Метод выявления дрожжей и плесневых грибов в пищевых продуктах. Методические рекомендации
(утв. Минздравом России 20.02.2004 № 24ФЦ/900)
Примечание
Документ введен в действие с 20 февраля 2004 года.
Утверждаю
Заместитель Главного
государственного
санитарного врача
Российской Федерации -
Главный врач Федерального
центра госсанэпиднадзора
Минздрава России
Е. Н. Беляев
20 февраля 2004 г. № 24ФЦ/900
МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ ДРОЖЖЕЙ И ПЛЕСНЕВЫХ ГРИБОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
20 февраля 2004 года
1. Разработаны: Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России, ОАО «Лианозовский молочный комбинат», фирмой «Лаб-БиоМед».
2. Утверждены и введены в действие Заместителем главного государственного санитарного врача Российской Федерации — Главным врачом Федерального центра госсанэпиднадзора Минздрава России Е.Н. Беляевым.
1. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие Методические рекомендации устанавливают методы проведения лабораторных исследований по выявлению дрожжей и плесневых грибов в определенной навеске пищевых продуктов.
1.2. Методические рекомендации разработаны в соответствии с Федеральным законом «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения», Положением о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании, Положением о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации.
1.3. Методические рекомендации предназначены для применения в лабораториях пищевой промышленности, осуществляющих производственный контроль пищевых продуктов.
2. Нормативные ссылки
2.1. Федеральный закон «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» № 52-ФЗ от 30 марта 1999 г.
2.2. Закон РФ «О защите прав потребителей» от 7 февраля 1992 г.
2.3. Закон РФ «О качестве и безопасности пищевых продуктов» № 29-ФЗ от 2 января 2000 г.
2.4. «Положение о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации», утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации № 554 от 24 июля 2000 г.
2.5. «Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании», утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации № 554 от 24 июля 2000 г.
2.6. СП 1.2.731-99 Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами.
2.7. ГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов.
2.8. ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов.
2.9. ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов.
2.10. ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований.
2.11. ГОСТ 10444.12-88 Продукты пищевые. Метод определения дрожжей и плесневых грибов.
2.12. ГОСТ 9225-84 Молоко и молочные продукты. Методы микробиологического анализа.
2.13. ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовки проб к анализу.
2.14. ГОСТ 28805-90 Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества осмотолерантных дрожжей и плесневых грибов.
2.15. ГОСТ 19569-89 Стерилизаторы паровые медицинские. Общие технические требования и методы испытаний.
2.16. ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия.
2.17. ГОСТ 29227-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования.
2.18. ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия.
2.19. ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры.
2.20. ГОСТ 23932-90 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия.
2.21. ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия.
3. Требования к помещениям и технике безопасности
3.1. Требования безопасности, общее расположение лаборатории, а также ее инфраструктура должны удовлетворять требованиям СП 1.2.731, ГОСТ Р 51446.
<*> Производство питательных сред компании Merck KGaA имеет международный сертификат качества ISO 9001:2000.
4.1 Термостат, позволяющий поддерживать рабочую
температуру 30 °С с отклонением от заданной
+/- 1 °С
4.2 Автоклав или стерилизатор паровой медицинский ГОСТ 19569
4.3 Облучатель бактерицидный
4.4 Весы лабораторные с наибольшим пределом ГОСТ 24104
взвешивания 200 г и допустимой погрешностью
+/- 2 мг
4.5 Шкаф сушильно-стерилизационный, обеспечивающий
поддержание заданного температурного режима в
диапазоне от 50 до 200 °С с погрешностью
+/- 2 °С
4.6 Микроскоп световой биологический с увеличением
х
900 - 1000
4.7 Холодильник, позволяющий поддерживать ГОСТ 16317
температуру +2 - 4 °С
4.8 Гомогенизатор бактериологический
перистальтического типа Masticator
(или аналогичный) со стерильными
полиэтиленовыми пакетами
4.9 Пипетки градуированные 1-го и 2-го классов ГОСТ 29227
точности вместимостью 1 куб. см, 10 куб. см
4.10 Пробирки бактериологические вместимостью ГОСТ 25336
10 куб. см
4.11 Чашки бактериологические (Петри) ГОСТ 23932
4.12 Посуда широкогорлая ГОСТ 25336
4.13 Горелка газовая или спиртовая ГОСТ 25336
4.14 Шпатели 15 — 20 см
4.15 Спирт этиловый ректификованный технический ГОСТ 18300
4.16 Метиленовый синий
4.17. Жидкая среда Сабуро 2% глюкозы Merck Cat. № 1.08339.0500
4.18. Селективный агар YGC с хлорамфениколом Merck Cat. № 1.16000.0500
Допускается применение других средств измерения и оборудования с аналогичными характеристиками.
