ГОСТ 34230-2017. Межгосударственный стандарт. Продукция соковая. Определение свободных аминокислот методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
(введен в действие Приказом Росстандарта от 12.12.2017 № 1903-ст)
Примечание
Документ введен в действие с 1 января 2019 года.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 12 декабря 2017 г. № 1903-ст
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Juice products. Determination of free amino acids by high performance liquid chromatography method
Дата введения 1 января 2019 года
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены в ГОСТ 1.0-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2015 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Некоммерческой организацией «Российский союз производителей соков» (РСПС) при участии Акционерного общества «Мултон» (АО «Мултон») и Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи» (ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии»)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 ноября 2017 г. № 52-2017)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 12 декабря 2017 г. № 1903-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 34230-2017 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2019 г.
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)
1. Область применения
Настоящий стандарт распространяется на соковую продукцию из фруктов и овощей и устанавливает метод высокоэффективной жидкостной обращенно-фазовой хроматографии для определения массовой концентрации (массовой доли) свободных аминокислот:
- L-Аспарагиновой кислоты;
- L-Глутамина;
- L-Глутаминовой кислоты;
- L-Серина;
- L-Гистидина;
- L-Треонина;
- L-Аспарагина;
- L-Аланина;
- L-Аргинина;
- L-Тирозина;
- \gamma - \text{Аминомасляной} кислоты;
- L-Метионина;
- L-Валина;
- L-Изолейцина;
- L-бета-Фенилаланина;
- L-Лейцина;
- L-Лизина;
- Глицина;
- L-Пролина;
- L(+)-Орнитина.
Диапазон измерений массовой концентрации (массовой доли) свободных аминокислот составляет от 5,0 до 20,0 мг/дм3 (млн-1) без учета разбавления и концентрирования проб.
Примечание - 1 млн-1 соответствует 1 мг/кг.
2. Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019-79 <*> Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
<*> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009.
ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия
ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 199-78 Реактивы. Натрий уксуснокислый 3-водный. Технические условия
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ ISO 3696-2013 <**> Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы контроля
<**> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 52501-2005 (ИСО 3696:1987) «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
ГОСТ 4199-76 Реактивы. Натрий тетраборнокислый 10-водный. Технические условия
ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ ИСО 5725-6-2003 <***> Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике
<***> В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002.
ГОСТ 5962-2013 Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ ISO 7886-1-2011 Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования
ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
ГОСТ 21400-75 Стекло химико-лабораторное. Технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 22967-90 Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 26313-2014 Продукты переработки фруктов и овощей. Правила приемки и методы отбора проб
ГОСТ 28311-89 Дозаторы медицинские лабораторные. Общие технические требования и методы испытаний
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3. Сущность метода
Метод основан на переводе свободных аминокислот во флуоресцирующие соединения предколоночной дериватизацией и количественном анализе полученных производных с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенно-фазовых хроматографических колонках, заполненных сорбентом C18 с размером частиц менее 5 мкм с использованием флуориметрического детектора.
4. Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы и материалы
4.1 Хроматограф жидкостный с флуориметрическим детектором (диапазон длин волн возбуждения 200 — 890 нм, эмиссии 210 — 900 нм), относительным среднеквадратическим отклонением выходного сигнала, не более:
- по площади пика — 1%;
- по времени удерживания — 0,3%;
- по площади пика за 8 ч непрерывной работы — 2%;
- по времени удерживания за 8 ч непрерывной работы — 2%.
4.2 Колонка хроматографическая C18 <*> длиной 250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная обращенно-фазовым сорбентом C18 с энд-кэпингом с размером частиц менее 5 мкм.
<*> Примером является хроматографическая колонка Zorbax SB C18 компании Agilent. Информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой указанного продукта.
4.3 Колонка защитная (предколонка), размеры защитной колонки — 10 x 4,6 мм, заполненная тем же обращенно-фазовым сорбентом.
4.4 Весы неавтоматического действия специального класса точности по ГОСТ OIML R 76-1, пределом допускаемой абсолютной погрешности измерения массы +/- 0,001 г.
4.5 Иономер (pH-метр) с пределом абсолютной погрешности измерения +/- 0,1 ед. pH.
4.6 Пипетки градуированные лабораторные стеклянные 1-1-2-1, 1-1-2-2, 1-1-2-5 и 1-1-2-10 по ГОСТ 29227.
