Методические указания по количественному определению гистамина в рыбе с помощью тест-системы Ридаскрин Гистамин (RIDASCREEN(R) HISTAMIN) (производство фирмы Ар-Биофарм/R-Biopharm, Германия)
(утв. Минсельхозпродом России 10.02.2000)
Примечание
Документ включен в Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения (утв. Россельхознадзором 30.07.2009 № 02-03-48/563).
Утверждаю Заместитель руководителя
Департамента ветеринарии
В. В. Селиверстов
от 10 февраля 2000 г. № 13-7-2/1874
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО КОЛИЧЕСТВЕННОМУ ОПРЕДЕЛЕНИЮ ГИСТАМИНА В РЫБЕ
С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ РИДАСКРИН ГИСТАМИН
( RIDASCREEN® HISTAMIN)
(производство фирмы Ар-Биофарм/R-Biopharm, Германия)
| Представитель R-Biopharm в России и странах СНГ Директор ООО «СТАЙЛАБ» А.В. Галкин |
Начальник отдела лабораторной диагностики Департамента ветеринарии Минсельхозпрода России В.И. Белоусов |
|---|
Методика апробирована в Центральной научно-методической ветеринарной лаборатории Департамента ветеринарии Минсельхозпрода России (ЦНМВЛ) и во Всероссийском научно-исследовательском институте мясной промышленности (ВНИИМП)
| Директор ЦНМВЛ В.А. Седов Зав. лабораторией ВНИИМП Ю.Г. Костенко |
Заведующая отделом ИФА О.Н. Виткова |
|---|
1. Область применения методики
Методика предназначена для количественного определения гистамина в рыбе (скумбрия, ставрида, сайра, макрель, тунец, сельдь, шпрот, лосось и др.) с помощью тест-системы для иммуноферментного анализа RIDASCREEN® Histamin <*>.
<*> RIDASCREEN® является зарегистрированным товарным знаком фирмы R-Biopharm, Германия.
2. Краткое описание методики
3. Общие положения
Гистамин является одним из биогенных аминов, образующихся в рыбе при декарбоксилировании аминокислот, в том числе, в результате деятельности бактерий. Поскольку биогенные амины принадлежат к веществам, участвующим в обмене веществ высших животных, они легко метаболизируются и поэтому обычно хорошо переносятся человеком, если их концентрация в пище находится в пределах допустимого уровня.
При бактериальном загрязнении рыбы повышение уровня содержания биогенных аминов, в частности гистамина, может причинить вред здоровью потребителя. При содержании гистамина выше обычного уровня естественный механизм детоксификации аминов за счет деятельности ферментов — аминооксидаз (гистаминазы) уже не справляется. Повышенное поступление гистамина может вызвать так называемую «гистаминовую» мигрень (синдром Хортона), головную боль (невралгия Харриса, характеризующаяся болью в области глаз, лба, височной части головы, слезотечением, воспалением слизистой носа) и другие симптомы, включая тошноту, понос, испарину, повышенное выделение желудочного сока, учащение сердцебиения и снижение диастолического (нижнего) кровяного давления.
Бактерии Enterobacteriaceae, в частности колиформы, обладают высокой декарбоксилизующей активностью, причем даже при стерилизации рыбы наработка гистамина не прекращается за счет деятельности активных ферментов. Продуктами риска является в первую очередь рыба богатая гистидином, в частности скумбрия, ставрида, сайра, макрель, тунец, сельдь, шпрот, лосось и некоторые другие продукты, например, сыр, мясо, шампанское, вино, пиво и кислая капуста.
Содержание гистамина в пище нормируется во всех развитых странах и является важнейшим показателем свежести рыбы. Так, например, согласно СанПиН 2.3.2.560-96 Российской Федерации содержание гистамина в рыбе не должно превышать 100 мг/кг, в Соединенных Штатах норма гистамина составляет 50 мг/кг (производители рыбных консервов контролируют сырье по норме 5 — 15 мг/кг гистамина).
