МР № 01.038-08. Экспресс-метод токсиколого-гигиенической оценки парфюмерно-косметической продукции с помощью люминесцентного бактериального теста. Методические рекомендации
(утв. Роспотребнадзором 20.11.2008)
Внимание
Документ утратил силу в связи с изданием Методических рекомендаций МР 1.1.0119-17, утв. Роспотребнадзором 22.12.2017.
ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ
flowchart LR n0["МР N 01.038-08"]:::rst click n0 "https://bukva.ai/docs/01-038-08" "МР N 01.038-08. Экспресс-метод токсиколого-гигиенической оценки парфюмерно-косметической продукции с помощью люминесцентного бактериального теста. Методические рекомендации (утв. Р" n1["МР 1.1.0119-17"]:::rst click n1 "https://bukva.ai/docs/mr-1-1-0119-17" "МР 1.1.0119-17. 1.1. Общие вопросы. Гигиена, токсикология, санитария. Экспресс-метод токсиколого-гигиенической оценки парфюмерно-косметической продукции с помощью люминесцентного б" n2["МР 1.1.0120-18"]:::doc click n2 "https://bukva.ai/docs/mr-1-1-0120-18" "МР 1.1.0120-18. 1.1. Общие вопросы. Гигиена, токсикология, санитария. Экспресс-метод токсиколого-гигиенической оценки парфюмерно-косметической продукции с помощью люминесцентного б" n0 --> n1 n1 --> n2 classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000; classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000; classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;
Утверждаю
Главный врач ФГУЗ «Федеральный
центр гигиены и эпидемиологии»
Федеральной службы по надзору
в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека
Председатель
Лабораторного Совета
Федеральной службы по надзору
в сфере защиты прав потребителей
и благополучия человека
А. И. Верещагин
20 ноября 2008 года
ЭКСПРЕСС-МЕТОД ТОКСИКОЛОГО-ГИГИЕНИЧЕСКОЙ ОЦЕНКИ ПАРФЮМЕРНО-КОСМЕТИЧЕСКОЙ ПРОДУКЦИИ С ПОМОЩЬЮ ЛЮМИНЕСЦЕНТНОГО БАКТЕРИАЛЬНОГО ТЕСТА
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ № 01.038-08
Методические рекомендации разработаны ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в г. Москве» (Завьялов Н.В., Клочкова С.И., Скворцова Е.Л.), МГУ им. М.В. Ломоносова (Данилов В.С., Юдина Т.П.).
Методические рекомендации содержат описание метода токсикологического тестирования парфюмерно-косметической (ПК) продукции с применением в качестве тест-объекта реактива люминесцентных бактерий «Эколюм» и определяют порядок проведения испытаний следующих видов ПК продукции: жидкие пеномоющие средства (пена для ванн, гель для душа, жидкое туалетное мыло); шампуни для волос и тела; дезодоранты и депиляторы в аэрозольной упаковке; парфюмерные жидкости (туалетная и парфюмерная вода, духи, одеколон, лосьоны после бритья и пр.); водно-спиртовые, пропиленгликолевые экстракты, ароматические экстракты, масляные экстракты; жиросодержащие косметические средства (лосьоны, косметические эмульсии, косметическое молочко); кремы косметические, лаки маникюрные и средства для ухода за ногтями.
Методические рекомендации предназначены для скрининговой оценки вновь разрабатываемой и серийно выпускаемой ПК продукции с учетом общетоксического и раздражающего действия.
Методика может быть применена в качестве самостоятельного экспресс-метода или в сочетании с другими токсиколого-гигиеническими методами.
Методические рекомендации предназначены для учреждений Государственной санитарно-эпидемиологической службы РФ, учреждений научно-исследовательского и практического профиля, осуществляющих разработку новых видов ПК продукции и контроль ее качества.
Результаты исследования качества ПК продукции учитывают при определении уровня их возможного прямого или косвенного влияния на здоровье человека.
1. Закон РСФСР «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» от 19 апреля 1991 г.
2. «Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании», утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации от 5 июня 1994 г. № 625.
3. Руководство Р 1.1.003-96 «Общие требования к построению, изложению и оформлению нормативных и методических документов системы государственного санитарно-эпидемиологического нормирования».
