МУК 4.2.1070-01. 4.2. Методы контроля. Микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Trichoderma longibrachiatum TW-1 — продуцента бета-глюканазы в воздухе рабочей зоны. Методические указания

(утв. Минздравом России 20.09.2001)

20 сентября 2001 года

4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМА TRICHODERMA LONGIBRACHIATUM TW-1 — ПРОДУЦЕНТА БЕТА-ГЛЮКАНАЗЫ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

с момента утверждения

1. Разработаны к.м.н. В.И. Бобровым (ВНЦ по безопасности биологически активных веществ).

2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации — Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 20 сентября 2001 г.

3. Введены впервые.

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма — Trichoderma longibrachiatum TW-1 — продуцента бета-глюканазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 6000 клеток в 1 куб. м воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и ГОСТ Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

2. Характеристика штамма-продуцента бета-глюканазы

Продуцент бета-глюканазы Trichoderma longibrachiatum TW-1 относится к классу несовершенных грибов. Рост характерных колоний определяется на 5 — 6 сутки. На агаризованной среде СМ микроорганизм образует характерные колонии до 15 мм в диаметре с гладкой подошвой, не врастающие в агар, с волнистым краем, пушистым воздушным мицелием, который покрыт спорами белого и желтого цвета. Гифы мицелия бесцветные, септированные, многократно ветвистые. Оптимальная температура роста 28 — 30 °С.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны — 5000 кл./куб. м, 3 класс опасности, пометка А.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента бета-глюканазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 6000 клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод измерения концентрации штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток (спор, фрагментов мицелия) продуцента бета-глюканазы на поверхность плотной питательной среды СМ и подсчете выросших колоний по зонам просветления, образующихся вокруг каждой колонии штамма как результат продукции бета-глюканазы на среде с окрашенной целлюлозой.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791 77

Термостаты электрические суховоздушные или водяные

Автоклав электрический ГОСТ 9586-75

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

Холодильник бытовой

Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200

Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211

Лупа с увеличением х 10 ГОСТ 25706-83

Чашки Петри бактериологические плоскодонные стеклянные диаметром 100 мм

Пробирки биологические вместимостью 20 и 35 мл      ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл                      ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл                      ГОСТ 1770-74
Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл          ГОСТ 1770-74
Секундомер                                          ГОСТ 9586-75
Барометр                                            ГОСТ 24696-79

Марля медицинская ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81.

5.2. Реактивы, растворы

Бенгальский розовый

Диметилсульфоксид

Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67

Селективная среда для штамма-продуцента бета-глюканазы

Состав среды: KH PO  - 1 г; MgSO  х 7Н О -
                2  4            4     2
0,5 г; (NH ) SO  - 5 г; целлюлоза порошковая в
          4 2  4

пересчете на сухое вещество — 5 г; глюкоза — 5 г; дрожжевой экстракт — 0,5 г; агар — 20 г; вода дистиллированная — до 1000 мл.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток продуцента бета-глюканазы в воздухе рабочей зоны соблюдают:

• правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88;
• правила электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцию по эксплуатации прибора;
• требования, изложенные в руководстве «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980);
• положения «Инструкций по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °С, атмосферном давлении 630 — 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

9. Проведение измерений

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения продуцента бета-глюканазы воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин. на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1 — 10 мин.) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента, а прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки.

На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо.

После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

Метод предполагает учет количества колоний, выросших на 2 — 3 сутки после посева проб воздуха, по зонам просветления, которые являются результатом образования целлюлаз на срезах с окрашенной целлюлозой в присутствии повышенного количества глюкозы.

Существенным признаком промышленных мутантов рода Trichoderma является пониженная катаболическая репрессия по сравнению с дикими мутантами Trichoderma. В то время как у диких штаммов глюкоза в концентрациях выше 0,02 г/л практически полностью подавляет образование целлюлаз в глубинной культуре, у промышленных мутантов подавление образования целлюлаз начинается при концентрациях глюкозы выше 1 г/л.

Селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют 50 мг/л бенгальского розового, растворенного в 1 мл диметил-сульфоксида, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Бенгальский розовый предназначен для специфического окрашивания целлюлозы и для ограничения разрастания колоний на чашках. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при 28 — 30 °С на 2 дня и затем при температуре 44 °С на 18 ч для образования вокруг колоний зон просветления.

Количественный учет микробных клеток штамма-продуцента бета-глюканазы проводится методом подсчета зон просветления, образующихся вокруг колоний микроорганизма как результат продукции глюканазы на среде СМ с окрашенной целлюлозой.

10. Вычисление результатов измерений

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле:

                     N х 1000

Х = --------, кл./куб. м, V

где:

Х — концентрация клеток продуцента в воздухе;

N — количество колоний продуцента, выросших на чашке;

V — объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

11. Оформление результатов измерений

количественного микробиологического анализа штамма-продуцента Trichoderma longibrachiatum TW-1 в воздухе рабочей зоны

Дата проведения анализа ______________________________________

Место отбора пробы ___________________________________________

Юридический адрес организации ________________________________

Результаты микробиологического анализа

Шифр или № пробы	Определяемый микроорганизм	Концентрация, кл./куб. м

Научный руководитель

Список литературы

1. ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования».

2. ГОСТ Р 8.563-96 «ГСИ. Методики выполнения измерений».

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности (М., 1980, 27 с.).

---