минеральные загрязнения;
3 — для установления грибостойкости масел в условиях, имитирующих минеральные загрязнения;
4 — для установления грибостойкости масел и смазок в условиях, имитирующих минеральные и органические загрязнения.
Смазки, применяемые для оптических приборов, испытывают только методом 1.
Методы применяют при испытании масел и смазок, к которым в стандартах или технических условиях предъявляют требования грибостойкости.
1. МЕТОД 1
1.1. Сущность метода заключается в выдерживании образцов, зараженных водной суспензией спор грибов, в условиях, оптимальных для развития грибов, без дополнительного источника минерального и органического питания.
1.2 Отбор образцов
1.2.1. Масла и смазки отбирают по ГОСТ 2517 массой 10 — 15 г.
1.2.2. Образцами являются масла и смазки в состоянии поставки, без специальной очистки и стерилизации.
1.2.3 Количество параллельных образцов должно быть не менее пяти.
1.3 Виды грибов
1.3.1 Для испытаний применяют чистые культуры следующих видов плесневых грибов:
Penicillium cyclopium Westling
Scopulariopsis brevicaulis (Sacc.) Bainier
1.3.2. Культуры грибов получают в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов АН СССР, поддерживают периодическим пересевом и выращивают непосредственно перед испытаниями.
1.3.3. Пересев, выращивание и хранение культур грибов — по ГОСТ 9.048.
1.4 Аппаратура, материалы и реактивы — по ГОСТ 9.048.
1.5 Подготовка к испытаниям
1.5.1 Посуду и материалы готовят по ГОСТ 9.048.
1.5.2. Среды для выращивания, хранения культур грибов и для испытаний готовят по ГОСТ 9.048.
Рецептура сред приведена в таблице.
1.5.3. Чистые культуры грибов пересевают и выращивают по ГОСТ 9.048, используя грибы, приведенные в п. 1.3.1.
1.5.4. Для размещения образцов масел в чашку Петри наливают 20 — 30 см3 среды 3 и дают ей застыть. В застывшей среде просверливают пять лунок глубиной около 5 мм с помощью стерильного сверла диаметром 10 мм и наливают образцы масел на 1 мм ниже уровня среды.
Образцы смазок наносят на предметные стекла, покрывая всю поверхность слоем 1,5 — 2,0 мм, и помещают в чашки Петри.
1.5.5. Контроль жизнеспособности спор грибов проводят по ГОСТ 9.048.
Для контроля жизнеспособности спор грибов в чашку Петри наливают среду 1 или 4 в количестве 20 — 30 см3 и дают ей застыть.
1.6 Проведение испытаний
1.6.1. Водную суспензию спор грибов готовят по ГОСТ 9.048, используя грибы, выращенные, как указано в п. 1.5.3.
1.6.2. Предметные стекла в чашках Петри, чашки Петри с образцами масел помещают в бокс. Поверхность образцов заражают водной суспензией спор грибов с помощью пульверизатора, не допуская слияния капель.
1.6.3. Образцы масел и смазок после заражения выдерживают 1 — 2 ч при температуре (25 +/- 10) °C.
1.6.4. Предметные стекла в чашках Петри и чашки Петри с зараженными образцами и средами помещают в эксикатор, на дно которого налита вода. Эксикатор устанавливают в термостат с температурой (29 +/- 2) °C.
1.6.5 Образцы выдерживают в термостате 56 сут.
1.6.6. Через 3 — 7 сут после начала испытаний осматривают контрольную чашку Петри. Если на поверхности среды развитие грибов не наблюдается, споры грибов считают нежизнеспособными. Испытания прекращают и повторяют их на новых образцах с вновь приготовленной суспензией спор из новой партии грибов.
1.6.7. Через 28 сут производят промежуточный осмотр образцов. Испытания образцов, на которых обнаруживают развитие грибов, прекращают.
1.6.8. По окончании испытаний предметные стекла в чашках Петри и чашки Петри извлекают из эксикатора и осматривают образцы.
