МУК 4.2.1072-01. 4.2. Методы контроля. Микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Penicillium vermiculatum PK-1 — продуцент Вермикулена в воздухе рабочей зоны. Методические указания

(утв. Минздравом России 20.09.2001)

20 сентября 2001 года

4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМА PENICILLIUM VERMICULATUM PK-1 — ПРОДУЦЕНТ ВЕРМИКУЛЕНА В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

с момента утверждения

1. Разработаны к.б.н. Бару Р.В., к.б.н. Лапчинской А.В. (Государственный научный центр по антибиотикам).

2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации — Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации 20 сентября 2001 г.

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Penicillium vermiculatum PK-1 — продуцент Вермикулена в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 куб. м воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и ГОСТ Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

2. Характеристика штамма-продуцента Вермикулена

Микроорганизм Penicillium vermiculatum PK-1 является продуцентом Вермикулена. Биологический препарат Вермикулен представляет собой живую культуру (споры и мицелиальная масса микроорганизма Penicillium vermiculatum PK-1).

Penicillium vermiculatum PK-1 — аэроб, растет на жидких и агаризованных средах, оптимальная температура роста 25 — 30 °С, оптимальная рН от 5 до 8. Наиболее интенсивный рост гриба отмечается на картофельно-сахарозном агаре и агаризованной среде Чапека. На среде Чапека — Докса при культивировании при температуре 25 °С на 2 — 3 сутки образуются небольшие (2 — 5 мм в диаметре) округлые бархатистые колонии желто-бежеватого цвета, с обратной стороной от светло до темно-оливкового. Репродуктивными органами микроорганизма являются споры (конидии и обрывки мицелия).

   р.з.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента Вермикулена в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 30000 клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод основан на аспирации из воздуха клеток продуцента Вермикулена на поверхность плотной питательной среды и подсчете выросших колоний по типичным морфологическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Прибор для бактериологического анализа воздуха, ТУ 64-12791-77 модель 818 (щелевой прибор Кротова)

Термостаты электрические суховоздушные или водяные

Автоклав электрический ГОСТ 9586-75

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

Холодильник бытовой

Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200

Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211

Лупа с увеличением х10 ГОСТ 25706-83

Чашки Петри бактериологические плоскодонные стеклянные диаметром 100 мм

Пробирки биологические вместимостью 20 и 35 мл     ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл                     ГОСТ 10515-75

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 1770-74

Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74

Секундомер                                         ГОСТ 9586-75
Барометр                                           ГОСТ 24696-79

Марля медицинская ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81.

5.2. Реактивы, растворы

Антибиотики группы аминогликозидов (канамицин, неомицин и др.)

Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67

Селективная среда Чапека — Докса для штамма -

продуцента: NaNО  - 3,0 г; MgSО К НРО  - 1,0 г;
                3              4 2   4
KCL - 0,5 г; MgSО  х 7Н О - 0,5 г; FeSО  х 7Н О -
                 4     2               4     2

0,01 г; сахароза — 30 г; агар — 20 г; вода дистиллированная — до 1000 мл; рН — 6,0; стерилизация при 121 °С 30 мин.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток продуцента Вермикулена в воздухе рабочей зоны соблюдают:

• правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88;
• правила электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцию по эксплуатации прибора;
• требования, изложенные в руководстве «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980);
• положения «Инструкций по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °С, атмосферном давлении 630 — 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

9. Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения продуцента Вермикулена воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин. на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1 — 10 мин.) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 2 — 3 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор антибиотика (канамицин, неомицин) из расчета 25 — 50 мкг на 1 мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10 — 15 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 25 °С. Через 48 — 72 ч производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

10. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле:

                     N х 1000

X = --------, кл./куб. м, V

где:

X — концентрация клеток продуцента в воздухе;

N — количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 — коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;

V — объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

В случае невозможности использования аппарата Кротова, рекомендуется применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 мин. (при определении концентрации микроорганизма в атмосферном воздухе). При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента:

эмпирически установлено, что за 5 мин. на площадь 100 куб. см оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, за 1 мин. — в 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54 куб. см.

Составляем пропорцию:

на 100 куб. см за 1 мин. оседает 2 л воздуха

на 78,54 куб. см — Х л

Х = 1,57 л/мин.

Следовательно, на стеклянную чашку Петри за 1 мин. оседает 1,57 л воздуха.

Надо определить количество клеток в 1 куб. м воздуха.

На 1 чашку (диаметр 100 мм) за 1 мин. оседает количество микробов, содержащихся в 1,57 л воздуха, за Т мин. — 1,57 х Т л.

В этом количестве содержится № колониеобразующих единиц (микробных клеток — спор, обрывков мицелия), а в 1 куб. м воздуха содержится:

                   N х 1000   N х 636,9

-------- = ---------. 1,57 х Т Т

Пример: за 30 мин. седиментации выросло 12 колоний микроорганизма. В 1 куб. м воздуха содержится:

                 12 х 636,9

                     30

11. Оформление результатов измерений

количественного микробиологического анализа штамма Penicillium vermiculatum PK-1 — продуцента Вермикулена в воздухе рабочей зоны

Дата проведения анализа _________________________________

Место отбора пробы ______________________________________

Юридический адрес организации ___________________________

Результаты микробиологического анализа

Шифр или № пробы	Определяемый микроорганизм	Концентрация, кл./куб. м

Научный руководитель

Список литературы

1. ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования».

2. ГОСТ Р 8.563-96 «ГСИ. Методики выполнения измерений».

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности (М., 1980, 27 с.).

---