4.7 Посуда мерная лабораторная стеклянная 2-го класса точности по ГОСТ 1770:
4.8 Посуда лабораторная стеклянная по ГОСТ 25336:
- воронки В-56-80 ХС, В-75-80 ХС, В-75-110 ХС, В-100-150 ХС;
- стаканы любого типа исполнения 1 вместимостью 50, 100, 1000 см3;
- пробирки вместимостью 10 и 20 см3.
4.9 Пробирки полимерные центрифужные конические с завинчивающейся крышкой вместимостью 15 см3.
4.10 Палочки стеклянные длиной 220 мм и диаметром 5 мм, выполненные из химически стойкого стекла любого класса по ГОСТ 21400.
4.11 Фильтры мембранные с насадкой на шприц с размером пор 0,20 и 0,45 мкм.
4.12 Фильтры мембранные диаметром 47 мм с размером диаметра пор мембраны 0,20 и 0,45 мкм.
4.13 Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.
4.14 Установка для фильтрации и дегазации жидкостей.
4.15 Виалы вместимостью 2 см3 для автоматического ввода проб и вставки в виалы для микроколичеств проб.
4.16 Микрошприц вместимостью 250 мм3.
4.17 Шприц медицинский вместимостью 5 см3 многократного применения по ГОСТ 22967 или однократного применения по ГОСТ ISO 7886-1.
4.18 Микродозаторы пипеточные одноканальные переменного объема от 20 до 200 мм3 с соответствующими наконечниками (без воздушного промежутка) по ГОСТ 28311.
4.19 Склянки из темного стекла с завинчивающейся крышкой.
4.20 Центрифуга, обеспечивающая фактор разделения (g-фактор) не менее 800.
4.21 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709 или вода по ГОСТ ISO 3696 1-й степени чистоты.
4.22 Ацетонитрил, ос.ч., имеющий оптическую плотность не более 0,02 при 200 нм.
4.23 Кислота уксусная ледяная по ГОСТ 61, х.ч.
4.24 Тетрагидрофуран (далее — ТГФ) для хроматографии, с массовой долей основного вещества не менее 99,9% и показателем преломления nD в пределах от 1,3439 до 1,3440.
4.25 Спирт этиловый по ГОСТ 5962.
4.26 о-Фталевый альдегид с массовой долей основного вещества не менее 97%.
4.27 3-Меркаптопропионовая кислота с массовой долей основного вещества не менее 99%.
4.28 9-Флуоренилметоксикарбонилхлорид с массовой долей основного вещества не менее 97%.
4.29 Натрий тетраборнокислый 10-водный по ГОСТ 4199, х.ч.
4.30 Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х.ч.
4.31 Натрий уксуснокислый 3-водный по ГОСТ 199, ч.д.а.
4.32 Аминокислоты:
- L-Аспарагиновая кислота, массовая доля основного вещества не менее 98,0%;
- L-Глутамин, массовая доля основного вещества не менее 99,0%;
- L-Глутаминовая кислота, массовая доля основного вещества не менее 99,0%;
- L-Серин, массовая доля основного вещества не менее 99,0%;
- L-Гистидин, массовая доля основного вещества не менее 99,0%;
- L-Треонин, массовая доля основного вещества не менее 98,0%;
- L-Аспарагин, массовая доля основного вещества не менее 98,0%;
- L-Аланин, массовая доля основного вещества не менее 98,0%;
- L-Аргинин, массовая доля основного вещества не менее 98,0%;
- L-Тирозин, массовая доля основного вещества не менее 98,0%;
- \gamma - \text{Аминомасляная} кислота, массовая доля основного вещества не менее 99,0%;
- L-Метионин, массовая доля основного вещества не менее 98,0%;
- L-Валин, массовая доля основного вещества не менее 98,0%;
- L-изолейцин, массовая доля основного вещества не менее 98,0%;
- L-бета-Фенилаланин, массовая доля основного вещества не менее 98,0%;
- L-Лейцин, массовая доля основного вещества не менее 98,0%;
- L-Лизин, массовая доля основного вещества не менее 98,0%;
- Глицин, массовая доля основного вещества не менее 98,5%;
- L-Пролин, массовая доля основного вещества не менее 99,0%;
- L-Орнитин моногидрохлорид, массовая доля основного вещества >= 99,0%.
Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками не ниже вышеуказанных, вспомогательного оборудования, материалов с техническими характеристиками не ниже вышеуказанных и химических реактивов аналогичной или более высокой квалификации.
5. Отбор проб
Отбор проб соковой продукции проводят по ГОСТ 26313.
6. Подготовка к проведению измерений
6.1 Подготовка хроматографа к работе
Включение и подготовку хроматографа к работе, вывод его на режим и выключение по окончании работы выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации.
6.2 Общие положения
Для дериватизации аминокислот используют смесь реагентов: о-фталевого альдегида (далее — OPA) в присутствии нуклеофильного реагента (3-меркаптопропионовой кислоты) и 9-флуоренилметоксикарбонилхлорида (далее — FMOC).
Разделение аминокислот происходит при температуре 40 °C в градиентном режиме с использованием следующих подвижных фаз:
- ацетатный буфер с pH 7,2 ед. pH с добавкой тетрагидрофурана;
- смесь: ацетатный буфер/ацетонитрил/этанол.
Для продления срока службы и более эффективной работы колонки используют систему защиты (in-line фильтры на выходе из насоса и предколонку), периодическую промывку (не реже одного-двух раз в неделю) колонки с ацетонитрилом (в зависимости от числа проведенных анализов и концентрации органических веществ, прошедших через колонку) в течение 1 — 3 ч со скоростью 1,0 см3/мин с предварительной промывкой всей системы водой. После проведения анализа и промывки колонки во избежание образования кристаллов соли вся система также промывается водой.
Операции заполнения системы растворителями и промывка отдельных частей и системы в целом выполняют в соответствии с соответствующими руководствами по эксплуатации оборудования.
Детектирование разделенных производных аминокислот осуществляют с помощью флуориметрического детектора:
- при длине волны возбуждения 266 нм и длине волны испускания 305 нм — для производных о-фталевого альдегида;
- длине волны возбуждения 340 нм и длине волны испускания 420 нм — для производных пролина и орнитина с FMOC.
Идентификацию разделенных производных аминокислот проводят путем сравнения времен удерживания и коэффициентов удерживания со стандартной смесью аминокислот (см. приложение А).
6.3 Приготовление вспомогательных растворов
6.3.1 Приготовление раствора уксусной кислоты с массовой долей 2%
В мерную колбу вместимостью 50 см3 приливают ориентировочно 20 см3 воды, затем приливают 0,95 см3 ледяной уксусной кислоты и доводят водой до метки.
Раствор используют свежеприготовленным.
6.3.2 Приготовление подвижной фазы A
(4,080 +/- 0,001) г уксуснокислого 3-водного натрия взвешивают в стакане вместимостью 100 см3, растворяют в приблизительно 80 см3 воды, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см3, доводят водой до метки и перемешивают. Раствор переносят в мерный стакан вместимостью 1000 см3 и доводят pH до значения 7,2 ед. pH раствором уксусной кислоты, приготовленным по 6.3.1, регистрируя показания pH-метром. К полученному раствору добавляют 2 см3 тетрагидрофурана. Полученный раствор дегазируют на установке для фильтрации и дегазации жидкостей (см. 4.15) под вакуумом в течение 15 мин с одновременной фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.
Срок хранения раствора — не более трех дней при температуре 4 °C.
6.3.3 Приготовление подвижной фазы B
В цилиндр вместимостью 1000 см3 приливают 200 см3 ацетатного буфера (подвижной фазы A), приготовленного по 6.3.2, 640 см3 ацетонитрила и 160 см3 этилового спирта. Полученную смесь перемешивают и дегазируют на установке для фильтрации и дегазации жидкостей (см. 4.15) под вакуумом в течение 15 мин с одновременной фильтрацией через фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.
Срок хранения смеси — не более трех дней при комнатной температуре.
6.3.4 Приготовление смеси дериватизирующих реагентов о-фталевого альдегида (OPA) и 3-меркаптопропионовой кислоты
(0,025 +/- 0,001) г о-фталевого альдегида растворяют в 2 см3 этанола и добавляют 20 мм3 3-меркаптопропионовой кислоты.
Срок хранения смеси — не более 1 мес при температуре от 2 до 8 °C в склянке из темного стекла.
6.3.5 Приготовление раствора дериватизирующего реагента 9-метилхлороформиатфлуорена (FMOC)
(0,05 +/- 0,001) г 9-флуоренилметоксикарбонилхлорида растворяют в 10 см3 ацетонитрила.
