Методические указания по определению качества кормов для сельскохозяйственной птицы по степени окисления и гидролиза
(утв. Минсельхозом России 27.01.2003 № 13-5-02/0657)
Примечание
Документ включен в Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения (утв. Россельхознадзором 30.07.2009 № 02-03-48/563).
Утверждаю Заместитель руководителя Департамента ветеринарии Е. А. Непоклонов 27 января 2003 г. № 13-5-02/0657
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ КАЧЕСТВА КОРМОВ ДЛЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПТИЦЫ ПО СТЕПЕНИ ОКИСЛЕНИЯ И ГИДРОЛИЗА
ВВЕДЕНИЕ
Существенное влияние на развитие и продуктивность с/х птицы в условиях промышленного птицеводства имеет качество кормов и кормовых добавок. В рецепты кормов входят различные жиры и масла как растительного, так и животного происхождения. Состояние липидных компонентов оказывает существенное влияние на качество самого корма и, в конечном итоге, на продуктивность птицы.
При длительном хранении кормов происходит окисление и гидролиз липидов с образованием продуктов окисления и гидролиза. При окислении липидов образуются первичные продукты окисления — гидроперекиси и пероксиды, и вторичные — альдегиды и оксикислоты; при гидролизе — свободные жирные кислоты, ди- и моноглицериды.
Природные липиды различного состава и строения характеризуются различной устойчивостью в процессе переработки и хранения. На скорость окисления и гидролиза липидов влияют различные факторы. Гидролизу способствуют: высокая влажность, тепло, липолитические ферменты сырья и микроорганизмов. На скорость окисления липидов влияют солнечный свет, температура, наличие активаторов (ионы металлов) и ингибиторов (антиоксиданты) окисления, доступ кислорода и жирно-кислотный состав липидов.
Продукты окисления и гидролиза липидов отрицательно влияют на сохранность таких важных составляющих кормов, как витамины, жирные кислоты, белки, аминокислоты. Особое значение эта проблема приобрела в последние годы ввиду широкого использования БВМК для производства комбикормов. Из-за высокого содержания липидов и катализаторов процессов окисления — ионов металлов переменной валентности в их составе, действие антиоксидантов недостаточно эффективно.
Скармливание кормов с высоким содержанием продуктов окисления липидов, особенно альдегидов и оксикислот, приводит к существенному снижению продуктивности с/х птицы (на 7 — 20%), изменению биохимических показателей крови и печени и вызывает ряд патологических состояний: токсическую дистрофию печени, гемолиз эритроцитов, гидроперикардит, и др.
Продукты окисления липидов кормов вызывают достоверное снижение концентрации гемоглобина, общих липидов, витаминов A, E, C в крови и печени и существенное увеличение малонового диальдегида и холестерина в крови сельскохозяйственной птицы.
Активность ферментов антиоксидантной защиты организма: пероксидазы, каталазы и супероксиддисмутазы зависит от содержания перекисных соединений, альдегидов и оксикислот. Наиболее существенное влияние на активность ферментов оказывают корма с максимальным содержанием гидроперекисей и пероксидов. Альдегиды и оксикислоты вызывают разрушение мембран эритроцитов и снижение активности ферментов в крови цыплят.
1. МАКСИМАЛЬНО ДОПУСТИМЫЕ УРОВНИ ПРОДУКТОВ ОКИСЛЕНИЯ И ГИДРОЛИЗА ЛИПИДОВ КОМБИКОРМОВ И БВМК
На основании проведенных комплексных исследований были определены максимально допустимые уровни (МДУ) продуктов окисления и гидролиза липидов в БВМК и комбикормах для цыплят-бройлеров и кур-несушек (табл. 1). При этом, сроки хранения БВМК для цыплят-бройлеров не должны превышать 4-х месяцев, для кур-несушек — 5-ти месяцев.
МДУ продуктов окисления и гидролиза липидов в БВМК и комбикормах для сельскохозяйственной птицы
| Ед. изм. | Цыплята-бройлеры | Куры-несушки | |
|---|---|---|---|
| Кислотное число | мгKOH/г | 20 | 20 |
| Перекисное число <*> | (1/2O), ммоль/кг | 32,3 | 32,3 |
| Альдегидное число | мг/100 г | 4,5 | 7,0 |
| Оксикислоты | г/100 г | 3,5 | 5,0 |
<*> — включает гидроперекиси 23,6 ммоль/кг 1/2O и пероксиды 8,7 ммоль/кг 1/2O
2. ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ЛИПИДОВ КОМБИКОРМОВ И БВМК
Окисление и гидролиз липидов в БВМК и комбикормах обусловливает необходимость оценки их качества в производственных условиях. БВМК и комбикорма оцениваются, в основном, по содержанию первичных продуктов окисления — (перекисное число) и продуктов гидролиза (кислотное число), тогда как информативным является совокупная регистрация первичных и вторичных (альдегидов и оксикислот) продуктов окисления. Кроме того, по настоящей методике определения перекисного числа, фактически, определяют только гидроперекиси без учета пероксидов.
