МУК 4.2.1068-01. 4.2. Методы контроля. Микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента тилозина Streptomyces fradiae БС-1 в воздухе рабочей зоны. Методические указания

(утв. Минздравом России 20.09.2001)

20 сентября 2001 года

4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА ТИЛОЗИНА STREPTOMYCES FRADIAE БС-1 В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

1. Разработаны д.м.н. Ивановым Н.Г., к.б.н. Шенной Н.И. (Российский государственный медицинский университет).

2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации — Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 20 сентября 2001 г.

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма-продуцента тилозина Streptomyces fradiae БС-1 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 50000 клеток в 1 куб. м воздуха.

Методические указания разработаны с целью обеспечения микробиологического контроля штамма Streptomyces fradiae БС-1 в воздухе производственных помещений биотехнологических производств и оценки соответствия уровня его содержания гигиеническим нормативам на основе учета требований ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и ГОСТ Р 8.563-96 «ГСИ. Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для центров госсанэпиднадзора, санитарных лабораторий биотехнологических предприятий, микробиологических лабораторий научно-исследовательских институтов, работающих в области промышленной гигиены.

2. Биологическая характеристика штамма-продуцента Streptomyces fradiae БС-1 и его гигиенический норматив

Систематическое положение штамма-продуцента

    Порядок      Actinomycetales
    Класс        Actinomycetes
    Семейство    Streptomycetaceae
    Род          Streptomyces
    Вид          fradiae
    Штамм        БС-1

Культурально-морфологические особенности штамма

Штамм Streptomyces fradiae БС-1 является облигатным аэробом, растет на различных питательных средах: СР-6, СР-15, Гаузе-1, Ваксмана путем инкубирования в термостате при температуре 28 °С. Продолжительность развития составляет 10 — 15 суток.

Четкие культурально-морфологические свойства штамма проявляются на агаризованной среде СР-15 на 3 день развития. На этой среде штамм образует 6 морфологических типов колоний, из которых наиболее характерный тип составляет более 70%. Изучаемый штамм представлен округлыми колониями до 9 мм в диаметре (в зависимости от плотности посева). Белый воздушный мицелий образуется в центре колонии и по периферии в виде одной, реже двух концентрических окружностей, край колоний не опушен. Профиль изогнутый, поверхность шероховатая, неопушенные части колоний гладкие, блестящие, кремовые. Структура мелкозернистая, по краю неопушенной части однородная. Консистенция плотная, пигмент с обратной стороны колоний желтовато-коричневый.

Предельно допустимая концентрация Streptomyces fradiae БС-1 в воздухе рабочей зоны — 2000 кл/куб. м, пометка А, 3 класс опасности.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток продуцента тилозина в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 50000 клеток в 1 куб. м при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод измерения концентрации штамма-продуцента Streptomyces fradiae БС-1 основан на аспирации аппаратом Кротова микробных клеток (спор, обрывков мицелия) на поверхность плотной питательной среды СР-15 и подсчете выросших колоний, которые выявляются при задержке роста тест-культуры (Bacillus subtilis), происходящего вследствие диффузии в агар антибиотика, выделяемого штаммом-продуцентом Streptomyces fradiae БС-1.

При данном методе на чашке Петри после забора пробы может быть учтено до 50 колоний, т.к. большее количество колоний на чашке могут образовывать сливающиеся зоны лизиса, что приводит к занижению результатов.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства,

реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791-77

Термостаты электрические суховоздушные или водяные

Автоклав электрический ГОСТ 9586-75

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

Холодильник бытовой

Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200

Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211

Водяная баня или водяной термостат

Газовая горелка или спиртовка лабораторная

Чашки Петри

Петли бактериологические

Пробирки биологические вместимостью 20 и 35 мл     ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл                     ГОСТ 10515-75

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 1770-74

Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74

Секундомер                                         ГОСТ 9586-75
Барометр                                           ГОСТ 24696-79

Марля медицинская ГОСТ 9412-77

5.2. Реактивы, растворы

Среда СР-15, агаризованная питательная среда для продуцента тилозина (состав в %: меласса — 0,5, крахмал — 0,5, соевая мука — 0,5,

кукурузный экстракт - 0,5, (NH ) SO  - 0,1,
                              4 2  4
NaCl - 0,1, MgSO  х 7H O - 0,05, СаСО  - 0,2,
                4     2              3

агар — 1,5; рН среды до стерилизации 7,0 — 7,2; режим стерилизации 1,1 — 1,2 атм., 40 — 50 мин.)