1.7 Обработка результатов
1.7.1. Образцы смазок и масел осматривают под микроскопом при 50 — 60-кратном увеличении.
1.7.2. Масла и смазки считают грибостойкими при отсутствии развития грибов на всех испытанных образцах.
2. МЕТОД 2
2.1. Сущность метода заключается в выдерживании образцов, зараженных суспензией спор грибов в водном растворе минеральных солей, в условиях, оптимальных для развития грибов, на среде с дополнительным источником минерального питания.
2.2 Отбор образцов — по п. 1.2.
2.3 Виды грибов — по п. 1.3.
2.4 Аппаратура, материалы и реактивы — по ГОСТ 9.048.
2.5. Подготовка к испытаниям — по пп. 1.5.1 - 1.5.3, 1.5.5.
2.5.1. Для размещения образцов смазок среду 2 наливают в чашку Петри в количестве 20 — 30 см3 и дают ей застыть.
2.6 Проведение испытаний
2.6.1. Суспензию спор грибов в среде 5 готовят по ГОСТ 9.048.
2.6.2. Смазки наносят скальпелем в количестве пяти образцов размером 10·10 мм толщиной 1,5 — 2,0 мм на поверхность среды в чашку Петри, подготовленную, как указано в п. 2.5.1.
2.6.3. Дальнейший порядок проведения испытаний соответствует требованиям пп. 1.6.2 - 1.6.4.
2.6.4 Образцы выдерживают в течение 28 сут.
2.6.5. Дальнейший порядок проведения испытаний — по пп. 1.6.6 - 1.6.8 с промежуточным осмотром образцов через 14 сут.
2.7. Обработка результатов — по пп. 1.7.1, 1.7.2.
3. МЕТОД 3
3.1. Сущность метода заключается в выдерживании образцов, зараженных суспензией спор грибов в водном растворе минеральных солей, в условиях, оптимальных для развития грибов, на среде с дополнительным источником минерального питания.
3.2 Отбор образцов — по п. 1.2.
3.3 Виды грибов — по п. 1.3.
3.4 Аппаратура, материалы и реактивы — по ГОСТ 9.048.
3.5. Подготовка к испытаниям — по пп. 1.5.1 - 1.5.3 и 1.5.5.
3.5.1. Для размещения образцов масел готовят пробирки с 2 — 3 см3 суспензии спор грибов в среде 5.
3.5.2 Контролем служит суспензия спор грибов в среде 5.
3.6 Проведение испытаний
3.6.1. Суспензию спор грибов в среде 5 готовят по ГОСТ 9.048.
3.6.2. Образцы масел в количестве 2 см3 вносят не менее чем в пять пробирок, приготовленных, как указано в п. 3.5.1.
3.6.3. Пробирки помещают в наклонном положении под углом 30° и выдерживают в термостате при температуре (29 +/- 2) °C.
3.6.4 Пробирки с образцами выдерживают в термостате 10 сут.
3.6.5. Через 5 и 7 сут осматривают образцы. Допускается отбирать пробы минеральной среды из пробирок для оценки грибостойкости биолюминесцентным методом, при этом пробирки с образцами выдерживают в термостате 3 и 5 сут.
При появлении признаков развития грибов в образцах испытания прекращают.
3.6.6. По окончании испытаний пробирки с образцами извлекают из термостата и осматривают невооруженным глазом или с помощью лупы при 2,5 — 5,0-кратном увеличении.
3.7 Обработка результатов
3.7.1. Масла считаются грибостойкими, если отсутствует развитие грибов на всех испытанных образцах (отсутствует пленка на границе раздела среда-масло, в пробирках среда прозрачна и не пигментирована, нет осадка).
3.7.2. Масла считаются не стойкими к плесневым грибам, если на образцах наблюдается развитие грибов, признаком которого служит образование пленки на границе раздела среда-масло, помутнение и пигментация среды, образование осадка.
3.7.3. Допускается оценивать грибостойкость масел биолюминесцентным методом, приведенным в приложении.