Традиционный фотоколориметрический метод контроля гистамина в рыбе трудоемок, занимает длительное время и характеризуется малой производительностью. В последнее время в рутинной лабораторной практике широко применяется более удобный иммуноферментный метод анализа (ИФА, ELISA), являющийся официальным методом контроля, принятым в странах Евросоюза (Директива 93/257/ЕЕС).
4. Нормативные ссылки
Использованы ссылки на следующие нормативные документы:
ГОСТ 12.1.007-76 ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие правила безопасности.
ГОСТ 12.1.018-86 ССБТ. Пожарная безопасность. Электростатическая искробезопасность. Общие требования.
ГОСТ 12.1.019-79 ССБТ. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура средств защиты.
ГОСТ 1770-74Е. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия.
ГОСТ 4025-83. Мясорубки бытовые. Технические условия.
ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия.
ГОСТ 7269-79. Мясо. Методы отбора образцов. Органолептические методы определения свежести.
ГОСТ 7328-82Е. Меры массы общего назначения и образцовые. Технические условия.
ГОСТ 7702.0-74. Мясо птицы. Методы отбора образцов. Органолептические методы определения качества.
ГОСТ 24104-88Е. Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия.
ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры.
ГОСТ 29169-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой.
ГОСТ 29224-91. Термометры ртутные стеклянные лабораторные. Технические условия.
ГОСТ 29227-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Общие требования.
5. Сущность метода
В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов с антителами. Планшет, входящий в состав набора RIDASCREEN® Histamin, сенсибилизирован гистамином. Анализ выполняется следующим образом.
Исследуемые (стандартные) образцы и раствор, содержащий антитела к гистамину дозируются в лунки планшета. При инкубации планшета в течение определенного времени молекулы гистамина, содержащегося в пробе (в стандартном растворе) и молекулы гистамина, адсорбированные на поверхности планшета, конкурируя между собой, взаимодействуют с внесенными антителами к гистамину.
После промывки планшета в лунки вносится раствор, содержащий вторичные антитела конъюгированные с пероксидазой, которые во время второй инкубации связываются комплексом гистамин-антитело на поверхности планшета. Несвязанные молекулы конъюгата удаляются при очередной промывке.
В лунки затем дозируется раствор субстрата (пероксид карбамида) и раствор хромогена (тетраметилбензидин). В процессе очередной инкубации, при химическом взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент молекулы конъюгата, связанной на поверхности лунки, выступает в качестве катализатора, образуются окрашенные продукты реакции. Через определенное время развития цветной реакции, в результате которой бесцветный хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется стоп-реагент, при этом голубой цвет раствора меняется на желтый.
Оптическая плотность в лунках, измеренная на спектрофотометре (ридере) при 450 нм, обратно пропорциональна концентрации гистамина в исследуемых образцах.
6. Предел обнаружения и диапазон определяемых концентраций
6.1. Предел обнаружения гистамина составляет: \cdot 2,5 мг/кг при навеске образца 2 г.
6.2. Диапазон определяемых концентраций гистамина составляет: \cdot 2,5 — 202,5 мкг/л при навеске образца 2 г.
7. Средства измерения, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
7.1 Средства измерения
Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104
Спектрофотометр (ридер), снабженный фильтром на 450 нм
Колба мерная 2-го класса точности вместимостью 1000 мл исп. 2 по ГОСТ 1770
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1 и 10 мл по ГОСТ 29227
7.2 Вспомогательные устройства
Центрифуга охлаждаемая с устанавливаемым ускорением 3000 д
Центрифужная пробирка на 20 мл с завинчивающейся крышкой
Устройство для встряхивания проб
Пробирки типа П-2-5-14/23 с притертыми стеклянными пробками
Стакан химический вместимостью 100 мл по ГОСТ 25336
Воронки лабораторные типа В-36 или В-75 по ГОСТ 25336
Стеклянный бюкс (стаканчик для взвешивания) по ГОСТ 25336
7.3 Реактивы и материалы
Тест-система для иммуноферментного анализа RIDASCREEN® Histamin в стандартной комплектации, включая:
Микротитровальный планшет на 48 лунок (6 стрипов по 8 лунок), сенсибилизированный гистамином
Комплект стандартных растворов гистамина в воде со следующими концентрациями (1 ppb = 1 мг/кг):
Не используйте тест-систему с истекшим сроком годности. Разбавление или замена реагентов может привести к потере чувствительности определения. Не заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами из другого набора с другим номером партии. Храните набор при температуре 2 - 8 °C. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ НАБОР. Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) упакуйте их в фольгированный пакет вместе с силикагелем (осушителем) и плотно закройте пакет. Поскольку стандартные растворы и раствор хромогена светочувствительны, избегайте попадания прямых солнечных лучей на флаконы с растворами.
