МУК 4.2.1004-00. 4.2. Методы контроля. Микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В99-продуцента витамина В12 в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания

(утв. Минздравом России 20.12.2000)

20 декабря 2000 года

4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМА PSEUDOMONAS FLUORESCENS (DENITRIFICANS) В 99 — ПРОДУЦЕНТА ВИТАМИНА В12 В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

с момента утверждения

1. Разработаны к.б.н. Бару Р.В., к.б.н. Лапчинской А.В. (Государственный научный центр по антибиотикам).

2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации 20 декабря 2000 г.

3. Введены впервые.

1. Общие положения и область применения

    Настоящие   Методические   указания   устанавливают   методику
проведения     микробиологического     количественного     анализа

концентрации клеток штамма Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В 99 — продуцента витамина В в атмосферном воздухе населенных 12 мест в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 куб. м воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТов 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» и ГОСТ Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».

2. Характеристика штамма-продуцента витамина В12

    Микроорганизм  Pseudomonas  fluorescens  (denitrificans)  В 99
является  продуцентом  витамина В  . Штамм растет на агаризованных

                             12

средах  на  основе  мелассы  при  температуре 28 °С. В течение 3-х
суток   образует   округлые   колонии  1  -  2  мм  белого  цвета.
Морфологически   представляет  собой  грамотрицательные  подвижные

палочки размером 0,45 — 0,85 х 0,6 мкм. Штамм устойчив к следующим антибиотикам: левомицетину, линкомицину, полимиксину М, ристомицину, цефалотину и эритромицину.

Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест — 200 кл./куб. м.

3. Пределы измерений

    Методика  обеспечивает  выполнение измерений количества клеток
продуцента  витамина  В    в атмосферном воздухе населенных мест в

                   12

диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

    Метод  основан  на  аспирации  из  воздуха  клеток  продуцента
витамина  В    на поверхность плотной питательной среды и подсчете

       12

выросших колоний по типичным морфологическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1 Средства измерений, вспомогательные

устройства, материалы

Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791-77

Термостаты электрические суховоздушные или водяные

Автоклав электрический ГОСТ 9586-75

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

Холодильник бытовой

Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200

Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211

Лупа с увеличением х 10 ГОСТ 25706-83

Чашки Петри бактериологические плоскодонные стеклянные диаметром 100 мм

Пробирки биологические вместимостью 20 и 35 мл      ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл                      ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл                      ГОСТ 1770-74
Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл          ГОСТ 1770-74
Секундомер                                          ГОСТ 9586-75
Барометр                                            ГОСТ 24696-79

Марля медицинская ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81

5.2 Реактивы, растворы

Антибиотики: левомицетин, линкомицин, полимиксин М, цефалотин,

Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67

Селективная среда для штамма-продуцента

    Среда: меласса - 100 - 150 г; (NH ) HPO  - 1,3 г; MgSO 7Н O  -
                                     4 2   4              4  2
1,0  г;  (NH ) SO   - 0,5 г; MnSO H O - 0,1 г; ZnSO 7H O - 0,1  г;
            4 2  4               4 2               4  2
агар  Difco - 20 г; вода дистиллированная - до 1000 мл; рН - 6,8 -

7,0; стерилизация 121 °С, 30 мин.

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток продуцента

       12

следующие требования.

6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТу 12.1.005-88.

6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТу 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.

6.3. «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5 °С), атмосферном давлении 630 — 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

9. Проведение измерения

9.1 Условия отбора проб воздуха

Для определения продуцента витамина В воздух аспирируют при

                                      12

помощи  аппарата  Кротова  со  скоростью  10 л/мин. на поверхность
плотной  питательной  среды. Время аспирации воздуха (5 - 20 мин.)

зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента.

Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенки крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2 Выполнение анализа

Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 2 — 3 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.

Селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор антибиотика (левомицетин, линкомицин, цефалотин и др.) из расчета 30 мкг на 1 мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.

После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 28 °С. Через 48 — 72 ч производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.

10. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле:

                     N х 1000

Х = --------, кл./куб. м, V

где:

Х — концентрация клеток продуцента в воздухе;

N — количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 — коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;

V — объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

В случае невозможности использования аппарата Кротова рекомендуется применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 мин. (при определении концентрации микроорганизма в атмосферном воздухе). При использовании этого метода применяют следующий расчет концентрации клеток продуцента:

эмпирически установлено, что за 5 мин. на площадь 100 кв. см оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, за 1 мин. — 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм (радиус 8 см) равна 78,54 кв. см.

Составляем пропорцию:

на 100 кв. см за 1 мин. оседает 2 л воздуха на 78,54 кв. см — Х л Х = 1,57 л/мин.

Следовательно, на стеклянную чашку Петри за 1 мин. оседает 1,57 л воздуха.

Надо определить количество клеток в 1 куб. м воздуха.

На 1 чашку (диаметр 100 мм) за 1 мин. оседает количество микробов, содержащихся в 1,57 л воздуха, за Т мин. — 1,57 х Т л.

В этом количестве содержится № колониеобразующих единиц (микробных клеток — спор, обрывков мицелия), а в 1 куб. м воздуха содержится:

                   N х 1000   N х 636,9

-------- = ---------. 1,57 х Т Т

Пример: за 30 мин. седиментации выросло 12 колоний микроорганизма. В 1 куб. м воздуха содержится:

                  12 х 636,9

---------- = 253 клетки.

                      30

11. Оформление результатов измерений

В 99 в атмосферном воздухе

1. <a id="p100086"></a>Дата проведения анализа ___________________________

2. <a id="p100087"></a>Место отбора пробы ________________________________

3. <a id="p100088"></a>Название лаборатории ______________________________

4. <a id="p100089"></a>Юридический адрес организации _____________________

Результаты микробиологического анализа

Ответственный исполнитель

Список литературы

1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: РД 52.04.186-96. М., 1991. 693 с.

2. ГОСТ Р 8.563-96. ГСИ. Методики выполнения измерений.

3. ГОСТ 17.2.4.02-81. Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ. М.: Изд-во стандартов, 1981. 3 с.