Агаризованная среда Хоттингера, рН 6,8 — 7,0

Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67

Хлороформ

Тетрациклина гидрохлорид

Амфотерицин В для внутривенного введения

Тест-культура Вас. subtilis вариант Л — музейный 2 штамм, споры хранят в виде водной суспензии при

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток продуцента Биовита и хлортетрациклина в воздухе рабочей зоны соблюдают:

• правила техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.005-88;
• правила электробезопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации приборов;
• требования, изложенные в руководстве «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980);
• положения «Инструкций по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

7. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях в соответствии с ГОСТ 15150-69 при температуре воздуха (20 +/- 5) °С, атмосферном давлении 630 — 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

9. Проведение измерений

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения концентрации Streptomyces fradiae БС-1 воздух производственных помещений аспирируют со скоростью 10 л/мин. на поверхность плотной питательной среды СР-15 в чашку Петри, помещенную в аппарат Кротова.

Аппарат Кротова перед каждым отбором воздуха тщательно протирают спиртом. На подвижный диск устанавливают чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Крышку прибора закрывают. После отбора пробы воздуха и остановки диска открывают крышку прибора, снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. В период отбора проб воздуха крышку чашки Петри хранят в стерильном пакете из бумаги, полиэтилена или других стерильных емкостях.

Время аспирации воздуха (1 — 10 мин.) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны.

Отбор проб сопровождается составлением акта отбора с указанием места, времени и условий отбора.

9.2. Выполнение анализа

Агаризованную среду СР-15 расплавляют и остужают до 50 — 60 °С. Затем добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде амфотерицин для инъекций из расчета 20 мкг на 1 л среды для подавления посторонней воздушной грибковой флоры, тщательно перемешивают и разливают в стерильные чашки Петри по 10 мл. Чашки с застывшей средой помещают в термостат при 37 °С на сутки, после чего проросшие чашки бракуют.

После отбора проб воздуха на чашки Петри в аппарате Кротова их помещают в термостат при температуре 28 — 30 °С на 48 ч.

После инкубации чашки помещают в вытяжной шкаф. На внутреннюю поверхность наливают 1,5 мл хлороформа, чашку с посевом вверх донышком вставляют в крышку так, чтобы выросшие колонии бактерий находились в парах хлороформа не менее 20 — 30 мин. Затем каждую чашку вынимают из крышки, выливают оставшийся хлороформ, снова закрывают крышками и переносят в бокс. Чашки оставляют в боксе на 2 ч при комнатной температуре для преддиффузии.

Затем чашки Петри заливают 5 мл агаризованной среды Хоттингера 7 с тест-культурой Вас. subtilis вариант Л из расчета 3 х 10 2

изд. XI, 1989, с. 206).

Чашки Петри с застывшей средой Хоттингера донышком вверх помещают в термостат при 37 °С на сутки. По окончании инкубации, т.е. через 3 суток после отбора пробы воздуха производят подсчет зон задержки роста тест-культуры, которые соответствуют числу проросших клеток штамма-продуцента Streptomyces fradiae БС-1. Учитывают зоны диаметром не менее 5 мм.

10. Вычисление результатов измерений

Расчет концентрации микробных клеток Streptomyces fradiae БС-1 в 1 куб. м воздуха производят по формуле:

                         П х 1000

Х = --------, Т х В

где:

Х — количество микробных клеток в воздухе (1 куб. м);

П — число зон задержки роста тест-культуры, что соответствует числу колоний, выросших на чашке Петри;

В — скорость подачи воздуха, л/мин.;

1000 — коэффициент перевода 1 л в 1 куб. м.

11. Оформление результатов измерений

Протокол N ____ количественного микробиологического анализа штамма-продуцента Streptomyces fradiae БС-1 в воздухе рабочей зоны

Дата проведения анализа ______________________________

Название лаборатории _________________________________

Юридический адрес организации ________________________

Результаты микробиологического анализа

Шифр или № пробы	Определяемый микроорганизм	Концентрация, кл./куб. м

Ответственный исполнитель

Научный руководитель

Список литературы

1. ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования».

2. ГОСТ Р 8.563-96 «ГСИ. Методики выполнения измерений».

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности (М., 1980, 27 с.).

---