ГОСТ Р 57025-2016. Национальный стандарт Российской Федерации. Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Иммуноферментный метод определения остаточного содержания трифенилметановых красителей
(утв. и введен в действие Приказом Росстандарта от 19.08.2016 № 926-ст)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Евразийского экономического союза «О безопасности рыбы и рыбной продукции» (ТР ЕАЭС 040/2016) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 19.07.2022 № 107). Документ включен в Перечень стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Евразийского экономического союза «О безопасности рыбы и рыбной продукции» (ТР ЕАЭС 040/2016) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 29.08.2017 № 106). Документ введен в действие с 1 июля 2017 года.
Утвержден и введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 19 августа 2016 г. № 926-ст
НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
РЫБА, НЕРЫБНЫЕ ОБЪЕКТЫ И ПРОДУКЦИЯ ИЗ НИХ
ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНОГО СОДЕРЖАНИЯ ТРИФЕНИЛМЕТАНОВЫХ КРАСИТЕЛЕЙ
Fish, non-fish objects and products from them. Immunoenzyme method of determination of the triphenylmethane dyes
Дата введения 1 июля 2017 года
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)
2 ВНЕСЕН Техническим комитетом по стандартизации ТК 300 «Рыбные продукты пищевые, кормовые, технические и упаковка»
3 УТВЕРЖДЕН И ВВЕДЕН В ДЕЙСТВИЕ Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 19 августа 2016 г. № 926-ст
Правила применения настоящего стандарта установлены в статье 16 Федерального закона «О стандартизации в Российской Федерации». Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном (по состоянию на 1 января текущего года) информационном указателе «Национальные стандарты», а официальный текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ближайшем выпуске ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет (www.gost.ru)
Настоящий стандарт распространяется на рыбу, нерыбные объекты (ракообразные, моллюски) и продукцию из них и устанавливает иммуноферментный метод определения остаточного суммарного содержания трифенилметановых красителей (малахитовый зеленый, лейкомалахитовый зеленый, кристаллический фиолетовый, бриллиантовый зеленый).
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 12.1.004 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ OIML R 76-1 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 334 Бумага масштабно-координатная. Технические условия
ГОСТ 908 Кислота лимонная моногидрат пищевая. Технические условия
ГОСТ 1770 (ИСО 1042, ИСО 4788) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 2652 Калия бихромат технический. Технические условия
ГОСТ 3652 Реактивы. Кислота лимонная моногидрат и безводная. Технические условия
ГОСТ 3760 Реактивы. Аммиак водный. Технические условия
ГОСТ 4172 Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный. Технические условия
ГОСТ 4204 Реактивы. Кислота серная. Технические условия
ГОСТ 6709 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 6995 Реактивы. Метанол-яд. Технические условия
ГОСТ 8981 Эфиры этиловый и нормальный бутиловый уксусной кислоты технические. Технические условия
ГОСТ 12026 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 25336 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 31339 Рыба, нерыбные объекты и продукция из них. Правила приемки и методы отбора проб
ГОСТ Р 12.1.019 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана недатированная ссылка, то рекомендуется использовать действующую версию этого стандарта с учетом всех внесенных в данную версию изменений. Если заменен ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, то рекомендуется использовать версию этого стандарта с указанным выше годом утверждения (принятия). Если после утверждения настоящего стандарта в ссылочный стандарт, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение рекомендуется применять без учета данного изменения. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, рекомендуется применять в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины, определения и сокращения
3.1 В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1.1 тест-система: Набор (комплект) специально подобранных реагентов (реактивов) и составных частей, предназначенный для определения одного или нескольких конкретных веществ.
3.1.2 вспомогательный раствор: Раствор, приготовляемый заблаговременно и необходимый для приготовления других типов растворов.
3.1.3 рабочий раствор: Раствор одного или нескольких реактивов, приготовляемый непосредственно перед использованием и необходимый для выполнения процедуры анализа.
3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:
ИФА — иммуноферментный анализ;
КФ — кристаллический фиолетовый;
ЛМЗ — лейкомалахитовый зеленый;
ДДБ — 2,3-дихлоро-5,6-дициано-пара-бензохинон.
