МУК 4.2.1775-03. 4.2. Методы контроля. Микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Trichoderma viride 44-11-62/3 — продуцента комплекса целлюлолитических ферментов в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания

(утв. Минздравом России 24.10.2003)

4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМА TRICHODERMA VIRIDE 44-11-62/3 — ПРОДУЦЕНТА КОМПЛЕКСА ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

1 декабря 2003 года

1. Разработаны Российским государственным медицинским университетом (к.б.н. Н.И. Шеиной).

2. Утверждены Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации — Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 24 октября 2003 г.

3. Введены в действие с 1 декабря 2003 г.

4. Введены впервые.

1. Общие положения и область применения

Настоящие Методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма — Trichoderma viride 44-11-62/3 — продуцента комплекса целлюлолитических ферментов (целлюлаза, ксиланаза) в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 куб. м воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» и ГОСТ Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».

2. Характеристика штамма-продуцента Trichoderma viride 44-11-62/3

На агаризованной среде сусло-агар (содержание солодового сусла 5 — 6° по Баллингу) на 5 день развития микроорганизм образует характерные колонии до 5,0 — 5,5 см в диаметре с гладкой подошвой, слегка приподнятые над поверхностью среды, не врастающие в агар, с волнистым краем, пушистым воздушным мицелием, который покрыт спорами лимонно-желтого цвета. На 3 день развития в среду выделяется ярко-желтый пигмент лимонного оттенка. Гифы мицелия бесцветные, септированные, многократно ветвистые.

Систематическое положение микроорганизма

    Класс                           Fungi imperfecti
    Порядок                         Hyphomycetales
    Род                             Trichoderma
    Вид                             viride
    Штамм                           44-11-62/3

Штамм Trichoderma viride 44-11-62/3 получен во ВНИИбиотехнология в лаборатории Биосинтеза ферментов методом индуцированной селекции с применением этиленимина и нитрозометилмочевины из исходной культуры Trichoderma viride 44 — продуцента целлюлазы и депонирован в ЦМПМ ВНИИгенетика.

Штамм-продуцент синтезирует высокоактивный комплекс целлюлолитических ферментов для производства ферментного препарата целловиридин Г3х. Максимальная активность целлюлазы составляет 35 ед./мл, ксиланазы — 42 ед./мл.

Штамм-продуцент растет на жидких и агаризованных средах. Культивирование гриба происходит 5 суток при температуре 36 — 38 °С, затем 5 суток при комнатной температуре. Для размножения и хранения используется сусло-агар 5 — 6 °Б, рН среды — 5,0 — 6,0.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест — 200 кл./куб. м, пометка А.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток штамма-продуцента в атмосферном воздухе в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Прямой метод измерения концентрации штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток (спор, фрагментов мицелия) на поверхность плотной питательной среды сусло-агар и подсчета выросших колоний по культурально-морфологическим признакам на день развития.

Косвенный метод измерения концентрации штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток на поверхность плотной питательной селективной среды и подсчета выросших колоний по зонам просветления, образующихся вокруг каждой колонии штамма, как результат продукции целлюлазы на среде с окрашенной целлюлозой.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1 Средства измерений,

вспомогательные устройства, материалы

Прибор для бактериологического анализа ТУ 64-12791-77 воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова)

Термостаты электрические суховоздушные или водяные

Автоклав электрический ГОСТ 9586-75

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

Холодильник бытовой

Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200

Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211

Лупа с увеличением х10 ГОСТ 25706-83

Чашки Петри бактериологические плоскодонные, стеклянные, диаметром 100 мм

Пробирки биологические ГОСТ 10515-75 вместимостью 20 и 35 мл

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл                      ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл                      ГОСТ 1770-74
Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл          ГОСТ 1770-74
Секундомер                                          ГОСТ 9586-75
Барометр                                            ГОСТ 24696-79

Марля медицинская ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81

5.2 Реактивы, растворы

Агаризованное пивное сусло 5 — 6 °Б для штамма-продуцента (агар — 1,8%, рН 5,0 — 6,0, режим стерилизации 1,1 — 1,2 ати в течение 30 мин.)

Молочная кислота, ГОСТ 490-79 синоним — альфа-оксипропионовая кислота (из расчета 0,4 мл на 100 мл среды сусло-агар для подавления посторонней бактериальной флоры)

Бенгальский розовый

Диметилсульфоксид

Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67

Селективная среда для штамма-продуцента,

состав среды: КН РО  - 1 г; МgSО  7Н О - 0,5 г;
                2  4            4   2
(NН ) SО  - 0,7 г; целлюлоза порошковая
   4 2  4

в пересчете на сухое вещество — 0,9 г; лактоза

• 0,3 г; дрожжевой экстракт — 0,5 г; агар — 18 г; вода дистиллированная — до 1000 мл

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в атмосферном воздухе соблюдают следующие требования:

6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5 °С), атмосферном давлении 630 — 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

9. Проведение измерения

9.1 Условия отбора проб воздуха

Для определения концентрации клеток штамма-продуцента воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин. на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (5 — 20 мин.) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента (прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента, косвенный — до 30 — 50 колоний на чашке).

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2 Выполнение анализа

При выполнении анализа воздуха прямым методом среду сусло-агар расплавляют, остужают до 50 — 60 °С, добавляют молочной кислоты из расчета 0,4 мл на 100 мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

При выполнении анализа воздуха косвенным методом селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют 50 мг/л бенгальского розового, растворенного в 1 мл диметилсульфоксида, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Бенгальский розовый предназначен для специфического окрашивания целлюлозы и для ограничения разрастания колоний на чашках.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 42 °С (для интенсификации развития гриба). Через 3 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам и характерной пигментации среды (прямой метод) или зон просветления вокруг выросших колоний продуцента (косвенный метод) как результат продукции целлюлолитических ферментов на среде с окрашенной целлюлозой.

10. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле:

                     N х 1000

Х = --------, кл./куб. м, V

где:

Х — концентрация клеток продуцента в воздухе;

N — количество колоний продуцента, выросших на чашке;

V — объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

11. Оформление результатов измерений

количественного микробиологического анализа штамма-продуцента Trichoderma viride 44-11-62/3 в атмосферном воздухе населенных мест

1. <a id="p100089"></a>Дата проведения анализа _______________________________

2. <a id="p100090"></a>Место отбора пробы ____________________________________

3. <a id="p100091"></a>Название лаборатории __________________________________

4. <a id="p100092"></a>Юридический адрес организации _________________________

Результаты микробиологического анализа

Научный руководитель

Список литературы

1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД 52.04.186-96. М., 1991. 693 с.

2. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ «Методики выполнения измерений».

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977. 7 с.