Признаки порчи реагентов: В случае окрашивания раствора хромогена не рекомендуется использовать раствор, поскольку окрашивание раствора хромогена является признаком его порчи. В случае, если величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, не превышает 0,6, это также может быть признаком порчи реагентов.
8. Требования безопасности
8.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, указанные в технической документации на весы, спектрофотометр и вспомогательные устройства.
8.2. Помещение, в котором производится выполнение измерений, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией.
9. Требования к квалификации персонала
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают специалиста, имеющего высшее или среднее специальное химическое образование или опыт работы в химической лаборатории, владеющего техникой иммуноферментного анализа и освоившего метод в процессе стажировки.
10. Условия выполнения исследований
При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:
*Температура воздуха 20 +/- 5 °C;* *Атмосферное давление 84,0 - 106,7 кПа (630 - 800 мм рт. ст.);* *Влажность воздуха не более 80% при температуре 25 °C;* *Напряжение в сети 220 +/- 10 В;* *Частота переменного тока 50 +/- 1 Гц.*
11. Порядок отбора проб и подготовки к проведению исследований
11.1. Отбор проб осуществляют в соответствии с действующей нормативной документацией по отбору проб. Пробы доставляют в лабораторию немедленно после их отбора.
11.2. Анализ необходимо начать в день доставки пробы в лабораторию. При отсутствии такой возможности допускается хранение образцов не более чем 2 суток с момента отбора при температуре 2 — 8 °C, либо 5 — 6 месяцев при температуре -20 °C.
11.3 Приготовление вспомогательных растворов.
11.3.1. Приготовление 0,02 М фосфатного буферного раствора с твином, pH 7,2. Взвешивают 2,3 г безводного гидрофосфата натрия, 0,62 г дигидрата дигидрофосфата натрия и 9,0 г хлорида натрия. Навески переносят в мерную колбу на 1000 мл, добавляют 1 мл твин-20 и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают. Срок хранения раствора при температуре 2 — 8 °C — 4 дня.
12. Пробоподготовка
12.1 Пробу рыбы измельчают с помощью мясорубки либо другим способом.
12.2. Навеску 2 г фарша и 10 мл 0,02 М фосфатного буферного раствора с твином переносят в центрифужную пробирку на 20 мл, закрывают пробирку герметичной крышкой и энергично встряхивают в течение 30-ти минут с помощью устройства для встряхивания проб, либо вручную.
12.3. Пробирку помещают в центрифугу и центрифугируют при ускорении 3000 д и температуре 4 °C в течение 10 мин.
12.4 Верхний слой жира удаляется.
12.5 Часть водной вытяжки переносят в чистую пробирку на 5 мл.
12.6. Раствор разбавляют в десять раз фосфатным буферным раствором, например, переносят дозатором в чистую пробирку 100 мкл водной вытяжки, добавляют 0,9 мл фосфатного буфера и тщательно перемешивают.
12.7 Для анализа используют 50 мкл раствора.
13. Порядок проведения измерений
13.1. Предварительные замечания по проведению измерений с помощью тест-системы RIDASCREEN® Histamin.
Перед использованием тест-системы доведите температуру всех реагентов до комнатной (30 — 40 минут до температуры 18 — 20 °C).
Немедленно после использования охладите все оставшиеся реагенты до температуры 28 °C.
В процессе выполнения анализа не допускайте высыхания лунок планшета.
Воспроизводимость результатов иммуноферментного анализа существенно зависит от тщательности отмывки планшета в процессе анализа. Внимательно следуйте описанной далее процедуре отмывки планшета.