Срок хранения раствора — не более 1 мес при температуре от 2 до 8 °C в склянке из темного стекла.
6.3.6 Приготовление раствора гидроксида натрия молярной концентрации 5 моль/дм3
20,0 г гидроксида натрия растворяют в 50 см3 воды, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят водой до метки.
Срок хранения раствора — не более 1 мес в сосуде из полимерного материала.
6.3.7 Приготовление боратного буферного раствора молярной концентрации 0,05 моль/дм3
4,77 г тетраборнокислого десятиводного натрия растворяют в 150 см3 воды, переносят раствор в мерную колбу вместимостью 250 см3 и доводят водой до метки. Приготовленный раствор переносят в стакан вместимостью 1000 см3 и доводят до 10,4 ед. pH раствором гидроксида натрия, приготовленного по 6.3.6, регистрируя показания pH-метром.
Срок хранения раствора — не более 1 мес.
6.4 Приготовление градуировочных растворов
6.4.1 Приготовление исходных градуировочных растворов аминокислот
Основной (раствор № 6), промежуточный (раствор № 5) и градуировочные растворы аминокислот (растворы № 1 - 4) готовят в соответствии с таблицей 2.
Примечание - При использовании в качестве солей аминокислот (например, лизина) для приготовления основного раствора необходимо пересчитывать массу навески на свободную аминокислоту.
| № раствора | Компонент | Вместимость мерной колбы, см3 | Способ приготовления | Массовая концентрация, мг/дм3 |
| 6 | L-Аспарагиновая кислота | 100 | (0,100 +/- 0,001) г каждой аминокислоты взвешивают в одном стакане вместимостью 50 см3. Содержимое стакана растворяют приблизительно в 30 см3 воды, количественно переносят в мерную колбу и доводят до метки водой | 1000 |
| L-Глутамин | ||||
| L-Глутаминовая кислота | ||||
| L-Серин | ||||
| L-Гистидин | ||||
| L-Треонин | ||||
| L-Аспарагин | ||||
| L-Аланин | ||||
| L-Аргинин | ||||
| L-Тирозин | ||||
| \gamma - \text{Аминомасляная} кислота | ||||
| L-Метионин | ||||
| L-Валин | ||||
| L-изолейцин | ||||
| L-бета-Фенилаланин | ||||
| L-Лейцин | ||||
| L-Лизин | ||||
| Глицин | ||||
| L-Пролин | ||||
| L-Орнитин | ||||
| 5 | Все компоненты, что и в растворе № 6 | 100 | В мерную колбу отбирают 10,0 см3 основного раствора № 6, доводят до метки водой и перемешивают | 100 |
| 4 | Все компоненты, что и в растворе № 6 | 50 | В мерную колбу отбирают 10,0 см3 промежуточного раствора № 5, доводят до метки водой и перемешивают | 20,0 |
| 3 | Все компоненты, что и в растворе № 6 | 50 | В мерную колбу отбирают 7,5 см3 промежуточного раствора № 5, доводят до метки водой и перемешивают | 15,0 |
| 2 | Все компоненты, что и в растворе № 6 | 50 | В мерную колбу отбирают 5,0 см3 промежуточного раствора № 5, доводят до метки водой и перемешивают | 10,0 |
| 1 | Все компоненты, что и в растворе № 6 | 50 | В мерную колбу отбирают 2,5 см3 промежуточного раствора № 5, доводят до метки водой и перемешивают | 5,0 |
Раствор № 4 используют в качестве одного из контрольных растворов при ежедневных анализах.
Срок хранения основного раствора № 6 - не более 5 сут при температуре от 2 до 6 °C.
Промежуточный раствор № 5 и градуировочные растворы используют свежеприготовленными.
6.4.2 Приготовление дериватизированных градуировочных растворов аминокислот
Во вставку для микроколичеств пипеточным дозатором помещают 10 мм3 градуировочного раствора (№ 1 - 4 по таблице 1), 5 мм3 смеси OPA и 3-меркаптопропионовой кислоты (см. 6.3.4), 5 мм3 раствора FMOC (см. 6.3.5) и 50 мм3 боратного буферного раствора (см. 6.3.7). Смесь перемешивают и сразу же проводят хроматографический анализ аминокислот. Операцию повторяют для каждого градуировочного раствора (№ 1 - 4 по таблице 1).
