МУК 4.2.1008-00. 4.2. Методы контроля. Микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма pseudomonas Fluorescens (denitrificans) В99-продуцента витамина В12 в воздухе рабочей зоны. Методические указания

(утв. Минздравом России 21.12.2000)

4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ.

МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМА PSEUDOMONAS FLUORESCENS (DENITRIFICANS) В 99 — ПРОДУЦЕНТА ВИТАМИНА В12 В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

1. Разработаны к.б.н. Бару Р.В., к.б.н. Лапчинской Л.В. (Государственный научный центр по антибиотикам).

2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 21 декабря 2000 г.

3. Введены впервые.

1. Общие положения и область применения

    Настоящие   методические   указания   устанавливают   методику
проведения     микробиологического     количественного     анализа

концентрации клеток штамма Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В 99 — продуцента витамина В в воздухе рабочей зоны в диапазоне 12 концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 куб. м воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТа 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и ГОСТа Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».

    2. <a id="p100014"></a>Характеристика штамма - продуцента витамина В
                                                    12

    Микроорганизм  Pseudomonas  fluorescens  (denitrificans)  В 99
является  продуцентом витамина  В  . Штамм растет на агаризованных

                             12

средах  на  основе  мелассы  при  температуре 28 °С. В течение 3-х
суток   образует   округлые   колонии  1  -  2  мм  белого  цвета.
Морфологически   представляет  собой  грамотрицательные  подвижные

палочки размером 0,45 — 0,85 х 0,6 мкм. Штамм устойчив к следующим антибиотикам: левомицетину, линкомицину, полимиксину М, ристомицину, цефалотину и эритромицину.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны — 2000 кл./куб. м.

3. Пределы измерений

    Методика  обеспечивает  выполнения измерений количества клеток
продуцента  витамина  В    в  воздухе  рабочей  зоны  в  диапазоне

                   12

концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

    Метод  основан  на  аспирации  из  воздуха  клеток  продуцента
витамина В   и на поверхность плотной питательной среды и подсчете

      12

выросших колоний по типичным морфологическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Прибор для бактериологического анализа воздуха, ТУ 64-12791-77 модель 818 (щелевой прибор Кротова)

Термостаты электрические суховоздушные или водяные

Автоклав электрический ГОСТ 9586-75

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

Холодильник бытовой

Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200

Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211

Лупа с увеличением х 10 ГОСТ 25706-83

Чашки Петри бактериологические плоскодонные стеклянные диаметром 100 мм

Пробирки биологические вместимостью 20 и 35 мл      ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл                      ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл                      ГОСТ 1770-74
Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл          ГОСТ 1770-74
Секундомер                                          ГОСТ 9586-75
Барометр                                            ГОСТ 24696-79

Марля медицинская ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81.

5.2. Реактивы, растворы

Антибиотики: левомицетин, линкомицин, полимиксин М, цефалотин, эритромицин.

Селективная среда для штамма-продуцента.

    Среда: меласса - 100 - 150 г; (NH ) HPO  - 1,3 г; MgSO 7H O  -
                                     4 2   4              4  2
1,0 г; (NH ) SO  - 0,5 г; MnSO H O - 0,1 г; ZnSO 7H O  -  0,1   г;
          4 2  4              4 2               4  2
агар Difco - 20 г; вода дистиллированная - до 1000 мл;  рН - 6,8 -

7,0; стерилизация — 121 °С, 30 минут.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток продуцента

требования.

6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. Руководство «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980), «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха 20 +/- 5 °С, атмосферном давлении 630 — 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

9. Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

                                      12

помощи  аппарата  Кротова  со  скоростью  10 л/мин. на поверхность
плотной  питательной  среды. Время аспирации воздуха (1 - 10 мин.)

зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 2 — 3 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор антибиотика (левомицетин, линкомицин, цефалотин и др.) из расчета 30 мкг на 1 мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при 28 °С. Через 48 — 72 часа производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

10. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле:

                       N 1000

Х = ------, кл./куб. м, V

где:

Х — концентрация клеток продуцента в воздухе;

N — количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 — коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;

V — объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

В случае невозможности использования аппарата Кротова рекомендуется применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 минут (при определении концентрации микроорганизма в атмосферном воздухе). При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента:

эмпирически установлено, что за 5 мин. на площадь 100 кв. см оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, за 1 мин. — 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм (радиус 8 см) равна 78,54 кв. см.

Составляем пропорцию:

на 100 кв. см за 1 мин. оседает 2 л воздуха

на 78,54 кв. см — Х л

Х = 1,57 л/мин.

Следовательно, на стеклянную чашку Петри за 1 мин. оседает 1,57 л воздуха.

Надо определить количество клеток в 1 куб. м воздуха.

На 1 чашку (диаметр 100 мм) за 1 мин. оседает количество микробов, содержащихся в 1,57 л воздуха, за Т мин. — 1,57 х Тл.

В этом количестве содержится № колониеобразующих единиц (микробных клеток — спор, обрывков мицелия), а в 1 куб. м воздуха содержится:

                   N х 1000   N х 636,9

-------- = ---------.

                       1,57 х Т       Т

    Пример:   за   30   мин.   седиментации   выросло  12  колоний

микроорганизма. В 1 куб. м воздуха содержится:

                 12 х 636,9

---------- = 253 клетки. 30

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Протокол № Количественного микробиологического анализа штамма — продуцента Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В 99 в воздухе рабочей зоны

Дата проведения анализа ______________________________________

Место отбора пробы ___________________________________________

Название лаборатории _________________________________________

Юридический адрес организации ________________________________

Результаты микробиологического анализа

Ответственный исполнитель<br>
Научный руководитель

Список литературы

1. ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования».

2. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ. «Методики выполнения измерений».

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности, М., 1980. 27 с.

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности, М., 1977. 7 с.