4. Руководство Р 1.1.001-96 «Общие требования к организации разработки нормативных и методических документов системы государственного санитарно-эпидемиологического нормирования».
5. ГОСТ Р 1.5-92. «Государственная система стандартизации Российской Федерации. Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов».
6. СанПиН 1.2.681-97 «Гигиенические требования к производству и безопасности парфюмерно-косметической продукции».
7. МУ 05 РЦ/3140 «Методические указания по проведению токсикологических исследований ингредиентов косметических средств в эксперименте на животных».
8. МР 11-1/131-09 «Определение токсичности химических соединений, полимеров, материалов и изделий с помощью люминесцентного бактериального теста».
Экотоксикологический государственный контроль осуществляется с целью регулярного слежения за соблюдением нормативов качества окружающей среды и предупреждения попадания токсических веществ в водные объекты.
Химическое загрязнение воды — изменение химического состава воды, возникшее под прямым или косвенным воздействием производственной деятельности и вызывающее снижение ее качества, и возможную опасность для здоровья населения.
Токсичность — степень проявления ядовитого действия разнообразных химических соединений и их смесей. Токсичность — один из важных факторов, определяющих качество воды, достаточно информативный, существенно дополняющий наше представление о степени опасности или безопасности воды при ее использовании, являющийся необходимой составной частью комплексной системы контроля при стандартном анализе воды.
Критерий токсичности (индекс токсичности) — достоверное количественное значение тест-параметра, на основании которого делается вывод о токсичности воды. Среди тест-параметров наиболее часто используются выживаемость, плодовитость, подавление ферментативной и метаболической активности организмов.
Тест-реакция — это изменение какого-либо биохимического, морфологического, поведенческого или функционального показателя у тест-объекта под воздействием токсиканта или их смесей.
Биотестирование — проведение анализов по определению токсичности с помощью живых организмов. Результаты оперативно сигнализируют об опасном воздействии химического загрязнения на жизнедеятельность организмов, причем не по отдельным компонентам, а по их смесям, часто неизвестной природы и не выявляемых другими методами анализа токсических веществ.
Токсические эффекты, регистрируемые методами биотестирования, включают комплексный, синергический, антагонистический и дополнительные воздействия всех химических, физических и биологических компонентов, присутствующих в исследуемой воде, неблагоприятно влияющие на физиологические, биохимические и генетические функции тест-организмов.
Биолюминесценция — интенсивное свечение в видимой области спектра, отражающее специфическую ферментативную функцию и общую метаболическую активность организмов.
В качестве тест-объекта используются препараты «Эколюм» лиофилизированных люминесцентных бактерий или ферментные препараты бактериальной люциферазы. Методика основана на определении изменения интенсивности бактериальной биолюминесценции при воздействии химических веществ, присутствующих в анализируемой пробе, по сравнению с контролем. Люминесцентные бактерии оптимальным образом сочетают в себе различные типы чувствительных структур, ответственных за генерацию биоповреждений (клеточная мембрана, цепи метаболического обмена, генетический аппарат), с экспрессностью, объективным и количественным характером отклика целостной системы на интегральное воздействие токсикантов. Это обеспечивается тем, что люминесцентные бактерии содержат фермент люциферазу, осуществляющую эффективную трансформацию энергии химических связей жизненно важных метаболитов в световой сигнал на уровне, доступном для экспрессных и количественных измерений.
Критерием токсического действия является измерение с помощью прибора «Биотокс-10» интенсивности биолюминесценции тест-объекта под воздействием химических соединений, содержащихся в экстрактах ПК продукции по сравнению с раствором, не содержащим токсических веществ, или эталонной пробой. Уменьшение интенсивности биолюминесценции пропорционально токсическому эффекту.
При изучении токсикологических свойств ПК продукции и ее химических ингредиентов люминесцентный бактериальный тест показывает хорошую корреляцию с их действием на высших животных, метод Драйзе, культуры клеток человека, подкожную адсорбцию, фототоксичность и т.п.
5. Количественная оценка параметров тест-реакции
Токсическое действие исследуемой пробы определяется по ингибированию интенсивности ее биолюминесценции за 30-минутный (в экспрессном варианте — 5 минут) период экспозиции. Количественные оценки тест-реакции выражаются в виде безразмерной величины — индекса токсичности «Т» и функциональными токсикологическими параметрами ЕС20 и ЕС50.