В связи с этим, рекомендуется комплексная оценка степени гидролиза и окисления липидов по следующим показателям:
кислотное число, свидетельствующее о гидролизе жира;
перекисное число, в которое входит два показателя: быстрореагируемые перекисные соединения — гидроперекиси, и труднореагируемые перекисные соединения — пероксиды, образующиеся при глубоком окислении (например, циклические, полимерные);
альдегидное число — свидетельствующее о накоплении вторичных продуктов окисления, образующихся при прогоркании липидов, выраженные в мг коричного альдегида на 100 г липидов;
количество оксикислот — свидетельствующее о накоплении вторичных продуктов окисления, образующихся при осаливании липидов.
3. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛИПИДОВ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ИХ ОКИСЛЕНИЯ И ГИДРОЛИЗА В БВМК И КОМБИКОРМАХ
3.1. Область применения
Методики предназначены для определения продуктов окисления и гидролиза липидов в комбикормах и БВМК с целью оценки качества.
Настоящие методики включают экстракцию липидов из БВМК и комбикормов с последующим определением в них кислотного числа, гидроперекисей, пероксидов, альдегидов и оксикислот.
3.2. Характеристики погрешности
3.3. Условия безопасного проведения работ
3.3.1. При измельчении образцов проб и их дальнейшей обработке следует руководствоваться инструкцией «Основные правила безопасной работы в химической лаборатории» — М., Химия, 1979.
3.3.2. При выполнении анализов необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.4.021.
3.3.3. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019.
3.3.4. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.
3.3.5. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать установленных норм по ГОСТ 12.1.005.
3.4. Требования к квалификации операторов
К проведению анализа допускаются лаборанты, изучившие методику и прошедшие инструктаж по технике безопасности при работе с вредными веществами.
3.5 Правила отбора проб.
Отбор проб проводят в соответствии с ГОСТ 13496.0.
При отборе проб составляется акт отбора по утвержденной форме, в котором указывается:
3.6. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ КИСЛОТНОГО ЧИСЛА
3.6.1 Принцип метода
Метод основан на нейтрализации свободных жирных кислот 0,1 н. раствором щелочи.
Кислотным числом называют количество миллиграммов едкого калия необходимое для нейтрализации свободных жирных кислот, содержащихся в 1 г исследуемых липидов.
3.6.2 Средства измерений, оборудование и материалы
Мельница лабораторная марки ЛМЗ
Воронка делительная коническая с краном вместимостью 250 см3 по ГОСТ 25336
Весы аналитические 2-го класса точности с пределом измерений от 0 до 200 г по ГОСТ 24104-80
Воронки стеклянные диаметром 5 или 9 см по ГОСТ 25336
Бумажные фильтры «красная лента» по ГОСТ 12026
Вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556
Чашки фарфоровые выпарительные по ГОСТ 9147
Колбы типа Кн конические исполнения 1 с притертыми пробками вместимостью 100 и 250 см3 по ГОСТ 25336
Цилиндры мерные вместимостью 10 и 100 см3 по ГОСТ 1770
Бюретки по ГОСТ 20292 вместимостью 25 см3.
3.6.3 Реактивы и материалы
Эфир диэтиловый (медицинский, серный) фармакопейный
Фенолфталеин по ГОСТ 5850, спиртовой 1%-ный раствор
Калия гидроокись по ГОСТ 24363, ч.д.а, 0,1 н раствор
Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962
Хлороформ по ГОСТ 20015, х.ч
Соляная кислота, 0,1 н раствор, фиксанал
Тимолфталеин спиртовой 1%-ный раствор
Калий йодистый по ГОСТ 4232 ч.д.а. или х.ч. насыщенный на холоде водный раствор (50 — 55%-ный раствор), свежеприготовленный
Кислота уксусная ледяная по ГОСТ 61, х.ч.
Примечание. Допускается использовать мерную посуду и другие средства измерения, имеющие такие же или лучшие метрологические характеристики.
3.6.4 Условия выполнения измерений
3.6.4.1 В диэтиловом эфире не должно содержаться перекисей.
Наличие перекисей в эфире определяют следующим образом:
В коническую колбу вместимостью 100 см3 вносят 25 мл эфира, добавляют 1 мл насыщенного раствора KI, 10 мл ледяной уксусной кислоты, встряхивают и ставят на 10 минут в темное место. Появление желтой окраски указывает на наличие перекисей.
Как всякие соединения кислого характера, перекиси образуют со щелочами нерастворимые в эфире соли. Поэтому эфир рекомендуется хранить над едким калием в темных склянках.
3.6.4.2 Притертые стеклянные поверхности не следует смазывать.
3.6.4.3. При титровании липидов с красным оттенком следует пользоваться тимолфталеином 1%-ным спиртовым раствором, который в кислой среде бесцветен, а в щелочной дает голубое окрашивание раствора; при титровании темноокрашенных липидов он принимает голубовато-зеленый или грязно-зеленый цвет.
3.6.4.4. Измерения проводят при рассеянном дневном свете или при искусственном освещении.
3.6.5 Подготовка к измерению
3.6.5.1 Приготовление вспомогательных растворов.
Приготовление 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина (тимолфталеина). 1 г индикатора растворяют в спирте в мерной колбе на 100 см3. Срок хранения не ограничен.
Приготовление 0,1 н водного раствора калия гидроокиси.
5,6 г гидроокиси калия растворяют в мерной колбе на 1000 см3 в дистиллированной воде. Срок хранения не ограничен.