4.1 Иммуноферментный метод позволяет определять суммарное содержание трифенилметановых красителей в рабочих растворах экстрактов исследуемых проб с помощью твердофазного конкурентного ИФА.
4.2 Непрямой твердофазный конкурентный ИФА основан на способности трифенилметановых красителей (МЗ) взаимодействовать со специфичными АТ, полученными против МЗ, в условиях конкуренции с белковым конъюгатом МЗ, нанесенным на поверхность лунок планшета, — твердофазным АГ.
4.3 Связавшиеся с твердой фазой АТ выявляют путем измерения интенсивности окрашивания конечного продукта реакции: вторичных антивидовых АТ, меченных пероксидазой хрена, с субстрат-хромогенной смесью.
Аналитический сигнал (регистрируемое значение ОП), характеризующий степень взаимодействия АТ с АГ, обратно пропорционален содержанию трифенилметановых красителей в растворе.
5 Предел обнаружения суммарного содержания трифенилметановых красителей
5.1 Наименьшие пределы определения трифенилметановых красителей представлены в таблице 1.
Пределы определения трифенилметановых красителей
| Определяемый компонент | Предел определения, мкг/кг | |
| Тест-система 1 | Тест-система 2 | |
| МЗ | 0,25 | 1,00 |
5.2 Специфичность АТ, применяемых для определения суммарного содержания трифенилметановых красителей, выраженная в коэффициентах перекрестного реагирования, представлена в таблице 2.
Специфичность АТ, применяемых для определения массовой концентрации трифенилметановых красителей
| Определяемый компонент | Коэффициент перекрестного реагирования, % |
|---|---|
| МЗ | 100 |
| КФ | 110 |
| БЗ | 40 |
| ЛМЗ (после окисления) | 100 |
5.3 Расхождение между результатами двух параллельных определений, полученных в условиях повторяемости, может превышать предел повторяемости r не более одного раза из двадцати.
6 Требования безопасности и условия выполнения измерений
6.1 При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.
6.2 Помещения, в которых проводится анализ и подготовка проб, должны быть оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией и соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и электробезопасности по ГОСТ Р 12.1.019.
6.3 К выполнению измерений допускаются лица, владеющие техникой ИФА и изучившие инструкции по применению тест-систем и инструкции по эксплуатации используемых приборов.
6.4 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
7 Средства измерений, аппаратура, материалы, посуда и реактивы
7.1 При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, аппаратуру, материалы и посуду:
- весы неавтоматического действия высокого класса точности по ГОСТ OIML R 76-1 с пределами допускаемой погрешности +/- 0,001 г;
- весы микроаналитические с наибольшим пределом взвешивания 52 г, с пределом абсолютной допускаемой погрешности не более +/- 0,01 мг;
- pH-метр любой марки, позволяющий проводить измерения в диапазоне от 3 до 10 ед. pH с погрешностью +/- 0,05 ед. pH;
- фотометр вертикального типа фотометрирования с диапазоном измерений ОП от 0 до 3 в комплекте с интерференционным светофильтром для длины волны 450 нм;
- бумагу масштабно-координатную по ГОСТ 334, марки Н-1;
- бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026;
- измельчитель-гомогенизатор лабораторный;
- калькулятор любого типа с логарифмической функцией;
- картридж для твердофазной экстракции объемом не менее 3 см3, заполненный катионообменным сорбентом с диаметром частиц не менее 50 мкм;
- морозильную камеру любого типа, обеспечивающую среднюю температуру в холодильной камере не выше минус 20 °C;
- роторный испаритель любого типа или устройство для испарения экстрактов, с термостатируемым нагревательным модулем с системой отдувки растворителей инертным газом;
- систему получения деионизованной воды высокой чистоты;
- термостат любого типа, поддерживающий температуру (37 +/- 1) °C;
- устройство вакуумное для твердофазной экстракции;
- холодильник бытовой с цифровым контроллером температуры и рабочим диапазоном температур от 0 °C до 8 °C;
- центрифугу с бакет-ротором и адаптером для пробирок типа «Фалькон» вместимостью 15 и 50 см3 и частотой вращения от 3000 до 10000 об/мин;
- шейкер переворачивающий вертикального вращения 360° в одной плоскости с адаптером для пробирок и диапазоном скорости от 20 до 100 об/мин;
- шейкер вортексного типа с вставкой для одной пробирки и диапазоном скорости от 150 до 2500 об/мин;
- шкаф сушильный любого типа, обеспечивающий поддержание температуры не менее (95 +/- 5) °C;
- колбы 1(2)-10(25, 50, 100, 250, 1000)-2 по ГОСТ 1770;
- колбы конические Кн-1-50-24/29 ТС и Кн-2-50-18 ТС по ГОСТ 25336;
- пипетки многоканальные переменной вместимости 0,03 — 0,30 см3, с допустимой относительной погрешностью дозирования по метанолу и ацетонитрилу не более +/- 1,0%;
- пипетки одноканальные переменной вместимости 0,02 — 0,20; 0,1 — 1,0; 0,5 — 5,0; 1 — 10 см3, с допустимой относительной погрешностью дозирования по метанолу и ацетонитрилу не более +/- 1,0%;
- пробирки стеклянные типа «Фалькон» вместимостью 15 и 50 см3 с завинчивающимися крышками;
- пробирки типа «Эппендорф» вместимостью 1,5 см3;
- цилиндры 1(2, 3)-10(50, 100, 250)-1 по ГОСТ 1770.
