МУК 4.2.1773-03. 4.2. Методы контроля. Микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток Candida tropicalis Y-456 — продуцента ксилита в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания

(утв. Минздравом России 24.10.2003)

4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК CANDIDA TROPICALIS Y-456 — ПРОДУЦЕНТА КСИЛИТА В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

1. Разработаны Российским государственным медицинским университетом (к.б.н. Н.И. Шеиной).

2. Утверждены Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации — Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 24 октября 2003 г.

3. Введены в действие с 1 декабря 2003 г.

4. Введены впервые.

1. Общие положения и область применения

Настоящие Методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Candida tropicalis Y-456 — продуцента ксилита в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 10 до 3000 клеток в 1 куб. м воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» и ГОСТ Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».

2. Биологическая характеристика Candida tropicalis Y-456 и его гигиенический норматив

На сусло-агаре на 2 — 3 сутки штамм образует круглые кремоватые колонии с ровным краем, средний диаметр изолированных колоний составляет 0,3 см, а максимальный — 0,8 см. В центре колоний образуется небольшое возвышение — «бугорок», на среде появляется маленькое желто-оранжевое окрашивание. Консистенция колоний мягкая, неплотная, вязкая. Поверхность гладкая, слегка матовая.

Морфологически штамм представлен полиморфными клетками: округлые, овальные, большей частью одиночные 2 — 4 мкм, иногда цепочки или конгломераты из вытянутых клеток 10 — 12 мкм. Наблюдается обилие бластоспор.

При выращивании на кукурузном агаре по Дальмау в чашках Петри обильно образуются псевдогифы с многократными разветвлениями и бластоконидиями, расположенными одиночно или цепочками вдоль гиф (8).

Систематическое положение микроорганизма

    Класс                           Fungi imperfecti
    Порядок                         Blaslomycelales
    Род                             Candida
    Вид                             tropicalis
    Штамм                           Y-456

Штамм получен из ЦМПМ ВНИИгенетика как продуцент этанола и селектирован по признаку формирования крупных колоний на средах с ксилозой. Штамм является продуцентом ксилита. Продуктивность на средах с 5% содержанием ксилозы: максимальная — 80% ксилита, средняя — 78,8 — 76,2% (39,5 г/л) ксилита.

Штамм-продуцент растет на жидких и агаризованных средах. Оптимальная температура роста 35 — 37 °С, рН среды — 5,0 — 6,0. Для размножения используется сусло-агар 5 — 6 °Б, среда ДАП — глюкоза (ксилоза) — 20 г, дрожжевой экстракт — 2,0 г, пептон — 2 г, агар-агар — 20 г, вода — 1 л, рН среды — 5,0 — 6,0.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест — 30 кл./куб. м, пометка А.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток дрожжевого гриба в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 10 до 3000 клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод основан на аспирации из воздуха клеток дрожжеподобного гриба на поверхность среды сусло-агар и подсчете выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам на 2 сутки развития. В качестве дополнительного контроля предлагается отбор пробы на чашку Петри с селективной средой для дифференцирования С. tropicalis от других дрожжеподобных грибов, обладающих способностью к образованию ростковых трубок (9, 10).

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1 Средства измерений,

вспомогательные устройства, материалы

Прибор для бактериологического анализа воздуха, ТУ 64-12791-77 модель 818 (щелевой прибор Кротова)

Термостаты электрические суховоздушные или водяные

Автоклав электрический ГОСТ 9586-75

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

Холодильник бытовой

Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200

Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211

Лупа с увеличением х10 ГОСТ 25706-83

Чашки Петри бактериологические плоскодонные стеклянные диаметром 100 мм

Пробирки биологические вместимостью 20 и 35 мл      ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл                      ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5, и 10 мл                     ГОСТ 1770-74
Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл          ГОСТ 1770-74
Секундомер                                          ГОСТ 9586-75
Барометр                                            ГОСТ 24696-79

Марля медицинская ГОСТ 9412-77

5.2 Реактивы, растворы

Среда сусло-агар: солодовое сусло (значение Баллинга от 5 до 6 °) — 98%, агар-агар — 2%, рН среды 5,0 — 6,0, режим стерилизации: Р — 0,8 кгс/кв. см, 40 мин.

Спирт этиловый ректификат, ГОСТ 5962-67.

Сыворотка или плазма крови человека (вместо них можно использовать среду 199).

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования:

6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5 °С), атмосферном давлении 30 — 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

9. Проведение измерения

9.1 Условия отбора проб воздуха

Для определения концентрации клеток продуцента воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин. на поверхность среды сусло-агар. Время аспирации воздуха (5 — 20 мин.) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2 Выполнение анализа

Метод предполагает учет количества типичных колоний, выросших на 2 сутки после посева проб воздуха по культурально-морфологическим признакам. Метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Агаризованную среду сусло-агар расплавляют, остужают до 50 — 60 °С, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при температуре 37 °С. На 2-е сутки производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

Для постановки дополнительного контроля в среду добавляют сыворотку или плазму крови человека (можно также заменить средой 199) из расчета 0,5 мл сыворотки на 5 мл среды. После отбора проб инкубируют при 37 °С в течение 3 часов. При микроскопировании некоторые дрожжеподобные грибы (С. albicans) в отличие от С. tropicalis на селективной среде образуют ростковые трубки диаметром 3 — 4 мкм и длиной до 20 мкм (они сходны с мицелием, но не дают сужения в месте прикрепления к дрожжевой клетке).

10. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле:

                      N х 1000

Х = --------, кл./куб. м,

                         V

где:

X — концентрация клеток продуцента в воздухе;

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме:

Протокол № количественного микробиологического анализа

в атмосферном воздухе населенных мест

1. <a id="p100088"></a>Дата проведения анализа _______________________________

2. <a id="p100089"></a>Место отбора пробы ____________________________________

3. <a id="p100090"></a>Название лаборатории __________________________________

4. <a id="p100091"></a>Юридический адрес организации _________________________

Результаты микробиологического анализа

Ответственный исполнитель

Научный руководитель

Список литературы

1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД 52.04.186-96. М., 1991. 693 с.

2. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ «Методики выполнения измерений».

3. Положение об организации работы по технике безопасности микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с.

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977. 7 с.