На всех стадиях инкубации избегайте воздействия прямого солнечного света.
13.2 Подготовка к измерениям
13.2.1 Микротитровальный планшет, сенсибилизированный гистамином.
Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов. Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с силикагелем (осушителем), закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2 — 8 °C.
13.2.2 Стандартные растворы.
Стандартные растворы гистамина поставляются готовыми для использования в следующих концентрациях:
*Стандарт 1 0 ppb* *Стандарт 2 50 ppb* *Стандарт 3 150 ppb* Стандарт 4 450 ppb *Стандарт 5 1350 ppb* *Стандарт 6 4050 ppb*
13.3 Процедура анализа
13.3.1. Вставьте в рамку планшета лунки в количестве, необходимом для выполнения всех запланированных определений в дубле (по 2 раза). Запишите координаты лунок, предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов. Пример формы записи приведен на Рис. 1.
13.3.2. С помощью дозатора добавьте по 50 мкл стандартных и исследуемых растворов в соответствующие пары лунок.
13.3.3. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл препарата антител (здесь и далее предпочтительно использование 8-канального дозатора, при этом раствор удобно отбирать из специальной ванночки или из чашки Петри). Путем осторожного постукивания по краям планшета перемешайте раствор в лунках и оставьте планшет на инкубацию в темноте в течение одного часа при комнатной температуре.
13.3.4. Вылейте жидкость из лунок, переверните рамку планшета и тщательно выбейте капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполните лунки 250 мкл фосфатного буферного раствора и снова опорожните лунки. Выбейте капельки жидкости как описано выше. Повторите процедуру промывки лунок еще два раза.
13.3.5. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл препарата конъюгата. Путем осторожного постукивания по краям планшета перемешайте раствор в лунках и оставьте планшет на инкубацию в темноте в течение получаса при комнатной температуре.
13.3.6. Промойте лунки планшета, следуя процедуре по п. 13.3.4.
13.3.7. Добавьте по 50 мкл субстрата и по 50 мкл хромогена в каждую лунку. Тщательно перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте.
13.3.6. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента и хорошо перемешайте. В течение 60-ти минут после добавления стоп-реагента измерьте оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм.
14. Обработка результатов исследования
Средние значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными и исследуемыми растворами делятся на среднее значение оптической плотности, измеренной в лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100. Таким образом, результат измерения оптической плотности выражается в процентах от оптической плотности лунки с нулевым стандартом, то есть:
Средняя оптическая плотность лунки со стандартом (пробой)
-------------------------------------- X 100 = % поглощения.
Средняя оптическая плотность лунки с нулевым стандартом
По величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных растворов и соответствующим значениям концентрации гистамина в мкг/кг (ppb) строится калибровочная кривая в полулогарифмической системе координат. Калибровочная кривая должна быть почти линейна в диапазоне 150 — 1350 мкг/кг (см. Рис. 2).
Концентрация гистамина в исследуемых растворах в мкг/кг (ppb) считывается по калибровочной кривой соответственно относительному поглощению, измеренному и вычисленному для этих растворов. Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется использовать специализированное программное обеспечение, например, RIDA®Soft* . При компьютерной обработке результатов следует руководствоваться инструкцией по использованию программного обеспечения. Внимание: Для того чтобы вычислить концентрацию гистамина в исследуемой исходной пробе, величину концентрации гистамина, полученную по калибровочной кривой, следует умножить на соответствующий фактор разбавления. При выполнении пробоподготовки и анализа в полном соответствии с приведенной методикой фактор разбавления принимает следующие значения:
Фактор разбавления для проб рыбы равен 50.
15. Интерпретация результатов исследования
При контроле проб рыбы на соответствие санитарно-гигиеническим требованиям к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, принятым в Российской Федерации, найденная концентрация гистамина более 100 мг/кг (более 2000 мкг/кг по калибровочной кривой) позволяет рассматривать исследуемую рыбу как несоответствующую санитарно-гигиеническим требованиям. При меньшем содержании гистамина в рыбе найденная величина концентрации позволяет классифицировать рыбу по уровню свежести.