7.2 При выполнении измерений применяют следующие реактивы:
- 2,3-дихлоро-5,6-дициано-пара-бензохинон (ДДБ) с массовой долей основного вещества не менее 99%;
- аммиак по ГОСТ 3760;
- ацетонитрил для хроматографии, о.с.ч., с массовой долей основного вещества не менее 99,9%;
- воду деионизованную, полученную с использованием системы производства ультрачистой воды из дистиллированной воды по ГОСТ 6709;
- калия бихромат по ГОСТ 2652;
- кислоту лимонную по ГОСТ 908, ГОСТ 3652;
- кислоту серную концентрированную по ГОСТ 4204;
- метанол по ГОСТ 6995, х.ч.;
- натрия гидрофосфат безводный по ГОСТ 4172, х.ч.;
- н-гексан с содержанием основного вещества не менее 98%, х.ч.;
- тест-системы для твердофазного конкурентного ИФА в комплектации (см. приложение А и Б), которые предназначены для суммарного определения массовой доли трифенилметановых красителей с пределом обнаружения:
- этилацетат с содержанием основного вещества не менее 99%, х.ч. по ГОСТ 8981.
8 Подготовка к выполнению измерений
8.1 Подготовка оборудования
8.1.1 При подготовке к проведению измерений лабораторную стеклянную посуду моют смесью водного раствора бихромата калия с концентрированной серной кислотой, многократно промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу, установленном в вытяжном шкафу.
8.1.2 Подготовку и проверку фотометра и pH-метра проводят в соответствии с руководствами по эксплуатации приборов.
8.2 Приготовление растворов
8.2.1 Приготовление растворов для тест-системы 1
8.2.1.1 Приготовление раствора реагента A
В мерную колбу вместимостью 25 см3 вносят 6,25 см3 раствора № 4 (см. приложение А), доводят объем до метки ацетонитрилом и перемешивают.
Используют свежеприготовленный раствор.
8.2.1.2 Приготовление рабочего буферного раствора
В мерную колбу вместимостью 50 см3 вносят 5 см3 ацетонитрила, доводят объем до метки раствором № 2 (см. приложение А) и перемешивают.
Используют свежеприготовленный раствор.
8.2.1.3 Приготовление рабочего раствора буфера для промывки
В мерную колбу вместимостью 250 см3 вносят 50 см3 раствора № 1 (см. приложение А), доводят объем до метки деионизованной водой и перемешивают.
Используют свежеприготовленный раствор.
8.2.1.4 Приготовление рабочего раствора ферментного конъюгата
В пробирку вместимостью 15 см3 вносят 0,6 см3 раствора № 9 (см. приложение А), добавляют 14,4 см3 раствора № 3 (см. приложение А). Пробирку закрывают крышкой и аккуратно перемешивают.
Используют свежеприготовленный раствор.