Индекс токсичности «Т» равен отношению
где Iо и I соответственно интенсивность биолюминесценции контроля и опыта при фиксированном времени экспозиции исследуемой пробы с бактериальным препаратом.
Методика допускает три пороговых уровня индекса токсичности:
-
допустимая степень токсичности образца: индекс токсичности Т меньше 20;
-
образец сильно токсичен: индекс токсичности Т равен или более 50.
Токсикологические параметры пробы ЕС20 и ЕС50, определяемые также посредством измерения Iо и I, позволяют быстро и экономно выяснить вопрос, при каких объемах исходного слабо токсического образца достигается установленный предел токсичности (ЕС20 и/или ЕС50) или при каких разведениях сильно токсический образец станет безопасным (величины менее ЕС20).
ЕС50 есть эффективный объем образца (в опытах с чистым химическим соединением — концентрация), вызывающий тушение свечения биосенсора на 50% по сравнению с контролем. В этом случае образец сильно токсичен (индекс токсичности равен 50). ЕС20 есть эффективный объем образца (в опытах с чистым химическим соединением — концентрация), который приводит к 20%-ному тушению свечения биосенсора по сравнению с контролем. В этом случае образец токсичен (индекс токсичности равен 20). Все значения величин менее ЕС20 свидетельствуют о том, что образец безвреден для человека.
Вычисление величин ЕС проводят с использованием гамма-функции. Гамма-функция (G) представляет собой зависимость отношения потери интенсивности свечения пробы к оставшейся интенсивности свечения пробы и описывается формулой:
где Iо и I соответственно интенсивность биолюминесценции в контроле и опыте.
Функция G очень удобна для точного определения величин ЕС20 и ЕС50 путем экстраполяции графической зависимости в случаях, когда токсичность образца очень небольшая или, наоборот, когда образец высоко токсичен. График G-функции в логарифмических координатах как функция изменения объема пробы (или концентрации отдельного вещества) есть теоретически прямая линия молекулярности реакции токсического вещества с одной или несколькими мишенями, связывающими эти токсиканты в тест-объекте. Люминометр «Биотокс-10» позволяет представлять величины G для каждой пробы, а также автоматически вычисляет величины ЕС20 и ЕС50.
Количественным параметром токсичности ПК продукции является степень разбавления образца по отношению к исходному продукту, приводящая к величине параметров ЕС20 (токсичности) и ЕС50 (острой токсичности). Количественным параметром оценки качества ПК продукции по сравнению с эталоном этой продукции, оценки ингредиентов ПК продукции и оценки фототоксичности ПК продукции служит индекс токсичности.
6. Оборудование, химическая посуда и реактивы
Измерительный прибор — люминометр типа «Биотокс-10» с набором кювет на 1,5 мл.
Лиофилизированная культура микроорганизмов «Эколюм» или ферментные препараты бактериальной люциферазы, ТУ 2639-236-00209792-01.
Весы аналитические с погрешностью взвешивания не более 1 мг, ГОСТ 24104-88.
pH-метр, ГОСТ 25.7416.071 или аналоги.
Сушильный электрический шкаф, ГОСТ 13474. Холодильник бытовой, обеспечивающий температуру от -18 до 4 °C.
Пробирки с притертыми пробками объемом 3 — 5 мл, ГОСТ 1770-74.
Дозаторы пипеточные на объемы 1,0 — 0,1 мл.
Цилиндры вместимостью 25, 50 мл, второго класса точности, ГОСТ 1770.
Воронки делительные на 100 мл типа ВД-1-100.
Фильтры АФА-ВП-10, ТУ 95-743-80 или обеззоленные типа ФОБ, ТУ 6-09-1678.
Стаканчики для взвешивания диаметром 30, 40 мм, ГОСТ 7148.
Вода дистиллированная, ГОСТ 6709.
Цинк сернокислый 7-водный, ГОСТ 4174.
Спирт этиловый, х.ч., ТУ 6-091710.