К массовой концентрации аминокислот в полученном дериватизированном градуировочном растворе дополняют значение, равное массовой концентрации аминокислот в соответствующем градуировочном растворе, приведенной в таблице 1.
6.5 Условия проведения измерений
При подготовке к проведению измерений и проведении измерений соблюдают следующие условия:
6.6 Условия хроматографического анализа
При проведении хроматографического анализа создают и поддерживают следующие условия:
266 нм (возбуждение)/305 нм (регистрация) — для производных о-фталевого альдегида,
340 нм (возбуждение)/420 нм (регистрация) — для производных пролина и орнитина с FMOC;
- объем вводимой пробы — 10 мм3;
- режим элюирования — градиентный, скорость потока 0,75 см3/мин (ориентировочное значение).
Параметры градиентного режима приведены в таблице 2.
| Время, мин | Объемная доля элюента A (см. 6.3.2), % | Объемная доля элюента B (см. 6.3.3), % |
|---|---|---|
| 0 | 0 | 100 |
| 7 | 25 | 75 |
| 9 | 25 | 75 |
| 10 | 36 | 64 |
| 12 | 43 | 57 |
| 14 | 51 | 49 |
| 15 | 60 | 40 |
| 17 | 60 | 40 |
| 18 | 100 | 0 |
| 25 | 0 | 100 |
6.7 Градуировка хроматографа
Градуировку хроматографа проводят в соответствии с руководством по эксплуатации оборудования и руководством пользователя программным обеспечением.
Дозируют в хроматограф дериватизированные градуировочные растворы (см. 6.4.2) после дериватизации и регистрируют площадь пиков производных соответствующих аминокислот. Площадь пиков производных аминокислот S, е.о.п.·с <*> и их массовая концентрация в градуировочных растворах c, мг/дм3, находятся в линейной зависимости
где k — градуировочный коэффициент (угол наклона), мг·дм-3·(е.о.п.·с)-1.
<*> е.о.п. — единицы оптической плотности.
Коэффициенты k вычисляют по результатам анализа градуировочных растворов с помощью программно-аппаратного комплекса сбора и обработки данных или при его отсутствии в составе хроматографа по методу наименьших квадратов
k = \frac{\sum_{i = 1}^{m} c_{i}S_{i}}{\sum_{i = 1}^{m} S_{i}^{2}} , (2)
где ci — массовая концентрация аминокислоты в i-м градуировочном растворе, мг/дм3;
Si — площадь пика соответствующей аминокислоты при анализе i-го градуировочного раствора, е.о.п.·с.
Градуировочную характеристику устанавливают при смене оборудования, колонок, условий хроматографического анализа или при выявлении несоответствий по результатам оперативного контроля или внутреннего аудита.
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят, используя в качестве контрольных заново приготовленные по 6.4.2 дериватизированные градуировочные растворы из растворов № 3 и № 4 (см. таблицу 2) перед выполнением измерений.
Результаты контроля стабильности градуировочной характеристики признаются удовлетворительными при выполнении для каждого контрольного раствора следующего условия
|Xизм — Cст| <= 0,01·G·Cст, (3)
где Xизм — результат измерения массовой концентрации аминокислоты в контрольных растворах, мг/дм3;
Cст — фактическое значение массовой концентрации аминокислоты в контрольных растворах, мг/дм3;
G — норматив контроля стабильности градуировочной характеристики, %.
Во всем диапазоне градуировочной характеристики G принимают равным 0,7 \cdot \delta , где \delta — границы относительной погрешности измерений массовой концентрации аминокислот (см. таблицу 3), %.
Если условие (3) не выполняется хотя бы для одного контрольного раствора, то градуировочную характеристику устанавливают заново во всем диапазоне измерений.
6.8 Мониторинг характеристик хроматографических колонок проводят в соответствии с приложением А.
7. Проведение измерений
7.1 Подготовка проб для измерений
7.1.1 При анализе каждой пробы проводят два параллельных измерения.
7.1.2 Осветленные соки, нектары и сокосодержащие напитки, не содержащие нерастворимые в воде вещества, разбавляют в 100 раз. Для этого 1 см3 пробы сока (см. раздел 5) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят водой до метки. Далее проводят дериватизацию аминокислот. Для этого во вставку для микроколичеств пипеточным дозатором помещают 10 мм3 разбавленной пробы, 5 мм3 смеси OPA и 3-меркаптопропионовой кислоты (см. 6.3.4), 5 мм3 раствора FMOC (см. 6.3.5) и 50 мм3 боратного буферного раствора (см. 6.3.7). Смесь перемешивают и сразу же проводят хроматографический анализ по 7.2.3.