8.2.1.5 Приготовление рабочих градуировочных растворов МЗ K0 — K5
а) Приготовление исходного раствора МЗ K6
Для приготовления исходного раствора K6 с концентрацией МЗ 0,5 нг/см3 в пробирку вместимостью 15 см3 вносят 3,98 см3 рабочего буферного раствора (см. 8.2.1.2) и 0,02 см3 раствора № 7 (см. приложение А), перемешивают на шейкере в течение 30 с.
б) Приготовление рабочих градуировочных растворов МЗ K0 — K5
Рабочие градуировочные растворы K0 — K5 готовят в пробирках типа «Эппендорф» согласно таблице 3.
Приготовление рабочих градуировочных растворов K0 - K5
| Обозначение и массовая концентрация приготовляемого раствора МЗ | Вносимый объем, см3 | |||
| рабочего буферного раствора (8.2.1.2) | исходного раствора K6 | рабочего раствора K4 | рабочего раствора K2 | |
| K5 (0,2 нг/см3) | 0,6 | 0,4 | - | - |
| K4 (0,05 нг/см3) | 0,9 | 0,1 | - | - |
| K3 (0,02 нг/см3) | 0,6 | - | 0,4 | - |
| K2 (0,01 нг/см3) | 0,8 | - | 0,2 | - |
| K1 (0,005 нг/см3) | 0,5 | - | - | 0,5 |
| K0 (0 нг/см3) | 1,0 | - | - | - |
Пробирки закрывают крышками и перемешивают на шейкере в течение 20 с.
Используют свежеприготовленные растворы.
8.2.2 Приготовление растворов для тест-системы 2
8.2.2.1 Приготовление раствора лимонной кислоты с молярной концентрацией 0,1 моль/дм3
В мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 19,2 г лимонной кислоты, приливают порциями деионизованную воду, тщательно перемешивают и доводят объем до метки деионизованной водой.
Срок хранения раствора при температуре от 2 °C до 8 °C — не более 1 мес.
8.2.2.2 Приготовление раствора гидрофосфата натрия с молярной концентрацией 0,2 моль/дм3
В мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 28,4 г гидрофосфата натрия, приливают порциями деионизованную воду, тщательно перемешивают и доводят объем до метки деионизованной водой.
Срок хранения раствора при температуре от 2 °C до 8 °C — не более 1 мес.
8.2.2.3 Приготовление буферного раствора по Макилвейну с pH (2,6 +/- 0,1)
В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 89,1 см3 раствора лимонной кислоты (см. 8.2.2.1) и 10,9 см3 раствора гидрофосфата натрия (см. 8.2.2.2), контролируя значение pH с помощью pH-метра, перемешивают.
Срок хранения раствора при температуре от 2 °C до 8 °C — не более одной недели.
8.2.2.4 Приготовление рабочего буферного раствора
В мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят 9 см3 реакционного буферного раствора № 5 (см. приложение Б), добавляют 1 см3 метанола, перемешивают и закрывают притертой пробкой.
Используют свежеприготовленный раствор.
8.2.2.5 Приготовление раствора ДДБ с молярной концентрацией 0,01 моль/дм3
В мерную колбу вместимостью 50 см3 вносят 113,7 мг ДДБ, растворяют в небольшом количестве ацетонитрила, затем доводят раствор до метки этим же растворителем.
Используют свежеприготовленный раствор.
8.2.2.6 Приготовление вспомогательного раствора 1 (ВР1)
В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 50 см3 буферного раствора (см. 8.2.2.3) и доводят раствор до метки ацетонитрилом.
Используют свежеприготовленный раствор.
8.2.2.7 Приготовление вспомогательного раствора 2 (ВР2)
В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 5 см3 аммиака и доводят раствор до метки метанолом.
Используют свежеприготовленный раствор.
8.2.2.8 Приготовление рабочего раствора буфера для промывки
В колбу вместимостью 100 см3 вносят 95 см3 деионизованной воды, добавляют 5 см3 раствора № 2 <1> (см. приложение Б), перемешивают на шейкере в течение 2 мин.
<1> При хранении раствора № 2 могут образовываться кристаллы, поэтому перед отбором аликвоты данного реактива необходимо слабо подогреть пробирку с ним при температуре 37 °C в водяной бане или в термостате до полного растворения кристаллов.
Раствор хранят при температуре от 2 °C до 8 °C. Срок годности — 1 мес.