и прибора «Биотокс-10»
Биосенсор «Эколюм» представляет собой лиофилизированные люминесцентные бактерии или бесклеточные препараты, содержащие бактериальную люциферазу. Производится в соответствии с требованиями ТУ 2639-236-00209792-01. Биосенсор находится в стеклянных флаконах в среде инертных газов. При температуре 2 — 4 °C и ниже имеет гарантированный срок хранения не менее 1 года.
Специализированный люминометр «Биотокс-10» является измерительным прибором, предназначенным для проведения токсиколого-гигиенического мониторинга объектов окружающей среды, с использованием микробных биолюминесцентных сенсоров серии «Эколюм». Сочетание биохимического датчика с современной электронной аппаратурой позволяет обнаруживать с высокой достоверностью чрезвычайно малые количества токсических соединений и их смесей. В приборе используется простая и надежная технология отбора и предъявления проб, которая безопасна при проведении экологической экспертизы в лабораторных условиях.
Портативный прибор «Биотокс-10» может осуществлять следующие функции в автоматическом режиме: определение интенсивности биолюминесценции тест-объекта, индекса токсичности пробы, усредненной величины индекса токсичности, вычисление стандартного отклонения показателя токсичности, определения величин ЕС20 и ЕС50 — пороговых значений допустимой степени и острой степени токсичности образца, исследование динамики процесса взаимодействия токсикантов с тест-объектом, компьютерная обработка данных, наличие сигнала для оператора при превышении пробой допустимого уровня токсичности.
8. Условия безопасного проведения работ
При работе с химическими веществами необходимо соблюдать требования техники безопасности по ГОСТ 12.4.021.
Рабочие столы и поверхности должны содержаться в чистоте. В конце дня проводится влажная уборка рабочих поверхностей.
Безопасность при работе с электроустановками обеспечивается по ГОСТ 12.1.019 и в соответствии с требованиями инструкций к оборудованию.
Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.
Используемые в качестве биотестов лиофилизированные бактерии непатогенны, однако после каждого анализа необходимо стерилизовать всю использованную посуду, остатки растворов в сушильном шкафу при 105 °C в течение 1 часа.
Хранить тест-культуру «Эколюм» в холодильнике при температуре от -18 °C до +4 °C, следует беречь культуру лиофилизированных бактерий от нагревания и резкой смены температуры.
проводящих биотестирование
Определение токсичности по настоящей методике выполняется оператором с квалификацией лаборант, имеющий опыт работы в области токсикологии.
10. Условия выполнения измерений
Биотестирование проводится в нормальных лабораторных условиях в соответствии с ГОСТ 15150. Помещение не должно содержать токсичных паров и газов.
Температура окружающего воздуха в лаборатории от +18 до 25 °C. Относительная влажность воздуха 80 +/- 5%. Атмосферное давление 84 — 106 кПа (630 — 800 мм рт. ст.). При использовании электроприборов частота переменного тока 50 +/- 1 Гц. Напряжение сети 220 +/- 10 В.
Освещение помещения естественное или искусственное, не ограничивается особыми требованиями.
11. Подготовка к проведению измерений
Предварительная подготовка к отбору проб и выполнению биотестирования должна обеспечивать подготовку посуды, мест хранения отобранных проб, а также подготовку рабочего места для обработки проб и исследования их на токсичность. Все процедуры предварительной подготовки должны исключить попадание токсичных, органических и каких-либо других веществ в исследуемый образец.
11.1 Подготовка посуды для отбора, хранения проб
и биотестирования
Обычно используется посуда из стекла. Посуда для отбора проб и биотестирования должна быть химически чистой. Она промывается смесью бихромата калия и серной кислоты (хромовой смесью). Стенки посуды осторожно смачиваются хромовой смесью, после чего на 2 — 3 часа посуда оставляется, затем она тщательно промывается водопроводной водой, нейтрализуется раствором пищевой соды и промывается 3 — 4 раза дистиллированной водой. Для мытья посуды не разрешается пользоваться синтетическими поверхностно-активными веществами и органическими растворителями. Посуду для отбора проб сушат на воздухе, а используемую для биотестирования, за исключением мерной, — в сушильном шкафу при 105 °C в течение 1 часа.
Химически чистая посуда для биотестирования должна храниться с закрытыми стеклянными притертыми пробками или завинчивающимися крышками в защищенных от пыли ящиках лабораторного стола или на закрытых полках, стеллажах и т.п.
