ФС.3.7.0004.22. Фармакопейная статья. Химотрипсин, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций для местного и наружного применения
(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 11.04.2022 № 246)
(«Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание»)
Примечание
В соответствии с Приказом Минздрава России от 11.04.2022 № 246 данный документ введен в действие с 01.04.2022. Взамен ФС 42-628-97.
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Настоящая фармакопейная статья распространяется на Химотрипсин, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций для местного и наружного применения, фермент протеолитического действия, получаемый по непрерывной технологии из поджелудочной железы крупного рогатого скота, с использованием сырья из хозяйств от животных, у которых отсутствуют заболевания различной этиологии, патогенные для человека.
Препарат должен соответствовать ОФС «Лиофилизат» и нижеприведенным требованиям.
Описание. Лиофилизированная пористая масса в виде таблетки, комочков или блестящих чешуек белого цвета.
Должен обладать способностью вступать в реакцию со специфичным для химотрипсина синтетическим субстратом. Определение проводят по разделу «Определение протеолитической активности».
Испытуемый раствор. Содержимое 2 флаконов переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Измеряют УФ-спектр поглощения раствора в диапазоне длин волн от 240 до 300 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм.
Максимум поглощения раствора должен иметь максимум поглощения при длине волны (280 +/- 2) нм и минимум при длине волны (249 +/- 2) нм.
Определение проводят в водяном термостате с прозрачными стенками из стекла или оргстекла.
12 мг препарата (точная навеска) растворяют в 4 мл 0,1 М ацетатного буферного раствора (pH 5,6). В 3 пробирки вносят по 3 мл раствора молока и прогревают в течение 15 мин при температуре (35,5 +/- 0,5) °C. Затем в 2 пробирки (последовательно) добавляют по 0,5 мл раствора испытуемого препарата, взбалтывают и отмечают время по секундомеру. Наблюдение проводят в проходящем свете, не вынимая пробирок из термостата. Конец реакции отмечают по появлению первых крупинок казеина. В контрольную пробу (3-я пробирка) к молоку добавляют 0,5 мл ацетатного буферного раствора (pH 5,6) и выдерживают в термостате 60 мин по секундомеру. Молоко не должно свертываться.
Створаживающая активность выражается временем, прошедшим с момента добавления фермента до появления первых признаков створаживания молока. Время створаживания для химотрипсина должно быть не более 25 сек.
Приготовление раствора молока. Натуральное свежее коровье молоко центрифугируют 30 мин при 7000 — 8000 об/мин, удаляют жир и лиофильно высушивают. Хранят в банке с притертой крышкой в темном, прохладном месте в течение 6 мес.
0,75 г сухого обезжиренного молока растирают в ступке с небольшим количеством воды. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 1 мл 3 М раствора кальция хлорида и 5 мл 1 М ацетатного буферного раствора (pH 5,6), доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленный.
Приготовление 1 М ацетатного буферного раствора (pH 5.6). 5,8 мл уксусной кислоты помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора до метки и перемешивают.
В мерной колбе вместимостью 100 мл растворяют 13,6 г натрия ацетата, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают. Смешивают полученные растворы в соотношении 5,5:44,5. Срок хранения раствора 1 мес.
Время растворения. Не более 1 мин. К содержимому флакона приливают 2 мл натрия хлорида раствора 0,9%. Содержимое флакона должно полностью раствориться.
Однородность массы. Должен соответствовать требованиями ОФС «Однородность массы дозированных лекарственных форм».
Прозрачность. Должен быть прозрачным. Определение проводят в соответствии с ОФС «Прозрачность и степень мутности жидкостей». Перед определением 0,02 г препарата растворяют в 10 мл воды (0,2% раствор).
Цветность. 0,2% раствор, приготовленный при испытании на прозрачность, должен быть бесцветным. Определение проводят в соответствии с ОФС «Степень окраски жидкостей».
pH. От 4,5 до 5,5. Определение проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС «Ионометрия» в 0,2% растворе препарата, приготовленный, как указано в разделе «Прозрачность».
Механические включения. Должен соответствовать требованиям ОФС «Видимые механические включения в лекарственных формах для парентерального применения и глазных лекарственных формах».
Сульфаты. Должен соответствовать требованиям ОФС «Сульфаты» метод 1. Предварительно перед определением 0,02 г препарата растворяют в 10 мл воды (0,2% раствор).