8.2.2.9 Приготовление рабочего раствора ферментного конъюгата
В пробирку вместимостью 15 см3 вносят 1,8 см3 раствора № 5 (см. приложение Б) и 0,2 см3 раствора № 4 (см. приложение Б), аккуратно перемешивают.
Используют свежеприготовленный раствор.
8.2.2.10 Приготовление рабочих градуировочных растворов МЗ K0 — K4
а) Приготовление исходного раствора МЗ K5
Для приготовления исходного раствора K5 с концентрацией МЗ 12,8 нг/см3 в пробирку, вместимостью 15 см3 вносят 0,9 см3 раствора № 5 и 0,1 см3 раствора № 3 (см. приложение Б), перемешивают на шейкере в течение 30 с.
б) Приготовление рабочих градуировочных растворов МЗ K0 — K4
Рабочие градуировочные растворы K0 — K4 готовят в пробирках вместимостью 15 см3 согласно таблице 4.
Приготовление рабочих градуировочных растворов K0 — K5
| Обозначение и массовая концентрация приготовляемого раствора МЗ | Вносимый объем, см3 | ||||
| рабочего буферного раствора (8.2.2.4) | исходного раствора K5 | рабочего раствора K4 | рабочего раствора K3 | рабочего раствора K2 | |
| K4 (3,2 нг/см3) | 0,75 | 0,25 | - | - | - |
| K3 (1,6 нг/см3) | 0,5 | - | 0,5 | - | - |
| K2 (0,8 нг/см3) | 0,5 | - | - | 0,5 | - |
| K1 (0,4 нг/см3) | 0,5 | - | - | - | 0,5 |
| K0 (0 нг/см3) | 1,0 | - | - | - | - |
Пробирки закрывают крышками и перемешивают на шейкере в течение 20 с.
Используют свежеприготовленные растворы.
8.3 Отбор проб
8.3.1.1 Отбор проб рыбы, нерыбных объектов и продукции из них — по ГОСТ 31339.
8.3.1.2 Срок хранения отобранных проб при температуре от 2 °C до 8 °C — двое суток. При отсутствии возможности исследования проб в течение двух суток образцы должны быть заморожены при температуре минус 20 °C со сроком хранения не более двух месяцев.
8.4 Подготовка проб
Перед началом анализа пробы достают из холодильника и выдерживают при комнатной температуре не менее 30 мин.
Пробы рыбы предварительно очищают от крупных костей и кожи, креветки — от хитина и других нецелевых составляющих, измельчают на гомогенизаторе.
8.4.1 Подготовка проб для тест-системы 1
5,00 г гомогенизированной пробы помещают в стеклянную пробирку вместимостью 50 см3. Затем обрабатывают испытуемые пробы и градуировочные растворы, приготовленные по 8.2.1.5.2, как указано на рисунке 1.
| В каждую пробирку вносят по 10 см3 ацетонитрила, перемешивают в течение 1 мин на шейкере, после чего перемешивают на переворачивающем шейкере в течение 10 мин |
|---|
 |
| Центрифугируют при 4000 об/мин и температуре 15 °C в течение 10 мин |
 |
| В пробирку вместимостью 15 см3 взвешивают 3,0 г нейтрального оксида алюминия № 6 (см. приложение А), переносят в нее надосадочную жидкость и перемешивают на шейкере в течение 1 мин |
 |
| Центрифугируют при 4000 об/мин и температуре 15 °C в течение 10 мин |
 |
| Переносят 2,0 см3 надосадочной жидкости в пробирку вместимостью 15 см3 и упаривают досуха в токе азота в системе упаривания при температуре 50 °C |
 |
| К сухому экстракту добавляют 0,5 см3 раствора реагента A (см. 8.2.1.1), перемешивают на шейкере в течение 30 сек до полного растворения и инкубируют при комнатной температуре в темном месте в течение 30 мин |
 |
| Добавляют 0,1 г реагента B № 5 (см. приложение А), закрывают пробирку, перемешивают на шейкере в течение 10 сек и инкубируют при комнатной температуре в темном месте в течение 30 мин |
 |
| 0,02 см3 полученного раствора переносят в пробирку типа «Эппендорф», добавляют 0,38 см3 рабочего буферного раствора (см. 8.2.1.2), закрывают крышкой и перемешивают на шейкере в течение 1 мин |
 |
| 0,1 см3 полученного раствора переносят в новую пробирку типа «Эппендорф», добавляют 0,4 см3 рабочего буферного раствора (см. 8.2.1.2), закрывают крышкой, перемешивают на шейкере в течение 1 мин и используют при проведении ИФА в соответствии с разделом 9 |
Рисунок 1 — Обработка испытуемых проб и градуировочных растворов для тест-системы 1
8.4.2 Подготовка проб для тест-системы 2
1,00 г гомогенизированной пробы помещают в стеклянные пробирки вместимостью 15 см3. Затем обрабатывают испытуемые пробы и градуировочные растворы, приготовленные по 8.2.2.10, как указано на рисунке 2.
