Методические указания по фотометрическому измерению концентраций липазы микробной в воздухе рабочей зоны
(утв. Минздравом СССР 12.12.1988 № 4802-88)
Утверждено Заместителем Главного государственного санитарного врача СССР А. И. Заиченко 12 декабря 1988 г. № 4802-88
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ФОТОМЕТРИЧЕСКОМУ ИЗМЕРЕНИЮ КОНЦЕНТРАЦИЙ ЛИПАЗЫ МИКРОБНОЙ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
Липаза микробная является ферментным препаратом, предназначенным для расщепления жиров, применяется в медицине, в меховой, кожевенной промышленности, в животноводстве, и других отраслях народного хозяйства.
Липаза микробная — мелкий порошок светло-коричневого цвета и легким дрожжевым запахом, растворим в воде, в солевых растворах (в частности, фосфатном буфере), не растворим в большинстве органических растворителях.
В воздухе находится в виде аэрозоля.
Ферментный препарат липаза микробная раздражает слизистые оболочки верхних дыхательных путей и легких, обладает аллергенным действием.
Характеристика метода
Метод основан на фотометрическом определении цветного комплекса меди, образуемого свободными жирными кислотами, которые выделяются в результате гидролитического действия липазы, с диэтилдитиокарбаматом.
Отбор проб производится с концентрированием на фильтр.
Нижний предел измерения содержания жирной кислоты 1 мкг/мл в фотометрируемом растворе.
Нижний предел измерения липазы в воздухе 0,3 мг/м3 (при отборе 4 л воздуха).
Диапазон измеряемых концентраций липазы в воздухе от 0,3 до 3,7 мг/м3.
Измерению не мешают белковые вещества и фосфорнокислые соли.
Суммарная погрешность измерения не превышает 25%.
Время выполнения измерения, включая отбор проб, 1 час 30 мин.
Приборы, аппаратура, посуда
Фильтродержатели, ТУ 95.72.05-77.
Размельчитель тканей РТ-2, ТУ 64-1-1305-79.
Аппарат инактивации сыворотки АИС, ТУ 64-1-1091-77 или лабораторная водяная баня.
Колбы конические, ГОСТ 10394-72, вместимостью 1000 мл.
Бюретка, ГОСТ 20292-74, вместимостью 25 мл.
Мерные колбы, ГОСТ 1770-74, вместимостью от 25 до 1000 мм.
Пипетки, ГОСТ 20292-74, вместимостью 1 и 5 мл.
Цилиндры мерные, ГОСТ 1770-74, вместимостью 100 мл.
Бюксы, ГОСТ 25336-82, вместимостью 2 — 5 мл.
Пробирки с пришлифованными пробками, ГОСТ 10515-75, вместимостью 15 мл.
Стаканы химические, ГОСТ 25336-82, вместимостью 50; 100; 250 мл.
Реактивы, растворы и материалы
Оливковое масло, ГОСТ 7580-55.
Спирт поливиниловый (ПВС0, ТУ 64-5-51-79, 2% водный р-р.
Натрий фосфорнокислый двухзамещенный, ГОСТ 4172-76, 1/15 М раствор (А).
Калий фосфорнокислый однозамещенный, ГОСТ 4198-75, 1/15 М раствор (Б).
Фосфатный буфер, 1/15 М раствор с pH 7,8. Готовят смешиванием растворов А и Б в соотношении 91,5:8,5. Величину pH проверяют на pH-метре.
Раствор экстракционный: готовят путем смешивания хлороформа и гептана 3:2.
Уксусная кислота, ледяная, ГОСТ 6175, 1 М раствор.
Медь азотнокислая трехводяная, ГОСТ 4163-68, чда.
Натрий хлористый, ГОСТ 4233-77, хч.
Триэтаноламин, ТУ 6-09-2448-72, ч.
Бутанол, ГОСТ 6006-78, чда.
Натрия N,N-диэтилдитиокарбамат, ГОСТ 8864-71, ч.
Реагент меди: готовят в мерной колбе на 200 мл, для этого к 10 мл 1 М раствора уксусной кислоты добавляют 12 мл триэтаноламина, 4,75 г меди азотнокислой и 100 мл воды, растворяют, добавляют 57 г хлористого натрия и 50 мл воды, затем 1 М уксусной кислотой устанавливают pH-8,1 и доводят до метки водой. Устойчив реагент месяц (до образования зеленого осадка).
Цветной реагент: в мерной колбе на 100 мл растворяют 100 мл натрия N,N-диэтилдитиокарбамата в 60 мл бутанола и доводят до метки хлороформом. Сохраняется при хранении в холодильнике в течение 2-х недель.
Эмульсия оливкового масла; готовят перемешиванием 40 мл оливкового масла с 60 мл 2% раствора ПВС в дистиллированной воде в стакане микроизмельчателя тканей при 3000 об/мин в течение 30 — 40 минут. Эмульсия готовится перед употреблением.
Пальмитиновая кислота, МРТУ 6-09-5841-69. Для стандарта возможно также применение олеиновой кислоты.
Стандартный раствор № 1 с концентрацией 1,5 мг/мл пальмитиновой кислоты готовят растворением кислоты в экстракционном растворе в мерной колбе на 50 мл. Раствор устойчив при хранении в холодильнике в течение недели.