4. МЕТОД 4
4.1. Сущность метода заключается в выдерживании образцов, зараженных суспензией спор грибов в водном растворе минеральных солей, в условиях, оптимальных для развития грибов, на среде с дополнительным источником минерального и органического питания.
4.2 Отбор образцов — по п. 1.2.
4.3 Виды грибов — по п. 1.3.
4.4 Аппаратура, материалы и реактивы — по ГОСТ 9.048.
4.5. Подготовка к испытаниям — по пп. 1.5.1 - 1.5.3, 1.5.5.
4.5.1. Для размещения образцов смазок готовят чашки Петри, как указано в п. 2.5.1, используя среду 1 или 4.
4.5.2. Для размещения образцов масел готовят лунки, как указано в п. 1.5.4, используя среду 1 или 4.
4.6 Проведение испытаний — по п. 2.6.
4.6.1. Образцы выдерживают в термостате в условиях, приведенных в п. 1.6.4, 14 сут.
4.6.2. Промежуточный осмотр образцов производят через 7 сут после начала испытаний.
4.7. Обработка результатов — по пп. 1.7.1 и 1.7.2.
5. ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ — по ГОСТ 9.048
БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫЙ МЕТОД ОЦЕНКИ ГРИБОСТОЙКОСТИ
Сущность метода заключается в определении количества внутриклеточной аденозин-5'-трифосфорной кислоты динатриевой соли (АТФ) в минеральной среде после испытания масел на грибостойкость (п. 3.6.5) с помощью специфической ферментативной хемилюминесцентной реакции с использованием люциферин-люциферазной системы светляков. Интенсивность излучаемого свечения прямо пропорциональна концентрации АТФ. Концентрация АТФ пропорциональна количеству живых клеток, так как ее содержание во всех типах живых клеток примерно одинаково и составляет 1 — 10 мг/г сухого веса. Этот факт является основой биолюминесцентного метода определения биомассы.
1. Аппаратура, материалы и реактивы
Хемилюминометр медицинский ДЛИ 31.560.000, предназначенный для измерения интенсивности сверхслабого свечения в области спектра 400 — 600 нм. Допускается использовать другие приборы аналогичного назначения, обеспечивающие измерение световых потоков от 104 до 108 квант/с.
Весы для статического взвешивания по ГОСТ 29329.
Термостат, обеспечивающий температуру нагрева до 200 °C.
Холодильник бытовой электрический по ГОСТ 16317.
Дозатор для отбора проб 0,1 см3.
Пробирки стеклянные по ГОСТ 25336.
Колбы цилиндрические мензурные вместимостью 25 см3 по ГОСТ 1770.
Пипетки вместимостью 1, 10 см3.
Аденозин-5'-трифосфорной кислоты динатриевая соль, 3-водная (АТФ).
Диметилсульфоксид (ДМСО), х.ч.
Трис-(оксиметил)-аминометан, х.ч.
Кислота уксусная, х.ч. по ГОСТ 61.
Магний сернокислый, 7-водный, х.ч. по ГОСТ 4523.
Соль динатриевая этилендиамин-N,N,N',N'-тетрауксусной кислоты, 2-водная (трилон Б) (ЭДТА) по ГОСТ 10652.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
2. Подготовка к испытаниям
2.1 Стерилизуют посуду по ГОСТ 9.048.
2.2. Готовят раствор АТФ 1 ммоль/дм3: 13,8 мг АТФ помещают в мерную колбу вместимостью 25 см3, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают до полного растворения. Раствор АТФ 1 ммоль/дм3 разливают на порции объемом 1 см3 и хранят при температуре минус 20 °C. В замороженном виде раствор АТФ допускается хранить не более 3 мес.
2.3. Готовят стандартный раствор АТФ 10 мкмоль/дм3: порцию раствора АТФ 1 ммоль/дм3 (по п. 2.2) размораживают, отбирают с помощью дозатора 0,1 см3 раствора и помещают его в пробирку, содержащую 10 см3 дистиллированной воды. Раствор АТФ 10 мкмоль/дм3 готовят непосредственно перед применением.