| В каждую пробирку вносят по 2,5 см3 буферного раствора по Макилвейну (см. 8.2.2.3), 2 см3 ацетонитрила и 0,5 см3 раствора ДДБ (см. 8.2.2.5) и перемешивают на переворачивающем шейкере в темноте в течение 30 мин |
|---|
 |
| Центрифугируют при 3500 об/мин и температуре 20 °C в течение 5 мин |
 |
| Подготовленные пробы очищают методом твердофазной экстракции. Предварительно кондиционируют картридж, установленный в блок вакуумного устройства, 0,5 см3 метанола и уравновешивают 0,5 см3 вспомогательного раствора ВР1 (см. 8.2.2.6) |
 |
| Пропускают через картридж 2 см3 надосадочной жидкости |
 |
| Промывают картридж, последовательно пропуская 0,25 см3 деионизованной воды, 0,25 см3 метанола, 0,25 см3 этилацетата, 0,25 см3 гексана и сушат его в вакууме водоструйного насоса 3 мин |
 |
| Элюируют определяемые вещества 2 см3 вспомогательного раствора ВР2 (см. 8.2.2.7) |
 |
| Упаривают элюат досуха в токе азота в системе упаривания при температуре 45 °C |
 |
| Остаток перерастворяют в 0,5 см3 рабочего буферного раствора (см. 8.2.2.4) и используют для проведения ИФА в соответствии с разделом 9 |
Рисунок 2 — Обработка испытуемых проб и градуировочных растворов для тест-системы 2
9 Проведение иммуноферментного анализа
9.1 Общие положения
9.1.1 При проведении испытаний следует использовать реагенты и компоненты, входящие в один и тот же набор (тест-систему). Разбавление или замена реагентов из набора (тест-системы) другой серии не допускается.
9.1.2 Наборы (тест-системы) следует хранить при температуре от 2 °C до 8 °C в пределах срока годности.
9.1.3 Окрашивание раствора хромогена (раствор № 10, приложение А) или раствора субстрата № 6 (см. приложение Б) является признаком их порчи и делает невозможным их применение для анализа.
9.2 Подготовка набора (тест-системы) к проведению анализа
9.2.1 Перед использованием тест-систему вынимают из холодильника и выдерживают в темном месте (в ящике стола или в шкафу) при комнатной температуре не менее 30 мин, после чего осторожно встряхивают каждый флакон.
9.2.2 После использования реагенты тест-системы сразу убирают в холодильник.
9.2.3 На всех стадиях необходимо избегать воздействия прямого солнечного света.
9.2.4 Для каждого реактива и раствора используют отдельные съемные наконечники пипеток переменной вместимости. Внесение растворов в лунки проводят осторожно, не касаясь наконечниками их дна и стенок.
9.2.5 Каждый исследуемый экстракт испытуемых проб (см. 8.4) и рабочие градуировочные растворы (см. 8.2.1.5, 8.2.2.10) анализируют в двух повторностях.
Примечание - Далее приведены расходы реактивов на два стрипа, что достаточно для анализа двух исследуемых проб. Для другого числа проб количество используемых стрипов и смешиваемых объемов реагентов изменяют в соответствии с количеством исследуемых проб.
9.2.6 Вскрывают вакуумную упаковку планшета. Из планшета извлекают необходимое число стрипов (полосок по 8 лунок). Неиспользованные стрипы тщательно заклеивают пленкой для заклеивания планшетов и хранят в упаковке при температуре от 2 °C до 8 °C в течение срока годности тест-системы.