Соли аммония. Должен соответствовать требованиям ОФС «Аммоний» Предварительно перед определением 0,02 г препарата растворяют в 10 мл воды (0,2% раствор).
Потеря в массе при высушивании. Не более 10%. Определение проводят в соответствии с ОФС «Потеря в массе при высушивании».
Остаточные органические растворители. Определение проводят методом газожидкостной хроматографии.
Раствор внутреннего стандарта. В мерную колбу с притертой пробкой вместимостью 100 мл помещают, 0,5 г (точная навеска) пропанола доводят объем раствора до метки и перемешивают. Раствор хранят при температуре от 15 до 25 °C в течение 3 мес.
Испытуемый раствор. Около 0,1 г (точная навеска) препарата растворяют в 1,8 мл воды, добавляют 0,2 мл раствора внутреннего стандарта и перемешивают.
Стандартный раствор. В мерную колбу с притертой пробкой вместимостью 100 мл помещают 0,5 г (точная навеска) ацетона и 0,5 г (точная навеска) этанола, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают (5 мг/мл). Раствор хранят при температуре от 15 до 25 °C в течение 3 мес.
В мерную колбу вместимостью 25 мл помещают 1 мл стандартного раствора (5 мг/мл), прибавляют 2,5 мл раствора внутреннего стандарта, доводят объем раствора водой до метки и перемешивают (0,2 мг/мл). Раствор используют свежеприготовленным.
Хроматографируют стандартный раствор не менее 5 раз. Чувствительность системы устанавливают таким образом, чтобы высота пика ацетона была не менее 50% шкалы записывающего устройства.
Результаты анализа считаются достоверными, если выполняются следующие требования теста «Проверка пригодности хроматографической системы»:
- степень разделения пиков пропанола и ацетона; пропанола и этанола; этанола и ацетона на хроматограмме стандартного раствора должна быть не менее 2;
- эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по пику ацетона на хроматограмме стандартного раствора, должна быть 10000 теоретических тарелок;
- относительное стандартное отклонение, рассчитанное по пику ацетона, не должно превышать 10%.
Стандартный и испытуемый растворы хроматографируют поочередно, получая не менее 5 хроматограмм.
Содержание ацетона/этанола (X) в процентах вычисляют по формуле:
X = \frac{B \cdot mo \cdot 2 \cdot 100}{Bo \cdot 100 \cdot 25 \cdot m} = \frac{B \cdot mo}{Bo \cdot m \cdot 25} ,
где B — среднее значение отношений площадей пиков ацетона/этанола к площадям пиков пропанола из хроматограмм испытуемого раствора;
Bо — среднее значение отношений площадей пиков ацетона/этанола к площадям пиков пропанола из хроматограмм стандартного раствора;
m0 — масса навески стандартного образца ацетона/этанола, г;
2, 25, 100 — разведение препарата, мл.
Содержание ацетона в препарате должно быть не более 0,05%. Содержание этанола в препарате должно быть не более 0,05%.
Пирогенность. Должен быть апирогенным. Определение проводят в соответствии с ОФС «Пирогенность». Тест-доза 1 мг препарата в 1 мл натрия хлорида стерильного для инъекций раствора 0,9% на 1 кг массы кролика.
Аномальная токсичность. Должен быть нетоксичным. Тест-доза 1 мг препарата в 0,5 мл натрия хлорида раствора для инъекций 0,9% на мышь, внутривенно. Скорость введения — 0,1 мл/с, период наблюдения — 48 ч. Определение проводят в соответствии с ОФС «Аномальная токсичность».
Стерильность. Должен быть стерильным. Определение проводят в соответствии с ОФС «Стерильность» методом прямого посева.
Метод основан на определении скорости гидролиза N-бензоил-L-тирозина этилового эфира (БТЭЭ) и высвобождения — N-бензоил-L-тирозина под действием химотрипсина.
Протеолитическую активность выражают в бензоилтирозиновых единицах (БТЕ). Препарат имеет активность в 1 бензоилтирозиновую единицу, если при воздействии его на субстрат (БТЭЭ) при температуре 25 °C и pH 7,8 в течение 1 мин гидролизуется 1 мкмоль субстрата с образованием 1 мкмоль N-бензоил-L-тирозина.