2.4. Готовят 20%-ный раствор уксусной кислоты: 10 см3 уксусной кислоты разбавляют 40 см3 дистиллированной воды.
2.5. Готовят 0,1 моль/дм3 трис-ацетатный буферный раствор с pH — 7,6, содержащий 10 ммоль/дм3 сернокислого магния, 2 ммоль/дм3 ЭДТА: в мерную колбу вместимостью 50 см3 загружают 0,605 г трис-(оксиметил)-аминометана, 0,123 г сернокислого магния, 0,036 г ЭДТА, доводят до метки дистиллированной водой и перемешивают до полного растворения. Затем все содержимое колбы переносят в стакан вместимостью 100 см3 и титруют 20%-ным раствором уксусной кислоты до pH — 7,8.
2.6. Готовят раствор люциферазы: 10 мг люциферазы растворяют в 10 см3 0,1 моль/дм3 трис-ацетатном буферном растворе (п. 2.5). Приготовленный раствор люциферазы хранят во льду.
2.7. Готовят раствор люциферина: 3 мг люциферина растворяют в 10 см3 0,1 моль/дм3 трис-ацетатного буферного раствора (п. 2.5).
2.8. Готовят экстракт клеток: отбирают из пробирок с образцами после выдержки их в термостате 3 и 5 сут (п. 3.6.5) пробу минеральной среды объемом 0,1 см3 и добавляют ее в пробирку к 0,9 см3 диметилсульфоксида (ДМСО). Смесь перемешивают встряхиванием в течение 1 — 2 мин. Экстракт пригоден для анализа в течение 1 сут.
3. Проведение испытаний
3.1. Помещают в кювету люминометра с помощью дозатора последовательно 0,1 см3 раствора люциферина, 0,1 см3 раствора люциферазы, 0,7 см3 трис-ацетатного буферного раствора и регистрируют интенсивность фонового свечения Iфон в милливольтах.
3.2. Добавляют в ту же кювету дозатором 0,1 см3 экстракта клеток (п. 2.8), перемешивают и регистрируют сигнал интенсивности люминесценции I1.
3.3. Добавляют в ту же кювету 0,02 см3 стандартного раствора АТФ (п. 2.3) и регистрируют сигнал интенсивности люминесценции I2.
4. Обработка результатов
4.1 Интенсивность люминесценции образца (Iобр) в милливольтах вычисляют по формуле
4.2 Интенсивность люминесценции стандартного раствора АТФ (Iст) в милливольтах вычисляют по формуле
4.3 Концентрация АТФ [АТФ]обр в микромолях в образце вычисляют по формуле
[\text{АТФ }]_{\text{обр}} = \frac{I_{\text{обр}} \cdot V_{1} \cdot V_{\text{ст}}[\text{АТФ }]_{\text{ст}} \cdot 10}{I_{c\text{т}} \cdot V \cdot V_{2}} , (3)
где V — объем экстракта клеток, равный 0,1 см3;
V1 — объем реакционной смеси до добавления стандартного раствора АТФ, равный 1 см3;
V2 — объем реакционной смеси после добавления стандартного раствора АТФ, равный 1,02 см3;
Vст — объем добавленного стандартного раствора АТФ, равный 0,02 см3;
[АТФ]ст — концентрация АТФ в стандартном растворе, равная 10 мкмоль;
10 — коэффициент, учитывающий разбавление пробы образца при экстракции клеток диметилсульфоксидом в 10 раз.
При упрощении формула (3) приобретает вид:
\text{АТФ}_{\text{обр}} = \frac{I_{\text{обр}}}{I_{\text{ст}}} \cdot 19,6.
4.4. Масла являются грибостойкими, если концентрация АТФ меньше или равна 10-7 моль, масла не грибостойки, если концентрация АТФ в образцах больше 10-7 моль.