МУК 4.2.1069-01. 4.2. Методы контроля. Микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток плесневого гриба Penicillium funiculosum F-149 — продуцента декстраназы в воздухе рабочей зоны. Методические указания

(утв. Минздравом России 20.09.2001)

20 сентября 2001 года

4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК ПЛЕСНЕВОГО ГРИБА PENICILLIUM FUNICULOSUM F-149 — ПРОДУЦЕНТА ДЕКСТРАНАЗЫ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

с момента утверждения

1. Разработаны д.м.н. Ивановым Н.Г., к.б.н. Шеиной Н.И. (Российский государственный медицинский университет).

2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации — Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 20 сентября 2001 г.

3. Введены впервые.

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Penicillium funiculosum F-149 — продуцента декстраназы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 куб. м воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и ГОСТ Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

2. Биологическая характеристика плесневого гриба Penicillium funiculosum F-149 и его гигиенический норматив

Систематическое положение микроорганизма

    Класс           Fungi imperfecti
    Порядок         Hyphomycetales
    Семейство       Mucedinaceae
    Род             Penicillium
    Секция          Biverticillata
    Вид             funiculosum
    Штамм           F-149

Округлые колонии имеют 4 — 5 мм в диаметре, в зависимости от плотности посева могут достигать 11 мм в диаметре. Поверхность колоний слабошероховатая, пушистая, консистенция мягкая. Воздушный мицелий имеет белоснежно-белую окраску. На 3 — 4 день развития желтовато-кремовый субстрат меняет свою окраску, становясь ярко-оранжевым. Продолжительность развития гриба составляет 26 — 30 дней. Репродуктивными органами гриба являются конидиеносцы с конидиями (споры), может также размножаться вегетативно (фрагментами мицелия).

Штамм Penicillium funiculosum F-149 получен из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ГНИИгенетики. Штамм является продуцентом декстраназы. Активность по методу Нельсона составляет 10 — 12 ед./мл культуральной жидкости. Изучаемый штамм выделен из почвы, аэроб, растет на жидких и агаризованных средах. Оптимальная температура роста 28 — 30 °С, оптимальный рН 6 — 8. Наиболее интенсивный рост наблюдается на агаризованном пивном сусле 7 °Б, для выращивания могут также использоваться картофельно-сахарозный агар, агаризованная среда Чапека, среда Чапека — Докса.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны — 2000 кл./куб. м, пометка А.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток плесневого гриба в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод основан на аспирации из воздуха клеток плесневого гриба на поверхность плотной питательной среды и подсчете выросших колоний по типичным морфологическим признакам и ярко-оранжевому окрашиванию субстрата на 3 — 4 сутки. Вопрос о корреляции между пигментной и ферментативной активностью плесневого гриба требует дополнительных исследований.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791-77

Термостаты электрические суховоздушные или водяные

Автоклав электрический ГОСТ 9586-75

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

Холодильник бытовой

Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200

Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211

Лупа с увеличением х10 ГОСТ 25706-83

Чашки Петри бактериологические плоскодонные стеклянные диаметром 100 мм

Пробирки биологические вместимостью 20 и 35 мл      ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл                      ГОСТ 10515-75

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 1770-74

Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74

Секундомер                                          ГОСТ 9586-75
Барометр                                            ГОСТ 24696-79

Марля медицинская ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81.

5.2. Реактивы, растворы

Антибиотики группы аминогликозидов: канамицин, неомицин и др.

Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67

Агаризованное пивное сусло 7 °Б для штамма- продуцента (агар — 1,8%, рН 6,8, режим стерилизации 1,1 — 1,2 атм. в течение 30 мин.).

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны соблюдают:

• правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88;
• правила электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцию по эксплуатации прибора;
• требования, изложенные в руководстве «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980);
• положения «Инструкций по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °С, атмосферном давлении 630 — 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

9. Проведение измерений

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения концентрации клеток плесневого гриба воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин. на поверхность плотной питательной среды — пивное агаризованное сусло 7 °Б. Время аспирации воздуха (1 — 10 мин.) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 3 — 4 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Агаризованное пивное сусло 7 °Б расплавляют, остужают до 50 — 60 °С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор антибиотика (канамицин, неомицин и др.) из расчета 20 — 30 мг на 1 л среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при температуре 28 — 30 °С. Через 72 ч производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

10. Вычисление результатов измерений

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле:

                       N х 1000

Х = --------, кл./куб. м, V

где:

Х — концентрация клеток продуцента в воздухе;

N — количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 — коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;

V — объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

В случае невозможности использования аппарата Кротова рекомендуем применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 30 мин. При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента:

эмпирически установлено, что за 5 мин. на площадь 100 кв. см оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, следовательно, за 1 мин. — количество бактерий из 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54 кв. см. Составляя пропорцию, определяем, что за 1 мин. на стеклянную чашку Петри оседают клетки, содержащиеся в 1,57 л воздуха. Количество клеток в 1 куб. м воздуха определяем по вышеприведенной формуле, где V = 1,57 л/мин. х t (время аспирации, мин.).

Предлагаемый метод является ориентировочным и может быть использован как вспомогательный метод.

11. Оформление результатов измерений

количественного микробиологического анализа штамма-продуцента Penicillium funiculosum F-149 в воздухе рабочей зоны

Дата проведения анализа ______________________________

Место отбора пробы ___________________________________

Юридический адрес организации ________________________

Результаты микробиологического анализа

Шифр или № пробы	Определяемый микроорганизм	Концентрация, кл./куб. м

Научный руководитель

Список литературы

1. ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования».

2. ГОСТ Р 8.563-96 «ГСИ. Методики выполнения измерений».

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности (М., 1980, 27 с.).

---