Титр раствора калия гидроокиси перед использованием проверяют 0,1 Н раствором H2SO4, приготовленным из фиксанала.
Приготовление насыщенного раствора калия йодистого.
5,0 — 5,5 г калия йодистого растворяют в 10 см3 дистиллированной воды. Раствор йодистого калия хранят в темном сосуде. Перед использованием его проверяют, для чего в коническую колбу отбирают 30 см3 раствора уксусной кислоты и хлороформа, добавляют 1 см3 насыщенного раствора йодистого калия. Содержимое энергично взбалтывают и тотчас же прибавляют 100 см3 дистиллированной воды и 1 см3 1%-го раствора крахмала. Если образуется голубая окраска, для обесцвечивания которой требуется более 0,07 мл 0,01 н раствора тиосульфата натрия, то раствор йодистого калия не используют и приготавливают свежий раствор.
3.6.5.2 Очистка диэтилового эфира от перекисей.
В склянку с эфиром вносят 10 — 20 г гидроокиси калия, встряхивают и ставят в темное место на 1 сутки. Перед использованием эфир проверяют на наличие перекисей, по п. 3.6.4.1.
3.6.5.3. Расчет навески корма для выделения липидов из БВМК и комбикормов.
Для определения кислотного числа требуется не менее 1,5 г липидов (при меньшем количестве возрастает погрешность определения)
Расчет навески корма, для получения необходимого количества липидов производится по формуле:
где X — требуемая навеска корма, г
m1 - масса липидов необходимая для анализа, г
m2 - масса образца корма поступившего на анализ, г
m3 - содержание жира в поступившем образце, г
Пример. Поступил образец БВМК массой 2000 г с содержанием жира 5%. Таким образом содержание жира в 2000 г образца — 100 г. Следовательно, масса навески корма для определения кислотного числа будет равна
3.6.6 Выполнение измерений
3.6.6.1 Экстракция липидов
В делительную воронку, вместимостью 250 см3 последовательно вкладывают фильтр, состоящий из плотного тампона гигроскопической ваты, двух кружков фильтровальной бумаги, диаметр которых несколько превышает диаметр делительной воронки, и вновь ватный тампон. Общая высота фильтра должна быть около 50 мм.
Навеску корма, рассчитанную по п. 3.6.5.2., измельчают на лабораторной мельнице до мучнистого состояния, взвешивают с точностью до 0,01 г, и высыпают в делительную воронку, укрепленную на штативе. Под воронкой устанавливают выпарительную чашку, предварительно высушенную до постоянной массы.
В делительную воронку постепенно, по мере фильтрации, небольшими порциями приливают хлороформ. Завершение экстракции жира контролируют фильтровальной бумагой путем смачивания вытекающей капли. В случае отсутствия на бумаге жирового пятна экстракция считается законченной. После этого выпарительную чашку ставят на водяную баню и выпаривают эфир до постоянной массы. Чашку с липидами взвешивают с точностью до 0,01 г.
3.6.6.2 Определение кислотного числа.
Полученные при экстракции липиды количественно переносят смесью диэтилового эфира и этилового спирта (в соотношении 1:1), объемом 50 мл, в коническую колбу с притертой пробкой емкостью 250 мл. Затем добавляют несколько капель фенолфталеина и быстро титруют 0,1 н водным раствором едкого калия до отчетливого изменения окраски индикатора.
Для проверки чистоты реактивов проводят контрольное определение, используя те же реактивы, но без навески жира.
3.6.7 Обработка результатов измерений.
3.6.7.1 Масса выделенных липидов в г, рассчитывается по формуле:
3.6.7.2 Кислотное число, выраженное в мг KOH/г, вычисляют по формуле:
X — кислотное число жира, мг KOH/г
a — количество 0,1 н раствора едкого калия, пошедшее на титрование, мл
K <*> - поправка к раствору щелочи для перерасчета на точный 0,1 н раствор
5,61 — количество мг едкого калия, содержащегося в 1 мл 0,1 н раствора едкого калия;
mл — масса выделенных липидов, г.
За окончательный результат принимается среднее арифметическое двух параллельных определений.
<*> — Расчет коэффициента поправки
10,0 мл 0,1 н раствора соляной кислоты, приготовленного из фиксанала, оттитровывают в присутствии фенолфталеина (1 — 2 капли) приготовленным по п. 3.6.5.1. раствором гидрооксида калия до слаборозового окрашивания, не исчезающего в течение 1 минуты. Нормальность (н) раствора KOH определяют по формуле:
Y — количество мл KOH, пошедшее на титрование 10 мл 0,1 н HCl,
после чего К определяют по формуле:
Пример: на титрование 10 мл 0,1 н HCl пошло 9,8 мл р-ра KOH, тогда
н = 1/9,8 = 0,102, следовательно K = 0,102/0,1 = 1,02
3.6.8 Оценивание значений погрешности измерений.
3.6.8.1 Абсолютная погрешность определения массы липидов вычисляется по формуле:
\Delta_{\text{л}} = \sqrt 2 \times \Delta_{\text{в}}
где \Delta_{\text{в}} = \pm 0,01\text{г} — погрешность взвешивания.