5. Сущность метода
Метод основан на высеве определенного количества продукта в жидкую среду для обогащения; инкубировании посевов; последующем пересеве культуральной жидкости на поверхность агаризованной селективной среды с антибиотиком для выделения и дифференциации дрожжей и плесневых грибов по характеру роста.
6. Методы отбора проб
Отбор проб пищевых продуктов, маркировка, сопроводительная документация, транспортировка и хранение в соответствии с ГОСТ 26668, ГОСТ 26809, ГОСТ 92225 и нормативно-технической документацией на анализируемый вид продукта.
7. Порядок подготовки к испытанию
7.1. Подготовка посуды и материалов в соответствии с ГОСТ 9225.
7.2 Состав, приготовление и условия хранения питательных сред.
7.2.1 Жидкая среда Сабуро 2% глюкозы (п. 4.17).
В 1 куб. дм дистиллированной воды растворить 30 г сухой питательной среды. Стерилизовать в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °С 15 минут.
Жидкая среда прозрачная, слегка желтоватая.
рН приготовленной среды: 5,6 +/- 0,2 при 25 °С.
Приготовленная среда храниться в холодильнике при температуре (2 — 4) °С. Срок хранения готовой среды — 3 месяца.
7.2.2 Селективный агар YGC с хлорамфениколом (п. 4.18).
В 1 куб. дм дистиллированной воды растворить 40 г сухой питательной среды. Стерилизовать в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °С 15 минут.
Приготовленные чашки со средой прозрачные, слегка желтоватые.
рН приготовленной среды: 6,6 +/- 0,2 при 25 °С.
Чашки со средой хранить в холодильнике при температуре (2 — 4) °С. Срок хранения готовой среды на чашках — 4 месяца.
7.3. Приготовление раствора метиленового синего (концентрация 10 г/куб. дм).
Метиленовый синий в количестве 1,0 г перенести в фарфоровую ступку и растворить в дистиллированной воде. Раствор перенести в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и долить до метки.
Раствор хранить в закрытой посуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 месяцев.
7.4 Подготовка проб к испытанию
7.4.1. Подготовку проб пищевых продуктов проводят в соответствии с ГОСТ 26669, ГОСТ 9225.
8. Порядок проведения испытания
8.1. Для посева навеску продукта, в массе (объеме) которой предусматривается отсутствие дрожжей и плесневых грибов, отобрать весовым или объемным методом, внести в жидкую среду Сабуро, приготовленную по п. 7.2.1, и тщательно перемешать.
Соотношение массы (объема) продукта и жидкой среды 1:4.
Твердые образцы при необходимости следует измельчить в гомогенизаторе.
Посевы инкубировать при температуре (30 +/- 1) °С в течение (48 +/- 3) часа.
Рост дрожжей в жидкой среде Сабуро сопровождается, как правило, появлением мути, специфического запаха, брожения и газа.
8.2. После инкубирования по п. 8.1, посевы в количестве 0,1 куб. см внести на поверхность селективной агаризованной среды, YGC с хлорамфениколом, приготовленной по п. 7.2.2, и равномерно растереть шпателем.
8.2.1. Для предварительного выявления дрожжей и плесневых грибов инкубировать при температуре (30 +/- 1) °С в течение (24 +/- 2) часа.
8.2.2. Для окончательного выявления дрожжей и плесневых грибов инкубировать при температуре (30 +/- 1) °С в течение (48 +/- 3) часа.
8.3. После инкубирования по п. 8.2.1 провести предварительную оценку результатов.