11.2 Подготовка проб. Извлечение водорастворимых форм
химических соединений из ПК продукции
Извлечение водорастворимых форм химических соединений из ПК продукции. Экстракты из образцов готовят путем настаивания в дистиллированной воде. Соотношение веса или объема образца и объема воды, а также продолжительность экстракции приведены в таблице 1. В сосуд помещают объем жидкого образца (или навеску порошкового образца), заливают определенным объемом дистиллированной воды (комнатная температура, pH 7,0 — 7,4) и выдерживают определенное время.
В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ВИДА ПРОДУКЦИИ
| Вид ПК продукции | Масса или объем образца | Объем дистиллированной воды, мл | Первичная степень разведения | Продолжительность экстракции |
|---|---|---|---|---|
| Жидкие пеномоющие средства (пена для ванн, гель для душа, жидкое туалетное мыло), шампуни для волос и тела | 1 мл | 20 | 1:20 | 10 мин. |
| Жиросодержащие косметические средства (лосьоны, косметические эмульсии, косметическое молочко); ароматические экстракты, масляные экстракты | 0,1 мл или 0,1 г | 100 | 1:1000 | 1 час |
| Спиртосодержащая продукция (лосьоны, одеколоны, духи, туалетная и парфюмерная вода) | 1 мл | 20 | 1:20 | 10 мин. |
| Дезодоранты и депиляторы в аэрозольной упаковке | 0,1 мл | 100 | 1:1000 | 10 мин. |
| Кремы косметические | 1 г | 10 | 1:10 | 1 час |
| Средства для ухода за ногтями (лаки, базы и основы под лак, укрепители и пр.) | 1 г | 20 | 1:20 | 1 час |
ПК продукция, представленная маслосодержащими средствами и кремами, требует периодического перемешивания в течение времени экстракции. В данных случаях после 1 часа экстракции осторожно отбирают водную фазу. Водную экстракцию из жиросодержащих косметических средств удобно проводить в воронках делительных, поскольку сливается нижняя водная фаза.
Средства для ухода за ногтями требуют предварительной подготовки. На предметное стекло (2 см х 2 см) ровным слоем наносят исследуемую навеску (1 г) образца и оставляют при комнатной температуре до полного высыхания. Подсушенный образец средства для ногтей помещают в сосуд с дистиллированной водой (комнатная температура, pH 7,0 — 7,4). Объем воды и время экстракции приведены в таблице 1.
После приготовления водных экстрактов из ПК продукции проводят их дополнительное разведение дистиллированной водой, получая по 4 пробы при следующих отношениях экстракт:вода — 1:1 (первичное разведение, приведено в таблице 1); 1:2; 1:4 и 1:8. Эта операция необходима для вычисления параметров ЕС.
Например, отбирают в пробирку с пробкой 5 мл первичного разведения шампуня (разведение 1:1), добавляют 5 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают. Получают пробу с разбавлением 1:2. Затем в другую пробирку отбирают 5 мл этого экстракта, добавляют 5 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают. Получают пробу с разбавлением 1:4. Потом в другую пробирку отбирают 5 мл этого экстракта, добавляют 5 мл дистиллированной воды и тщательно перемешивают. Получают пробу с разбавлением 1:8.
При исследовании отдельных ингредиентов ПК продукции необходимо сделать 4 последовательных разведения дистиллированной водой, получая по 4 пробы при следующих отношениях экстракт:вода — 1:1; 1:2; 1:4 и 1:8. Эта операция необходима для вычисления параметров ЕС.
Не допускается консервирование проб, предназначенных для исследования на токсичность.
11.3 Подготовка тест-объекта «Эколюм»
и прибора «Биотокс-10»
Подготовка прибора «Биотокс-10».
Подготовку прибора «Биотокс-10» проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации.
Регидротация биосенсора «Эколюм».
Вскрыть флакон с лиофилизированным препаратом «Эколюм». Добавить 10 мл дистиллированной воды, pH 7,0 — 7,4, комнатной температуры для получения суспензии бактериального препарата. Желательно использовать стерилизованную дистиллированную воду. Рекомендуется несколько раз встряхнуть флакон с суспензией препарата.
Рекомендуется перемешивание рабочей суспензии препарата перед отбором определенных объемов для проведения анализа.