7.1.3 Соки, нектары и сокосодержащие напитки с мякотью или содержащие нерастворимые в воде вещества разбавляют объемным методом в 100 раз. Для этого 1 см3 пробы сока (см. раздел 5) помещают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят водой до метки. Далее разбавленную пробу центрифугируют со скоростью не менее 9000 об/мин в течение 10 мин и проводят все операции, предусмотренные 7.1.2, начиная с отбора аликвоты пробы во вставку для микроколичеств.
7.1.4 Концентрированные соки и пюре различных фруктов, ягод и овощей разбавляют водой в 500 раз весовым методом. Для этого взвешивают ориентировочно 0,15 г концентрированного сока в стакане вместимостью 100 см3 с погрешностью +/- 0,001 г и доводят водой до 75 г, проводя взвешивание также с погрешностью +/- 0,001 г. Далее проводят все операции, описанные в 7.1.2.
7.1.5 При подготовке пробы по 7.1.4 результат измерений выражают в единицах массовой доли (млн-1), по 7.1.2, 7.1.3 - в единицах массовой концентрации (мг/дм3).
7.2 Порядок проведения измерений
7.2.1 Включение и вывод хроматографической системы на рабочий режим, включая кондиционирование колонки, проводят в соответствии с руководствами по эксплуатации оборудования, колонки, и 6.2, 6.5.
7.2.2 Выключение хроматографической системы после выполнения анализов проводят в соответствии с руководством по эксплуатации оборудования и руководством пользователя программно-аппаратным комплексом сбора и обработки данных.
7.2.3 Подготовленную по 7.1.2 - 7.1.4 пробу вводят в хроматограф и анализируют в тех же условиях, что и дериватизированные градуировочные растворы (см. 6.6). Идентифицируют пики аминокислот по временам удерживания, используя при этом программное обеспечение к хроматографу. Для всех идентифицированных аминокислот вычисляют массовую концентрацию cизм, мг/дм3, используя градуировочные характеристики по 6.7.
Примеры хроматограмм приведены в приложении Б.
8. Обработка и оформление результатов измерений
8.1 Если подготовку пробы проводили по 7.1.2 или 7.1.3, то массовую концентрацию аминокислот в пробе C, мг/дм3, вычисляют по формуле
C = \frac{c_{\text{изм}} \cdot V_{2}}{V_{1}} , (4)
где cизм — измеренное по 7.2.3 значение массовой концентрации соответствующей аминокислоты в подготовленной пробе, мг/дм3;
V2 - объем мерной колбы, взятой для разбавления пробы, см3;
V1 — объем пробы, отобранный для анализа, см3.
За результат измерений массовой концентрации аминокислот в пробе принимают среднеарифметическое значение \overline{C} , мг/дм3, результатов двух параллельных измерений C1 и C2, мг/дм3, при выполнении условия
100 \cdot \frac{|C_{1} - C_{2}|}{\overline{C}} \leq r_{\text{отн}}, (5)
где rотн — предел повторяемости (см. таблицу 3), %.
8.2 Если подготовку пробы проводили по 7.1.4, то массовую долю аминокислот в пробе X, млн-1, вычисляют по формуле
X = \frac{X_{\text{изм}} \cdot m_{\text{общ}}}{m_{X}} , (6)
где Xизм — значение массовой доли аминокислоты в растворе, подготовленном по 7.1.4, принимаемое численно равным измеренному по 7.2.3 значению массовой концентрации, млн-1;
mобщ — масса пробы анализируемой пробы с добавкой воды (см. 7.1.3), г;
mX — масса анализируемой пробы, г.
8.3 За результат измерений массовой доли аминокислот в пробе принимают среднеарифметическое значение \overline{X} , млн-1, результатов двух параллельных измерений X1 и X2, млн-1, при выполнении условия
100 \cdot \frac{|X_{1} - X_{2}|}{\overline{X}} \leq r_{\text{отн}}, (7)
где rотн — предел повторяемости (см. таблицу 3), %.