3.6.8.2 Относительная погрешность определения массы липидов вычисляется по формуле:
\delta_{\text{л}} = \Delta_{\text{л}}m_{\text{л}}
где mл — масса выделенных липидов, г.
Относительная погрешность коэффициента экстракции по результатам статистической обработки экспериментальных данных принимается равной \delta_{\text{Е}} = 12%
3.6.8.3 Пределы относительной погрешности определения кислотного числа оцениваются по формуле:
\delta_{\text{к}} = \pm \sqrt \delta_{\text{Е}}^{2} + \delta_{\text{а}}^{2} + \delta_{\text{л}}^{2} \sqrt 2
где \delta_{\text{Е}} — относительная погрешность коэффициента экстракции липидов;
\delta_{\text{а}} — относительная погрешность определения объема 0,1 н раствора едкого калия, пошедшего на титрование;
\delta_{\text{л}} — относительная погрешность определения массы липидов.
Относительная погрешность коэффициента экстракции в рамках настоящих методик на основании статистического анализа опытных данных, принимаем \delta_{\text{Е}} = 12% (см. п. 3.6.8.2.);
Относительная погрешность определения объема едкого калия составляет \delta_{\text{а}} = 1% ; относительная погрешность определения массы липидов при определении кислотного числа равна \delta_{\text{л}} = 1% (масса навески липидов 1,5 г). При таких числовых значениях составляющих, пределы относительной погрешности определения кислотного числа равны:
3.7. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПЕРЕКИСНОГО ЧИСЛА (ГИДРОПЕРЕКИСЕЙ И ПЕРОКСИДОВ)
3.7.1 Принцип метода
Метод основан на окислении йодистого калия перекисными соединениями, содержащимися в липидах, в присутствии уксусной кислоты и титровании, выделившегося йода раствором тиосульфата натрия.
3.7.2 Средства измерений, оборудование и материалы
Весы аналитические 2-го класса точности с пределом измерений от 0 до 200 г по ГОСТ 24104
Колбы типа Кн конические исполнения 1 с притертыми пробками вместимостью 250 см3 по ГОСТ 25336
Цилиндры мерные вместимостью 25 и 100 см3 по ГОСТ 1770
Бюретки по ГОСТ 20292, вместимостью 25 см3
Секундомер по ГОСТ 5072 или часы песочные на 20 мин. по ГОСТ 10756
Пипетки вместимостью 1 см3 по ГОСТ 20292
Мельница лабораторная марки ЛМЗ
Воронка делительная коническая с краном вместимостью 250 см3 по ГОСТ 25336
Весы аналитические класса 2 с пределом измерений от 0 до 200 г по ГОСТ 24104
Стаканы химические термостойкие по ГОСТ 25336
Воронки стеклянные диаметром 5 или 9 см по ГОСТ 25336
Бумажные фильтры «красная лента» по ГОСТ 12026
Вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556
Чашки фарфоровые выпарительные по ГОСТ 9147
3.7.3 Реактивы и материалы
Хлороформ по ГОСТ 20015
Натрий серноватистокислый (тиосульфат натрия) по ГОСТ 4215, ч.д.а или х.ч. 0,01 н водный раствор
Калий йодистый по ГОСТ 4232 ч.д.а. или х.ч. насыщенный на холоде водный раствор (50 — 55%-ный раствор), свежеприготовленный
Кислота уксусная ледяная по ГОСТ 61, х.ч.
Крахмал растворимый по ГОСТ 10163, 1%-ный водный раствор, свежеприготовленный
Эфир диэтиловый (медицинский, серный) фармакопейный.
Натрий сернокислый, безводный по ГОСТ 4166, х.ч.
Примечание. Допускается использовать мерную посуду и другие средства измерения, имеющие такие же или лучшие метрологические характеристики.
3.7.4 Условия выполнения измерений
3.7.4.1 В диэтиловом эфире не должно содержаться перекисей.
Проверку диэтилового эфира на наличие перекисей проводят по п. 3.6.4.1.
3.7.4.2. Измерения проводят при рассеянном дневном свете или при искусственном освещении.
3.7.4.3 Притертые стеклянные поверхности не следует смазывать.
3.7.5 Подготовка к измерению
3.7.5.1 Приготовление вспомогательных растворов.
Приготовление насыщенного раствора калия йодистого (см. п. 3.6.5.1.).
Приготовление 1%-ного раствора крахмала.
В термостойкий химический стакан вместимостью 400 см3 помещают 1 г крахмала водорастворимого и приливают 90 см3 дистиллированной воды. Стакан ставят на плитку и кипятят в течение 3 минут. После этого раствор крахмала переливают в мерную колбу, вместимостью 100 см3 и доводят дистиллированной водой до метки. Хранят раствор крахмала в холодильнике. Срок хранения не ограничен.
Приготовление 0,01 н водного раствора тиосульфата натрия.
0,79 г тиосульфата натрия растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе на 1000 см3. Срок хранения не ограничен.
3.7.5.2. Очистку диэтилового эфира от перекисей проводят по п. 3.6.5.2.
3.7.5.3 Расчет навески корма для выделения липидов
Для определения перекисного числа требуется не менее 1,0 г липидов (при меньшем количестве возрастает погрешность определения)
Расчет навески корма для выделения липидов из БВМК и комбикормов проводят по п. 3.6.5.3
3.7.6 Выполнение измерений
3.7.6.1. Экстракция липидов из БВМК и комбикормов проводят по п. 3.6.6.1. В качестве экстрагента использовать диэтиловый эфир.