Выдержать суспензию в течение 30 минут.
Определение рабочей концентрации биосенсора «Эколюм».
Измерить фоновое значение прибора «Биотокс-10» (по инструкции к прибору, при счете 10 сек. без кюветы) и записать это значение.
Добавить 0,1 мл суспензии бактерий из флакона в кювету люминометра. Затем туда же добавить 0,9 мл дистиллированной воды (pH 7,0 — 7,4, комнатная температура).
Вставить кювету с биосенсором в люминометр и измерить величину интенсивности биолюминесценции. Свечение рабочей суспензии бактерий должно находиться в интервале, превышающим фоновое значение прибора в 25 — 250 раз. Если величина больше интервала, то следует разбавить суспензию бактерий дистиллированной водой и повторить измерение.
Если у биосенсора истек гарантийный срок хранения и/или он стал плохо растворяться в холодной дистиллированной воде, рекомендуется более энергично его встряхивать и отфильтровать суспензию бактерий через бумажный фильтр.
В стандартном анализе приготовляют контрольный образец путем смешения в кювете от люминометра 0,1 мл рабочей суспензии бактерий и 0,9 мл дистиллированной воды (pH 7,0 — 7,4). При приготовлении опытных образцов к 0,1 мл рабочей суспензии бактерий добавляют 0,9 мл пробы ПК продукции различного разведения. Температура дистиллированной воды и образцов должна быть одинаковой.
Измерение токсикологических параметров проводят с помощью прибора «Биотокс-10» в стандартном варианте через 30 минут экспозиции. В экспрессном варианте допустимо проведение анализа через 5 минут.
12.1 ПК продукция. Ингредиенты ПК продукции
При исследовании ПК продукции после вывода прибора в режим измерения ЕС определяется интенсивность свечения контрольной кюветы и 4 проб, полученных путем разбавления исследуемой пробы дистиллированной водой в следующих отношениях — 1:1, 1:2, 1:4 и 1:8. Для всех 4 проб автоматически определяется G-функция, значения которой заносятся в оперативную память микроконтроллера прибора. По данным этих измерений микроконтроллер при нажатии специальной кнопки клавиатуры управления производит автоматически вычисление коэффициентов ЕС20 и ЕС50 и представляет данные на дисплее.
При исследовании коэффициентов ЕС ингредиентов ПК продукции рекомендуется убедиться при измерении токсичности приготовленного раствора, что величина G для данной пробы не превышает значения 25. В случае если величина больше, может увеличиться погрешность измерения величин ЕС. В таком случае необходимо развести пробу дистиллированной водой.
Как при исследовании ПК продукции, так и ингредиентов, после определения, путем измерения величины ЕС20 — насколько надо разбавить раствор, чтобы он стал нетоксичным, необходимо учесть вклад этапа предварительного разбавления.
Следует обратить внимание, что при интенсивности биолюминесценции опыта больше или равной контролю, вычисление G-функции не производится. В этом диапазоне образец нетоксичен. Следует уменьшить степень первичного разбавления.
Для большей достоверности проведения измерений рекомендуется делать несколько параллельных разбавлений исходного образца.
12.2 Определение соответствия качества ПК продукции
по сравнению с эталонным образцом
В случае наличия эталонного образца ПК продукции исследования качества продукции проводятся по сравнению опытного и эталонного образцов. Водная экстракция из эталонного образца проводится, как указано выше, и этот раствор используется как контроль. Условия экстракции должны быть строго одинаковыми в контроле и опыте.
Измеряется свечение эталонной пробы и прибор запоминает эту величину. Затем измеряются повторности опытной пробы, и прибор автоматически фиксирует значения индекса токсичности каждой пробы и усредненную величину индекса токсичности. В этом анализе параметры ЕС не измеряются.
Оценку токсичности пробы проводят по относительному различию в интенсивности биолюминесценции контрольной и опытной проб и вычислению индекса токсичности «Т». Абсолютная величина интенсивности биолюминесценции контроля не имеет принципиального значения в диапазоне допустимых значений прибора «Биотокс-10».
Рекомендуется измерять три повторности водного экстракта ингредиента. Обработку результатов измерений токсичности выполняют путем расчета среднеарифметического значения величины индекса токсичности «Т» по формуле:
где Т1 — Т3 — повторности опытной пробы.