Приготовление испытуемого образца (1,0 мг/мл). Около 50 мг (точная навеска) химотрипсина помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, прибавляют 30 мл 0,001 М раствора хлористоводородной кислоты, перемешивают до полного растворения, доводят объем раствора до метки тем же растворителем и вновь перемешивают.
В другую мерную колбу вместимостью 50 мл переносят 1,0 мл испытуемого раствора (1,0 мг/мл), доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают (20 мкг/мл). Растворы используют свежеприготовленные.
Приготовление раствора субстрата
15 мг БТЭЭ растворяют в 45 мл 50% раствора спирта и перемешивают. Раствор хранят при температуре от 15 до 25 °C в темном месте в течение 3 мес.
Приготовление 0,08 М трис-HCL буферного раствора pH 7,8. 0,97 г трис(гидроксиметил)аминометана и 2,19 г кальция хлорида гексагидрат (CaCL2·6H2O) растворяют в 90 мл воды, устанавливают pH раствора 7,8 с помощью 1 М раствора хлористоводородной кислоты, переносят раствор в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора водой до метки и перемешивают.
Гидролиз БТЭЭ определяют по увеличению поглощения при длине волны 256 нм. В 2 кюветы размером 10 мм вносят по 1,5 мл буферного раствора и 1,4 мл раствора субстрата. В кювету сравнения вносят 0,1 мл 0,001 М раствор хлористоводородной кислоты и перемешивают.
В другую кювету вносят 0,1 мл испытуемого образца (20 мкг/мл), включают секундомер, перемешивают и замеряют оптическую плотность через каждые 30 сек в течение 5 мин от начала реакции. В течение указанного времени оптическая плотность должна увеличиваться практически линейно.
Вычисляют изменение оптической плотности в мин (\Delta A/\text{мин}) по формуле:
\Delta A/\text{мин} = \frac{A5 - A1}{4} ,
где A5 — оптическая плотность в испытуемом образце спустя 5 мин от начала реакции;
A1 — оптическая плотность в испытуемом образце спустя 1 мин от начала реакции;
4 — время между измерениями, мин.
Протеолитическую активность химотрипсина в 1 мг препарата в бензоилтирозиновых единицах (X) вычисляют по формуле:
X = \frac{\Delta A/\text{мин} \cdot 3 \cdot 50 \cdot 50}{0,964 \cdot a \cdot 0,1} = \frac{\Delta A/\text{мин} \cdot 75000}{0,964 \cdot a} ,
где a — навеска препарата, мг;
\Delta A/\text{мин} — среднее изменение оптической плотности в мин;
0,964 — коэффициент микромолярной экстинкции N-бензоил-L-тирозина;
3 — объем реакционной смеси, мл;
50·50 — коэффициенты разведения;
0,1 — объем испытуемого образца, мл.
Протеолитическая активность химотрипсина должна быть не менее 40 БТЕ/мг препарата.
Содержимое пяти флаконов препарата количественно переносят с помощью воды в мерную колбу вместимостью 250 мл, доводят объем раствора до метки тем же растворителем и перемешивают. Проводят измерение оптической плотности на спектрофотометре в кювете с толщиной слоя 10 мм при длине волны 280 нм. В качестве раствора сравнения используют воду. Концентрацию белка находят по калибровочному графику. Количество белка (X) во флаконе в мг вычисляют по формуле:
где C — концентрация белка, найденная по калибровочному графику, мг/мл;
5 — количество флаконов, взятых на анализ, шт.
Содержание белка во флаконе должно быть от 8,0 до 11,0 мг.
В мерную колбу вместимостью 50 мл помещают 25,0 мг химотрипсина, растворяют в 10 мл воды и доводят объем раствора тем же растворителем до метки и перемешивают. 1 мл полученного раствора содержит 0,5 мг/мл химотрипсина.
Для построения калибровочного графика готовят следующие разведения стандартного раствора:
Оптическую плотность растворов измеряют на спектрофотометре при длине волны 280 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют воду. Строят калибровочный график, откладывая на оси абсцисс концентрацию белка в пробе в мг/мл, а на оси ординат — величину оптической плотности.
Калибровочный график строится при каждом определении.
Хранение. В защищенном от света месте при температуре не выше 25 °C в соответствии с ОФС «Хранение лекарственных средств».