Стандартный раствор № 2 и 3 с концентрацией 100 мкг/мл и 10 мкг/мл готовят путем соответствующего разбавления раствора № 1 экстракционным раствором. Готовят перед употреблением.
Фильтры АФА-ХА-20 или АФА-ХА-10.
Отбор пробы воздуха
Воздух с объемным раствором 1 л/мин аспирируют через фильтр АФА-ХА, укрепленный в фильтродержателе.
Для определения 1/2 ПДК достаточно отобрать 2,5 л воздуха.
Пробы устойчивы длительное время.
Подготовка к измерению
Градуировочные растворы готовят в пробирках, согласно таблице 12.
| № стандарта | Стандартный раствор № 3, | Экстракционные раствор, мл | Концентрация пальмитиновой кислоты, мкг/мл |
|---|---|---|---|
| 1 | 0,0 | 5,0 | 0 |
| 2 | 0,5 | 4,5 | 1 |
| 3 | 1,0 | 4,0 | 2 |
| 4 | 2,0 | 3,0 | 4 |
| 5 | 3,0 | 2,0 | 6 |
| 6 | 4,0 | 1,0 | 8 |
| 7 | 5,0 | 0,0 | 10 |
Во все пробирки с градуировочными растворами добавляют 0,5 мл насыщенного раствора натрия бромистого и 2,5 мл реагента меди. Пробирки закрывают и встряхивают при 1500 об/мин. По 3,5 мл органического слоя переносят в пробирки с 0,4 мл цветного реагента. Перемешивают и через 5 — 10 минут измеряют оптическую плотность при длине волны 440 нм. Измерение проводят в кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм по отношению к раствору сравнения, не содержащего определяемого вещества (раствор № 1 по таблице). Окраска растворов устойчива 3 часа.
Строят градуировочный график зависимости значений оптических плотностей от соответствующих им концентраций жирной кислоты в градуировочном растворе (мкг/мл).
Проверка градуировочного графика проводится в случае использования новой партии реактивов, но не реже 1 раза в квартал.
Проведение измерения
Фильтр с отобранной пробой переносят в химический стакан, добавляют 5 мл фосфатного буфера и перемешивают интенсивно в течение 10 мин стеклянной палочкой или на магнитной мешалке. В пробирки вносят 1 мл эмульсии оливкового масла и 8 — 10 минут выдерживают в водяной бане при 37 +/- 0,5 °C, затем не вынимая добавляют в каждую пробирку по 0,5 мл раствора фермента (пробы), перемешивают и оставляют при 37 °C на 1 час (точно) для проведения липолиза. По истечении этого времени в каждую пробирку добавляют 5 мл экстракционного раствора из бюретки и интенсивно встряхивают в течение 3 минут.
Определение содержания образовавшейся жирной кислоты проводят аналогично градуировочным растворам. Раствором сравнения служит эмульсия с добавлением фосфатного буфера, которым обработан чистый фильтр. Остальные реактивы добавляют в том же количестве, как при анализе проб. Концентрацию жирной кислоты находят по графику.
Расчет концентрации
Концентрацию липазы микробной (C) в воздухе (в мг/м3) вычисляют по формуле:
C = [(a * B1 * B2)/(М * А * Б3 * V)] * 1000, где
a — концентрация жирной кислоты в анализируемом растворе, найденная по графику, мкг/мл;
B1 - общий объем раствора для экстракции жирных кислот, мл;
B2 — общий объем раствора пробы с ферментом, мл;
Б3 — объем раствора пробы с липазой, взятый для инкубирования, мл;
V — объем воздуха, отобранный для анализа и приведенный к стандартным условиям, л (см. Приложение 1);
1000 — коэффициент пересчета на 1 м3;
М — молекулярная масса жирной кислоты;
А — липолитическая активность липазы, ЛЕ/мг, ч. Единице липолитической активности (ЛЕ) соответствует такое количество фермента, которое освобождает 1 мкмоль жирной кислоты в течение часа при 37 °C. Или это количество микроэквивалентов жирной кислоты, выделяющихся в результате гидролитического действия 1 мг фермента липазы. Использована липаза с активностью 200000 ЛЕ/гч (200 ЛЕ/мг ч).
(a * B1)/М — количество мкмоль жирной кислоты в градуировочном растворе. Так как 200 мкэквив. жирной кислоты дает 1 мг липазы, то (a * B1)/М мкэквивалентов дает
Эти А мг липазы содержит Б3 = 0,5 мл пробы, объем всей пробы фермента B2 = 5 мл.
V/1000 количество м3 воздуха, отобранного для анализа.
Приложение 1
Приведение объема воздуха к стандартным условиям проводят по следующей формуле:
V20 = [V * (273 + 20) * P]/[(273 + t°) * 101,33], где
V — объем воздуха, отобранный для анализа, л;
P — барометрическое давление, кПА (101,33 кПа = 760 мм рт. ст.)
t — температура воздуха в месте отбора пробы, °C.
Для удобства расчета V20 следует пользоваться таблицей коэффициентов (приложение 2). Для приведения воздуха к стандартным условиям надо умножить V на соответствующий коэффициент.
КОЭФФИЦИЕНТ K ДЛЯ ПРИВЕДЕНИЯ ОБЪЕМА ВОЗДУХА К СТАНДАРТНЫМ УСЛОВИЯМ