Величины Т1, Т2 и Т3 получают при измерении последовательности контроль и затем серия опытных образцов.
Прибор «Биотокс-10» автоматически определяет усредненный показатель индекса токсичности и погрешность измерения. Если погрешность измерения большая, необходимо увеличить число повторностей.
В случае определения токсичности пробы при малых разведениях можно определить, насколько это связано со значениями pH исследуемого раствора. Для этого измеряют pH пробы и, если величина pH находится за пределами 6,5 — 8,0, приводят pH до значений 7,0 — 7,4 и повторяют измерение токсичности.
В ряде случаев возможен вариант, когда интенсивность биолюминесценции в анализируемой пробе больше, чем в контроле. В таком случае независимо от величины отрицательного значения «Т» делается вывод об отсутствии токсичности образца, и индекс токсичности принимает нулевое значение.
12.3 Определение фототоксичности ПК продукции
При исследовании фототоксичности ПК продукции образцы предварительно подвергают освещению светом с длиной волны 300 — 750 нм и мощностью 5 Дж/кв. см в течение 60 мин.
Дальнейшие приготовления водных экстрактов и измерение токсичности образцов проводят как описано выше (п. 12.2). В качестве контроля используют водный экстракт из необлученной ПК продукции.
13. Обработка, оценка и оформление результатов
Оценку токсичности пробы проводят по относительному различию в интенсивности биолюминесценции контрольной и опытной проб и вычислению индекса токсичности «Т» и параметров ЕС20 и ЕС50.
В ряде случаев возможен вариант, когда интенсивность биолюминесценции в анализируемой пробе больше, чем в контроле. В таком случае независимо от величины отрицательного значения «Т» делается вывод об отсутствии токсичности образца, и индекс токсичности принимает нулевое значение.
По величине индекса токсичности анализируемые пробы классифицируются на три группы (таблица 2).
| Группы | Величина индекса токсичности «Т» | Вывод о степени токсичности пробы |
|---|---|---|
| 1 | Меньше 20 | Допустимая степень токсичности |
| 2 | От 20 до 50 | Образец токсичен |
| 3 | Равно или больше 50 | Образец сильно токсичен |
Количественные оценки токсичности ПК продукции (параметр ЕС20), ингредиентов и фоточувствительности ПК продукции (индекс токсичности) представлены в таблице 3.
КОЛИЧЕСТВЕННЫЕ ПАРАМЕТРЫ ОЦЕНКИ ТОКСИЧНОСТИ ПК ПРОДУКЦИИ
| Вид продукции | Т | ЕС20 |
|---|---|---|
| Жидкие пеномоющие средства (пена для ванн, гель для душа, жидкое туалетное мыло), шампуни для волос и тела | ||
| Спиртосодержащая продукция (лосьоны, одеколоны, духи, туалетная и парфюмерная вода) | 1:100 | |
| Жиросодержащие косметические средства (лосьоны, косметические эмульсии, косметическое молочко); ароматические экстракты, масляные экстракты | 1:4000 | |
| Дезодоранты и депиляторы в аэрозольной упаковке | 1:8000 | |
| Кремы косметические | 1:100 | |
| Средства для ухода за ногтями (лаки, базы и основы под лак, укрепители и пр.) | 1:100 | |
| Ингредиенты ПК продукции | 20 | Концентрация, вызывающая ЕС20 |
| Сравнение ПК продукции и ингредиентов с эталонным образцом | 20 | |
| Фототоксичность ПК продуктов | 20 |
ПК продукция признается токсичной, если согласно параметру ЕС20 необходимо большее разбавление, нежели указано в таблице 3. При достижении параметра ЕС50 продукция признается сильно токсичной.
При определении токсичности ингредиента ПК продукции нужно сопоставить концентрацию, вызывающую ЕС20, с концентрацией этого ингредиента в ПК изделии. Если она больше, то необходимы дополнительные анализы с применением других методов для заключения о возможности использования ингредиента.
В случае выявления дополнительной токсичности ПК продуктов после освещения необходимы дополнительные анализы с применением других методов.