При невыполнении условий (5) и (7) получают еще два результата измерений в соответствии с разделом 7 и затем используют методы проверки приемлемости четырех результатов параллельных измерений и установления результата измерений согласно ГОСТ ИСО 5725-6 (подраздел 5.2).
Метрологические характеристики метода
8.4 Относительное расхождение между результатами измерений, полученными в двух лабораториях, не должно превышать предела значения критической разности CD0,95
2 \cdot \frac{|\overline{C_{1}} - \overline{C_{2}}|}{\overline{C_{1}} + \overline{C_{2}}} \leq 0,01 \cdot CD_{0,95}, (8)
2 \cdot \frac{|\overline{X_{1}} - \overline{X_{2}}|}{\overline{X_{1}} + \overline{X_{2}}} \leq 0,01 \cdot CD_{0,95}, (9)
где \overline{C_{1}} и \overline{C_{2}} ( \overline{X_{1}} и \overline{X_{2}} ) — результаты измерений массовой концентрации (массовой доли) аминокислот, полученные в первой и второй лабораториях соответственно, мг/дм3 (млн-1);
0,01 — коэффициент пересчета от процентов к абсолютным величинам;
CD0,95 — критическая разность, %.
Значение критической разности вычисляют по формуле
CD_{0,95} = \sqrt{R_{\text{отн}}^{2} - r_{\text{отн}}^{2} \cdot (1 - \frac{1}{n_{1}} - \frac{1}{n_{2}})} , (10)
где Rотн — предел воспроизводимости (см. таблицу 3), %;
rотн — предел повторяемости (см. таблицу 3), %;
n1 и n2 — число параллельных измерений в первой и второй лабораториях соответственно.
При выполнении условий (8) или (9) приемлемы оба результата измерений, и в качестве окончательного результата используют их среднеарифметическое значение. При невыполнении этого условия рекомендуется провести мероприятия, предусмотренные ГОСТ ИСО 5725-6 (пункты 5.3.3 и 5.3.4).
8.5 Результаты измерений регистрируют в протоколе испытаний согласно ГОСТ ИСО/МЭК 17025 с указанием настоящего стандарта в следующем виде
(\overline{C} \pm \Delta_{C}) , мг/дм3 (P = 0,95) (11)
(\overline{X} \pm \Delta_{X}) , млн-1 (P = 0,95), (12)
где \overline{C} — среднеарифметическое значение результатов двух параллельных измерений массовой концентрации аминокислот, мг/дм3;
\Delta_{C} — значение границ абсолютной погрешности измерений массовой концентрации аминокислот для доверительной вероятности P = 0,95, мг/дм3, вычисленное по формуле
\Delta_{C} = \frac{\delta \cdot \overline{C}}{100} , (13)
где \delta — значение границ относительной погрешности измерений массовой концентрации (массовой доли) аминокислот для доверительной вероятности P = 0,95 (см. таблицу 3), %;
\overline{X} — среднеарифметическое результатов двух параллельных измерений массовой доли аминокислот, млн-1;
\Delta_{X} — значение границ абсолютной погрешности измерений массовой доли аминокислот для доверительной вероятности P = 0,95, млн-1, вычисленное по формуле
\Delta_{X} = \frac{\delta \cdot \overline{X}}{100} . (14)
9. Контроль качества результатов измерений
Контроль качества результатов измерений осуществляют, используя методы контроля стабильности среднеквадратического отклонения повторяемости и контроля стабильности среднеквадратического отклонения промежуточной прецизионности с применением контрольных карт Шухарта по ГОСТ ИСО 5725-6 (пункты 6.2.2, 6.2.3).
Периодичность процедуры контроля стабильности результатов измерений регламентируют в руководстве по качеству лаборатории в соответствии с ГОСТ ИСО/МЭК 17025 (пункт 4.2).
10. Требования безопасности
10.1 Условия безопасного проведения работ
При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности — по ГОСТ 12.1.004.
Требования электробезопасности при работе с приборами — по ГОСТ 12.1.019 и в соответствии с руководством по эксплуатации используемого оборудования.
10.2 Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке результатов допускаются инженер-химик, техник или лаборант, имеющие высшее или специальное образование, опыт работы в химической лаборатории и изучившие инструкцию по эксплуатации жидкостного хроматографа. Первое применение метода в лаборатории должно проводиться под руководством специалиста, владеющего теорией высокоэффективной жидкостной хроматографии и имеющего практические навыки в этой области.