3.7.6.2 Определение гидроперекисей
Полученные при экстракции липиды, взвешенные с точностью до 0,01 г, количественно переносят 10-ти мл хлороформа в коническую колбу с притертой пробкой емкостью 250 мл, туда же приливают 15 мл ледяной уксусной кислоты. Затем в колбу быстро приливают 1 мл свежеприготовленного насыщенного раствора йодистого калия и закрывают пробкой.
Вращательным движением перемешивают содержимое колбы и ставят в темное место на 20 минут. По окончании выдержки в колбу приливают 100 мл дистиллированной воды, в которую заранее был добавлен 1 мл 1%-ного раствора крахмала, и немедленно титруют 0,01 н раствором тиосульфата натрия до исчезновения синей окраски.
3.7.6.3 Определение пероксидов.
После определения гидроперекисей колбу оставляют на 2 часа, для выявления пероксидов, которые по истечению указанного времени оттитровываются 0,01 н раствором тиосульфата натрия по п. 3.6.6.2.
3.7.7 Обработка результатов измерений.
3.7.7.1 Масса выделенных липидов в г, рассчитывается по п. 3.5.7.1
3.7.7.2 Перекисное число, выраженное в (1/2O) ммоль/кг <*> липидов, вычисляют по формуле:
X = [(Y — Y1) x 0,00127 x 100 x 78,7]/mл, где
Y — объем раствора тиосульфата натрия, пошедшего на титрование в рабочем опыте, мл
Y1 — объем раствора тиосульфата натрия, пошедшего на титрование в контрольном опыте, мл
0,00127 — количество йода, эквивалентное 1 мл 0,01 н раствору тиосульфата натрия
78,7 — коэффициент перевода из % I в ммоль/кг 1/2O
mл — масса выделенных липидов, г.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое двух параллельных определений.
<*> Примечание. Пересчет перекисного числа, выраженного в ммоль/кг 1/2O на перекисное число, выраженное в % йода, проводят по формуле:
X — перекисное число, выраженное в % йода;
X1 — перекисное число, выраженное в ммоль/кг 1/2O.
3.7.8 Оценивание значений погрешности измерений.
3.7.8.1 Абсолютная погрешность определения массы липидов вычисляется аналогично п. 3.6.8.1
3.7.8.2 Относительная погрешность определения массы липидов вычисляется аналогично п. 3.6.8.2
3.7.8.3 Пределы относительной погрешности определения перекисного числа рассчитываются по формуле:
{}_{\text{п}}^{\delta = \pm}{_{11\text{у л Е}}^{[1(1 - \text{у у})^{2} + 1(\text{у у } - 1)^{2}] \times \delta^{2} + \delta^{2} + \delta^{2}}}^{12} \sqrt 2
где y — объем тиосульфата натрия, пошедшего на титрование в рабочем опыте, мл;
y1 — объем тиосульфата натрия, пошедшего на титрование в контрольном опыте, мл;
\delta_{y} \approx \delta_{y1} — относительные погрешности определения объемов тиосульфата натрия;
\delta_{\text{л}} — относительная погрешность определения массы навески липидов;
\delta_{\text{Е}} — относительная погрешность определения значения коэффициента экстракции;
в рамках настоящих методик на основании статистического анализа опытных данных, принимаем \delta_{\text{Е}} = 12%
для данной методики характерно, что \delta_{\text{у}} = 1% , y = 0,5 мл, y1 = 0,1 мл, \delta_{\text{л}} = 1% (масса навески липидов 1 г).
В указанных условиях оценка пределов относительной погрешности определения перекисного числа (гидроперекисей и пероксидов) дает \delta_{\text{п}} = \pm 9%
3.8. МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ АЛЬДЕГИДНОГО ЧИСЛА
3.8.1 Принцип метода.
Метод основан на взаимодействии карбонильных соединений, содержащихся в липидах (главным образом ненасыщенных альдегидов) с бензидином. Альдегидное число определяют по изменению оптической плотности при \lambda = 360\text{нм} раствора жира в смеси хлороформ : этанол (1 : 1), обработанного бензидином.
3.8.2 Средства измерений, оборудование и материалы
Весы аналитические 2-го класса точности с пределом измерений от 0 до 200 г по ГОСТ 24104
Воронки стеклянные диаметром 5 см по ГОСТ 25336
Цилиндры мерные вместимостью 10 см3 по ГОСТ 1770
Секундомер по ГОСТ 5072-79 или часы песочные на 20 мин. по ГОСТ 10756
Спектрофотометр по ГОСТ 12083-78, фотоэлектроколориметр КФК-2
Колбы мерные с притертыми пробками вместимостью 25 см3 по ГОСТ 1770
Пипетки вместимостью 1 см3 по ГОСТ 20292
Мельница лабораторная марки ЛМЗ
Воронка делительная коническая с краном вместимостью 250 см3 по ГОСТ 25336
Весы аналитические класса 2 с пределом измерений от 0 до 200 г по ГОСТ 24104
Воронки стеклянные диаметром 5 или 9 см по ГОСТ 25336
Бумажные фильтры «красная лента» по ГОСТ 12026
Вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556
Чашки фарфоровые выпарительные по ГОСТ 9147
Цилиндры измерительные вместимостью 100 см3 по ГОСТ 1770
3.8.3 Реактивы и материалы
Хлороформ по ГОСТ 20015
Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962
Кислота уксусная ледяная по ГОСТ 61, х.ч.