При обнаружении отличия ПК продукции и ингредиентов от эталонных образцов на величину, большую Т = 20, следует провести дополнительные исследования качества продукции другими методами.
Результат токсикологического анализа представляется в виде протокола (Приложение 1).
токсикологического анализа
Контроль качества оценки токсичности объектов окружающей среды проводится по определению чувствительности используемых тест-организмов к модельному "эталонному" токсиканту цинку сернокислому 7-водному (ZnSO х 7H O). Расчет проводится по содержанию ионов цинка. Диапазон 4 2 концентраций модельного токсиканта, при действии которого в течение 30 минут интенсивность биолюминесценции ингибируется на 50%, составляет
0,6 — 1,5 мг/л.
Удовлетворительные результаты, полученные при проверке диапазона реагирования люминесцентных бактерий на модельный токсикант, не обеспечивают гарантии адекватного реагирования организмов на другие токсиканты и тем более их смеси, однако регулярно проводимая проверка позволяет выявить ошибки при приготовлении исследуемых смесей и растворов, нарушения, допускаемые в условиях проведения опытов.
Процедура определения диапазона реагирования тест-системы «Эколюм» на модельный токсикант проводится путем действия раствора, содержащего 4,4 мг/л цинка сернокислого при времени инкубации 30 минут с биосенсором. Должно происходить не менее чем 50%-ное ингибирование интенсивности биолюминесценции по сравнению с контролем. В случае если эта величина меньше, следует проверить точность приготовления исследуемых растворов, условий проведения опытов. Если все правильно, то биосенсор не используется.
15. Форма представления результатов анализа
Результат токсикологического анализа — индекс токсичности в документах, предусматривающих его использование, представляется в виде:
_
_
где X — среднее арифметическое определений. _
За результат анализа (X) принимают среднее арифметическое результатов трех (или более - до 10) параллельных измерений индекса токсичности.
Индекс токсичности Т вычисляется по формуле:
Т = 100(Iконтр. — Iопыт) / Iконтр.,
где Iконтр. и Iопыт соответственно интенсивности биолюминесценции бактерий в контрольной и опытной пробах.
Среднее квадратичное отклонение (сигма) результатов определений количественного выражения тест-реакции — индекса токсичности вычисляется по формуле:
____________
/n _ 2
/SUM (X - X )
/ i=1 i сигма = \/ -------------,
n - 1
где: X — i-й результат определений; i n — число параллельных определений. _
Среднее арифметическое X результатов определений количественного выражения тест-реакций вычисляется по формуле:
_ 1 n
n i=1 i Все указанные статистические параметры вычисляются измерительным прибором
«Биотокс-10» автоматически по команде оператора.
(рекомендуемое)
Наименование учреждения, выдавшего протокол ИСПЫТАТЕЛЬНЫЙ ЦЕНТР
Аттестат аккредитации
Регистрация в реестре
ПРОТОКОЛ № определения токсичности пробы с помощью биотеста «Эколюм» и прибора «Биотокс-10»
Наименование учреждения/отдела
_____________________________ токсикологической оценки ____________________
вид испытаний N образца
от " " 2004 г.
Наименование образца: Наименование предприятия-изготовителя: Наименование заявителя (отдела): Упаковка, маркировка, описание образца: НД на методы испытаний:
| Показатели токсичности | Критерии оценки | Вывод о степени токсичности пробы |
|---|---|---|
| Индекс токсичности: | Меньше 20 - допустимая степень токсичности; от 20 до 50 - образец токсичен; равно или больше 50 - образец сильно токсичен | |
| Средняя величина ЕС20 |
Испытания проведены: ___________________________________ (Ф.И.О. лиц, проводивших испытание) (дата)
Заключение, рекомендации: Вывод о токсичности образца
Результаты испытаний распространяются только на представленные образцы. Частичная перепечатка протокола запрещена.
Ответственный специалист ______________________________________________
фототоксичности ПК продукции
определения токсичности пробы с помощью биотеста «Эколюм»
| Наименование организации |
|---|
| Наименование пробы |
| Дата, время приготовления пробы |
| Дата измерения проб |
| Число повторностей измерения проб |
| Результаты биотестирования Усредненный индекс токсичности |
| Погрешность измерения |
| Оценка токсичности пробы |
| Оператор, Ф.И.О. |