МОНИТОРИНГ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК КОЛОНКИ
А.1 Проверку оптимальности хроматографических условий (хроматографических характеристик колонки) проводят по хроматограмме стандартного раствора № 4 с помощью программного обеспечения или вручную по показателям в соответствии с таблицами А.1 и А.2.
Время удерживания, коэффициент удерживания, число теоретических тарелок и коэффициент асимметрии хроматографических пиков <*>
<*> Данные значения получены при использовании хроматографической колонки Zorbax SB C18 фирмы Agilent. Информация приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не является поддержкой указанного продукта.
Разрешение хроматографических пиков аминокислот
А.2 Время удерживания (абсолютное) аминокислот определяют непосредственно из хроматограмм двух параллельных измерений одной пробы. В случае обнаружения отклонения времени удерживания более чем на 5% от стандартного значения заново устанавливают градуировочную характеристику во всем диапазоне измерений. В случае выполнения условий неравенства (4) допускается программное изменение времен удерживания компонентов.
А.3 Коэффициент удерживания (емкости) k' вычисляют по формуле
k\prime = \frac{t_{R}\prime}{t_{M}} , (А.1)
где t_{R}\prime — приведенное время удерживания, мин;
tM — время выхода неудерживаемого компонента, мин.
Колонка считается удовлетворительной при значении коэффициента емкости, не превышающем 10% от указанного в таблице А.1.
А.4 Число теоретических тарелок вычисляют по формуле
N = 16 \cdot (\frac{t_{R}}{W_{b}})^{2} = 5,545 \cdot (\frac{t_{R}}{W_{h}})^{2}, (А.2)
где 16 и 5,545 — множители, вытекающие из свойств нормального распределения;
tR — время удерживания пика, мин;
Wb — ширина пика у основания, мин;
Wh — ширина пика на его полувысоте, мин.
Колонка считается удовлетворительной при значении числа теоретических тарелок не ниже 10% от указанного в таблице.
А.5 Коэффициент асимметрии вычисляют по формуле
где A — «левый» отрезок, образованный на горизонтальной линии, проведенной на высоте 10% от основания пика и разделенной вертикалью, опущенной из вершины пика;
B — «правый» отрезок, образованный на горизонтальной линии, проведенной на высоте 10% от основания пика и разделенной вертикалью, опущенной из вершины пика.
Колонка считается удовлетворительной при значении коэффициента асимметрии, не превышающем 1,75.
А.6 Разрешение Rs вычисляют по формуле
R_{s} = \frac{2(t_{R2} - t_{R1})}{(W_{b1} + W_{b2})} , (А.4)
где tR2, tR1 — значения времени удерживания разделяемых полностью или критически (не полностью) компонентов, мин;
Wb1, Wb2 — ширина пиков у основания, мин.
А.7 По результатам двух параллельных измерений вычисляют средние значения Rs для пары разделяемых полностью или критически (не полностью) компонентов (n, n + 1). Колонка считается удовлетворительной при значениях Rs n, n + 1 >= 1,25.
Контроль стабильности хроматографической колонки в процессе эксплуатации проводят не реже одного раза в две недели.
ПРИМЕРЫ ХРОМАТОГРАММ АМИНОКИСЛОТ
Б.1 Примеры хроматограмм аминокислот приведены на рисунках Б.1, Б.2.
1 — L-Аспарагиновая кислота; 2 — L-Глутаминовая кислота; 3 — L-Аспарагин; 4 — L-Треонин; 5 — L-Серин; 6 — L-Гистидин; 7 — L-Глутамин; 8 — Глицин; 9 — L-бета-Фенилаланин; 10 — L-Аланин; 11 — L-Аргинин; 12 — \gamma - \text{Аминомасляная} кислота; 13 — L-Тирозин; 14 — L-Валин; 15 — L-Метионин; 16 — L-Изолейцин; 17 — L-Лейцин; 18 — L-Лизин Длина волны возбуждения 266 нм, длина волны регистрации 305 нм
Рисунок Б.1 — Хроматограмма дериватизированного градуировочного раствора аминокислот № 4
1 — L-Пролин; 2 — L(+)-Орнитин Длина волны возбуждения 340 нм, длина волны регистрации 420 нм
Рисунок Б.2 — Хроматограмма градуировочного раствора аминокислот № 4