Бензидин (4,4-диаминобифенил) по ТУ 6-09-4221 (ч.д.а.), 5 г/дм3 (0,5%) в смеси ледяной уксусной кислоты : этанол (1 : 1).
Эфир петролейный, марка 40/70 по ТУ 6-02-1244
Натрий сернокислый, безводный по ГОСТ 4166, х.ч.
Примечание. Допускается использовать мерную посуду и другие средства измерения, имеющие такие же или лучшие метрологические характеристики.
3.8.3 Условия выполнения измерений
3.8.4.1 В петролейном эфире не должно содержаться перекисей.
Проверку петролейного эфира на наличие перекисей проводят по п. 3.6.4.1.
3.8.4.2. Измерения проводят при рассеянном дневном свете или при искусственном освещении.
3.8.4.3. Измерения оптической плотности растворов следует проводить в рабочем диапазоне прибора. В случае превышения оптической плотности, необходимо разбавить анализируемую навеску жира, растворенную в смеси этанол : хлороформ (1:1), данной смесью и внести поправку в расчетную формулу.
3.8.4.4 Притертые стеклянные поверхности не следует смазывать.
3.8.5 Подготовка к измерению
3.8.5.1 Приготовление вспомогательных растворов.
Приготовление 0,5% раствора бензидина.
0,5 г бензидина растворяют в мерной колбе на 100 см3 в смеси уксусной кислоты : этанол (1 : 1). Для анализа используют свежеприготовленный раствор.
3.8.5.2. Очистку петролейного эфира от перекисей проводят по п. 3.6.5.2.
3.8.5.3 Расчет навески корма для выделения липидов
Примечание. Для определения альдегидного числа требуется от 0,05 до 0,15 г липидов (если липидов меньше 0,05 г, то увеличивается погрешность определения, если больше 0,15 г — происходит превышение оптической плотности, см. п. 3.8.4.3.)
Расчет навески корма для выделения липидов из БВМК и комбикормов проводят по п. 3.6.5.3
3.8.6 Выполнение измерений
3.8.6.1. Экстракция липидов из БВМК и комбикормов проводят по п. 3.6.6.1. В качестве экстрагента использовать петролейный эфир, марки 40/70
3.8.6.2 Определение альдегидов.
Полученные при экстракции липиды, около 0,1 г, взвешенные с точностью до 4-го знака, количественно переносят в мерную колбу с пришлифованной пробкой вместимостью 25 мл смесью этанола и хлороформа (1:1) и доводят объем раствора той же смесью до метки.
Измеряют оптическую плотность этого раствора (Д1) на фотоэлектроколориметре при длине волны около 360 нм или на спектрофотометре при длине волны 350 нм в кювете с толщиной слоя 1 см <*>.
<*> — В случае превышения оптической плотности см. п. 3.8.4.3.
Раствором сравнения служит смесь 96%-ного этанола и хлороформа (1:1). Затем в одну из двух конических колб с пришлифованными пробками помещают 10 мл раствора липидов, в другую — 10 мл растворителя этанол с хлороформом (1:1). В каждую колбу вводят по 1 мл 0,5%-го свежеприготовленного раствора бензидина в смеси 96%-го этанола и ледяной уксусной кислоты (1:1). Содержимое обеих колб тщательно перемешивают, выдерживают 15 минут и измеряют оптическую плотность раствора масла (Д2) в сравнении с растворителем (обработанным бензидином).
3.8.7 Обработка результатов измерений.
3.8.7.1 Масса выделенных липидов в г, рассчитывается по п. 3.6.7.1
3.8.7.2. Содержание альдегидов выражают в мг коричного альдегида на 100 г липидов, рассчитывают по формуле.
X = [(1,1 x Д2 — Д1) x 0,0094 x 100 x V]/[A x mл], где
Д1 — оптическая плотность раствора масла без бензидина,
Д2 — оптическая плотность раствора масла с бензидином,
1,1 — поправка на изменение объема при добавлении к 10 мл раствора 1 мл бензидина,
0,0094 — количество коричного альдегида, соответствующее единице оптической плотности при 360 нм,
V — объем раствора, в котором растворена навеска масла, мл
A — ширина кюветы (толщина слоя 1 см),
mл — масса выделенных липидов, г.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое двух параллельных определений.
3.8.8 Оценивание значений погрешности измерений.