8.3.1. Наличие видимого роста колоний на селективной агаризованной среде YGC с хлорамфениколом указывает на присутствие дрожжей и плесневых грибов в исследуемом продукте.
8.3.2. Отсутствие роста на агаризованной среде YGC с хлорамфениколом указывает на возможное отсутствие дрожжей и плесневых грибов в исследуемом продукте.
8.4. После инкубирования по п. 8.2.2 провести окончательную оценку результатов.
8.4.1. Отсутствие роста на агаризованной среде YGC с хлорамфениколом указывает на отсутствие дрожжей и плесневых грибов в исследуемом продукте.
8.4.2. Наличие характерных колоний на селективной агаризованной среде YGC с хлорамфениколом указывает на присутствие дрожжей или плесневых грибов в исследуемом продукте.
Рост дрожжей на агаризованной среде сопровождается образованием выпуклых, блестящих или матовых серовато-белых колоний.
Рост плесневых грибов сопровождается появлением плоских или пушистых разрастающихся колоний, часто с окрашенными, плодоносящими или спорообразующими структурами; окраска варьирует.
При необходимости для дифференциации дрожжей и плесневых грибов провести микроскопическое исследование. Дня этого из отдельных колоний приготовить мазки и окрасить их раствором метиленового синего, приготовленного по п. 7.3, выдержать 5 мин., слить краску, высушить на воздухе и микроскопировать. При микроскопировании дрожжи — одноклеточные микроорганизмы, клетки круглой, овальной или продолговатой формы, часто почкующиеся. Плесневые грибы состоят из нитей-гифов без перегородок; гифы образуют боковые выросты и разветвления.
Схема проведения испытаний приведена в Приложении № 1.
9. Учет и оценка результатов испытания
Если при испытании продукта на питательных средах обнаружен характерный рост дрожжей или плесневых грибов, то выдается заключение о наличии этих микроорганизмов в продуктах.
Результаты выявления дрожжей и плесневых грибов в определенной навеске продукта записывают:
Дрожжи или/и плесневые грибы выявлены (не выявлены) в Х г (куб. см) продукта, где Х — масса (объем) навески продукта, в которой выявляли дрожжи и плесневые грибы.
| Образец |
\/
| жидкая среда Сабуро соотношение (образец:среда) = (1:4) |
\/
| 48 +/- 3 ч, 30 °С |
0,1 куб. см\/
| Селективный агар YGC с хлорамфениколом |
\/
| 24 +/- 2 ч, 30 °С |
\/
┌────────────────────────────────┐
│Предварительный учет результатов│
└────────────────────────────────┘
<pre class="legal-pre"> ┌────────────────────┐ ┌────────────────────┐
│ Отсутствие роста │ │ Наличие роста │
│ ДРОЖЖИ И ПЛЕСНЕВЫЕ │ │ДРОЖЖИ ИЛИ ПЛЕСНЕВЫЕ│
│ГРИБЫ ПРЕДВАРИТЕЛЬНО│ │ ГРИБЫ │
│ НЕ ВЫЯВЛЕНЫ │ │ ВЫЯВЛЕНЫ │
└─────────┬──────────┘ └────────┬───────────┘
\/ \/
┌─────────────────┐ ┌─────────────────┐
│24 +/- 2 ч, 30 °С│ │24 +/- 2 ч, 30 °С│
└───────┬─────────┘ └───────┬─────────┘
\/ \/
┌───────────────────────────────────────┐ ┌──────────────────────┐
│ Окончательный учет результатов │ │Дифференциация дрожжей│
└───────────────────────────────────────┘ │ и плесневых грибов │
┌────────────────┐ ┌───────────────┐ └──────────────────────┘
│Отсутствие роста│ │ Наличие роста │
│ ДРОЖЖИ ИЛИ │ │ ДРОЖЖИ ИЛИ │
│ ПЛЕСНЕВЫЕ ГРИБЫ│ │ПЛЕСНЕВЫЕ ГРИБЫ│
│ НЕ ВЫЯВЛЕНЫ │ │ ВЫЯВЛЕНЫ │
└────────────────┘ └───────────────┘</pre>