3.8.8.1 Абсолютная погрешность определения массы липидов вычисляется аналогично п. 3.6.8.1
3.8.8.2 Относительная погрешность определения массы липидов вычисляется аналогично п. 3.6.8.2
3.8.8.3. Пределы относительной погрешности определения альдегидного числа спектрофотометрическим методом оцениваются по формуле:
где Д1 — оптическая плотность раствора липидов без бензидина;
Д2 — оптическая плотность раствора липидов с бензидином;
\delta_{V} — относительная погрешность определения объема раствора липидов;
\delta_{\text{А}} — относительная погрешность определения ширины кюветы (толщины оптического слоя);
\delta_{\text{Е}} — относительная погрешность определения значения коэффициента экстракции;
\delta_{\text{Р}} — относительная погрешность определения массы навески липидов;
\delta_{\text{Р}} = \sqrt 2 \times \Delta\text{в}P
где \Delta\text{в} = \pm 0,01\text{г} — погрешность взвешивания;
P = 0,1 г — масса навески липидов;
\delta_{\text{Д}1} \approx \delta_{\text{Д}2} — относительная погрешность определения оптической, плотности растворов липидов.
В конкретном случае реализации спектрофотометрического метода имеем: Д1 = 0,03; Д2 = 0,04; \delta_{\text{Д}1} \approx \delta_{\text{Д}2} \approx 1% ; \delta_{\text{А}} = 3% ; \delta_{V} = 1% ; \delta_{\text{Р}} = \sqrt 2 \times 0,010,1 \approx 14%
В приведенных условиях оценка пределов относительной погрешности определения альдегидного числа показывает, что \delta_{\text{а}} = \pm 14%
3.9. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОКСИКИСЛОТ ГРАВИМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
3.9.1 Принцип метода.
Метод основан на нерастворимости оксикислот в петролейном эфире. Оксикислоты определяются путем взвешивания на аналитических весах после их очистки от гидролизованного жира петролейным эфиром и высушиванием в сушильном шкафу до постоянной массы.
3.9.2 Средства измерений, оборудование и материалы
Весы аналитические 2 класса точности с пределом измерений от 0 до 200 г по ГОСТ 24104
Колбы типа Кн конические исполнения 1 с притертыми пробками вместимостью 250 см3 по ГОСТ 25336
Цилиндры мерные вместимостью 25, 50 и 100 см3 по ГОСТ 1770
Пипетки вместимостью 1 см3 по ГОСТ 20292
Мельница лабораторная марки ЛМЗ
Воронка делительная коническая с краном вместимостью 250 см3 по ГОСТ 25336
Весы аналитические класса 2 с пределом измерений от 0 до 200 г по ГОСТ 24104
Воронки стеклянные диаметром 5 или 9 см по ГОСТ 25336
Бумажные фильтры «красная лента» по ГОСТ 12026
Вата медицинская гигроскопическая по ГОСТ 5556
Чашки фарфоровые выпарительные по ГОСТ 9147
3.8.3 Реактивы и материалы
Эфир диэтиловый (медицинский, серный) фармакопейный
Эфир петролейный, марка 40/70 по ТУ 6-02-1244
Фенолфталеин по ГОСТ 5850, 1%-ный спиртовой раствор
Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 5962
Калия гидроокись по ГОСТ 24363, 2н спиртовой раствор
Соляная кислота о.с.ч. по ГОСТ 14261, 10%-ный раствор
Хлороформ по ГОСТ 20015
Натрий сернокислый, безводный по ГОСТ 4166, х.ч.
Примечание. Допускается использовать мерную посуду и другие средства измерения, имеющие такие же или лучшие метрологические характеристики.
3.9.4 Условия выполнения измерений
3.9.4.1. В диэтиловом и петролейном эфирах не должно содержаться перекисей. Проверку диэтилового и петролейного эфиров на наличие перекисей проводят по п. 3.6.4.1.
3.9.4.2. Измерения проводят при рассеянном дневном свете или при искусственном освещении.
3.9.4.3 Притертые стеклянные поверхности не следует смазывать.
3.9.5 Подготовка к измерению
3.9.5.1 Приготовление вспомогательных растворов.
Приготовление 2н спиртового раствора калия гидроокиси.
112 г гидроокиси калия растворяют в мерной колбе на 1000 см3 в этаноле. Срок хранения не ограничен.
Приготовление 1%-ного спиртового раствора фенолфталеина (см. п. 3.6.6.1.)
3.9.5.2. Очистку диэтилового и петролейного эфиров от перекисей проводят по п. 3.6.5.2.
3.9.5.3 Расчет навески корма для выделения липидов.
Для определения оксикислот требуется не менее 1 г липидов (при меньшем количестве возрастает погрешность определения)
Расчет навески корма для выделения липидов из БВМК и комбикормов проводят по п. 3.6.5.3
3.9.6 Выполнение измерений
3.9.6.1 Экстракция липидов.
В коническую колбу емкостью 250 мл с притертой пробкой вносят навеску измельченного корма рассчитанную по п. 3.5.5.2., взвешенную с точностью до 0,01 г, добавляют равный объем сернокислого натрия, тщательно перемешивают и заливают двойным объемом хлороформа или диэтилового эфира и оставляют на холоде в течение 4-х часов. Колбу с содержимым периодически встряхивают.
Через четыре часа содержимое фильтруют через бумажный фильтр в выпарительную чашку. Для полной экстракции навеску корма после фильтрации промывают растворителем в ту же выпарительную чашку. Завершение экстракции жира контролируют фильтровальной бумагой путем смачивания вытекающей капли. В случае отсутствия на бумаге жирового пятна экстракция считается законченной. После этого выпарительную чашку ставят на водяную баню и выпаривают эфир до полного удаления запаха. Оставшиеся липиды высушивают в сушильном шкафу при 75 °C до постоянного веса.
3.9.6.2 Определение оксикислот.
В коническую колбу емкостью 250 мл количественно переносят выделенные при экстракции липиды, взвешенные с точностью до 0,01, добавляют 50 мл 2н спиртового раствора KOH и омыляют перенесенные липиды на водяной бане в колбе с обратным холодильником в течение часа при 90 — 100 °C. Затем холодильник отсоединяют и при той же температуре удаляют спирт до полного исчезновения запаха. После этого, колбу вынимают из водяной бани, приливают 30 мл горячей дистиллированной воды и омыленный раствор переводят в делительную воронку, тщательно промывая колбу небольшими количествами горячей дистиллированной воды. В воронку приливают несколько капель фенолфталеина и разлагают мыло при сильном встряхивании горячей 10%-ной HCl, которую прибавляют в небольшом избытке. После охлаждения в воронку приливают медленной струей 50 мл петролейного эфира (темп. кип. до 60 °C). При этом содержимое воронки перемешивают круговыми движениями, чтобы предупредить образование комочков оксикислот, воронку встряхивают несколько раз и оставляют на 12 — 14 ч.
Во время отстаивания из раствора выпадают в виде хлопьев нерастворимые в петролейном эфире оксикислоты, которые сосредотачиваются на границе раздела эфирного раствора и водного, кислого слоя. Кислый водный слой спускают из воронки, а петролейноэфирный экстракт фильтруют через бумажный фильтр. Делительную воронку и фильтр тщательно промывают петролейным эфиром до полного удаления неокисленных жирных кислот.
Нерастворимые в петролейном эфире оксикислоты остаются на стенках делительной воронки и на фильтре. Их растворяют порциями горячего этилового спирта. Спиртовой раствор пропускают через тот же фильтр в другую колбу или стаканчик и концентрируют на водяной бане до небольшого объема. Остаток переводят количественно в предварительно прокаленный тигель с помощью небольших количеств диэтилового эфира. Растворители выпаривают и тигель с содержимым (оксикислоты и минеральные соли) высушивают при 100 °C до постоянной массы, которую учитывают после охлаждения в эксикаторе (а). Затем тигель с содержимым выдерживают в муфельной печи при температуре 600 °C в течение одного часа, до получения постоянной массы. После охлаждения проводят взвешивание тигля с минеральными веществами (в).
3.9.7 Обработка результатов измерений.
3.9.7.1 Масса выделенных липидов в г, рассчитывается по п. 3.5.7.1
3.9.7.2. Содержание оксикислот, свободных от минеральных веществ, вычисляют в процентах по формуле.
X — содержание оксикислот свободных от минеральных солей, %
а — вес тигля с оксикислотами и минеральными солями, г
в — вес тигля с минеральными солями, г
mл — масса выделенных липидов, г.
3.9.8 Оценивание значений погрешности измерений.
3.9.8.1 Абсолютная погрешность определения массы липидов вычисляется аналогично п. 3.6.8.1
3.9.8.2 Относительная погрешность определения массы липидов вычисляется аналогично п. 3.6.8.2
3.9.8.3 Пределы относительной погрешности определения оксикислот гравиметрическим методом оцениваются по формуле:
{}_{o}^{\delta = \pm}{_{\text{а в Р Е}}^{\delta^{2}(1 - \text{ва})^{2} + \delta^{2}(\text{ав} - 1)^{2} + \delta^{2} + \delta^{2}}}^{12} \sqrt 2 ,
где а — масса высушенных продуктов окисления, г;
в — масса зольного остатка, г;
\delta_{\text{а}} — относительная погрешность определения массы высушенных продуктов окисления;
\delta_{\text{в}} — относительная погрешность определения зольного остатка;
\delta_{\text{Е}} — относительная погрешность определения значений коэффициента экстракции;
\delta_{\text{Р}} — относительная погрешность определения массы навески липидов (масса навески 1 г)
В конкретных условиях применения гравиметрического метода оценим частные составляющие погрешности косвенного измерения содержания оксикислот в пробе.
Ввиду малости значений масс высушенных продуктов окисления и зольного остатка взвешивания количеств этих веществ необходимо выполнять с точностью не меньше \Delta_{B} = \pm 0,002\text{г} . При этом \delta_{\text{а}} = 0,0020,08 = 2,5% ; \delta_{\text{в}} = 0,0020,06 = 3% ; \delta_{\text{Е}} = 12% ; \delta_{\text{Р}} = 1% .
С такими частными составляющими оценка пределов относительной погрешности определения содержания оксикислот дает \delta_{o} = \pm 13% .
3.10. ОПЕРАТИВНЫЙ КОНТРОЛЬ ПОГРЕШНОСТИ ИЗМЕРЕНИЙ
В качестве оперативного контроля погрешности результатов методик количественного химического анализа, используем проверку выполнения норматива сходимости для двух параллельных определений заданного показателя: два результата X1 и X2 параллельных определений заданного показателя в образце считаются достоверными, если расхождение между ними не превосходит норматива сходимости d, т.е.
В рамках вышеизложенных методик X1 и X2 могут означать значения кислотного числа, перекисного числа, альдегидного числа или содержание оксикислот.
где \overline{X} = 0,5(X_{1} + X_{2})