9.3 Проведение анализа с помощью тест-системы 1
Анализ экстрактов испытуемых проб и рабочих градуировочных растворов проводят в соответствии с рисунком 3.
| В лунки планшета вносят по 0,075 см3 рабочих градуировочных растворов K0 - K5 (см. 8.2.1.5) и экстрактов испытуемых проб согласно схеме (см. приложение В). Каждый раствор вносят в двойной повторности (лунки-дубли). Во все лунки планшета добавляют по 0,075 см3 раствора антител № 8 (см. приложение А) |
|---|
 |
| Растворы в лунках перемешивают аккуратным постукиванием по ребру рамки планшета. Планшет заклеивают пленкой и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин |
 |
| Снимают пленку, сливают растворы из лунок планшета. Планшет переворачивают на чистую фильтровальную бумагу и постукивают им, чтобы убрать остатки растворов из лунок |
 |
| В лунки планшета вносят по 0,2 см3 рабочего раствора буфера для промывки (см. 8.2.1.3), оставляют на 30 сек. Содержимое лунок сливают, промывку повторяют еще три раза |
 |
| Планшет переворачивают на чистую фильтровальную бумагу и постукивают им, чтобы убрать остатки растворов из лунок |
 |
| В лунки планшета вносят по 0,15 см3 рабочего раствора ферментного конъюгата (см. 8.2.1.4). Растворы в лунках перемешивают аккуратным постукиванием по ребру рамки планшета и инкубируют в течение 30 мин, как указано выше |
 |
| Содержимое лунок сливают и убирают остатки растворов, как указано выше |
 |
| В лунки планшета вносят по 0,2 см3 рабочего раствора буфера для промывки (8.2.1.3), оставляют на 30 с. Содержимое лунок сливают, промывку повторяют еще три раза |
 |
| Планшет переворачивают на чистую фильтровальную бумагу и постукивают им, чтобы убрать остатки растворов из лунок |
 |
| В лунки планшета вносят по 0,15 см3 раствора № 10 (см. приложение А) |
 |
| Растворы в лунках перемешивают аккуратным постукиванием по ребру рамки планшета и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин |
 |
| В лунки планшета вносят по 0,1 см3 стоп-раствора № 11 (см. приложение А) и перемешивают раствор аккуратным постукиванием по ребру рамки планшета |
 |
| Планшет устанавливают в держатель планшета спектрофотометра и производят измерение ОП <1> при длине волны 450 нм. Время измерения оптической плотности не должно превышать 10 мин после добавления стоп-раствора № 11 (см. приложение А) |
<1> Считывать значения оптической плотности необходимо в течение 10 минут после добавления стоп-раствора № 11.
Рисунок 3 — Проведение анализа с помощью тест-системы 1
9.4 Проведение анализа с помощью тест-системы 2
Анализ экстрактов испытуемых проб и рабочих градуировочных растворов проводят в соответствии с рисунком 4.
| В лунки планшета вносят по 0,05 см3 рабочих градуировочных растворов K0 - K4 (см. 8.2.2.10) и экстрактов испытуемых проб согласно схеме (см. приложение В), начиная с минимальной концентрации. Каждый раствор вносят в двойной повторности |
|---|
 |
| Во все лунки планшета вносят по 0,05 см3 раствора № 1-АТ (см. приложение Б). Процедура внесения экстрактов испытуемых проб, градуировочных растворов, раствора № 1-АТ не должна превышать 15 мин |
 |
| Растворы в лунках перемешивают аккуратным постукиванием по ребру рамки планшета |
 |
| Заклеивают планшет пленкой для заклеивания планшетов либо закрывают крышкой, помещают его в полиэтиленовый пакет и плотно укупоривают. Выдерживают в термостате при температуре 37 °C в течение 1 ч, избегая попадания прямого солнечного света |
 |
| Содержимое лунок сливают и промывают планшет. Для этого в каждую лунку вносят по 0,2 см3 рабочего раствора буфера для промывки (см. 8.2.2.8) и сразу удаляют ее содержимое. Процедуру повторяют еще дважды. После этого тщательно стряхивают остатки раствора из лунок на фильтровальную бумагу |
 |
| Во все лунки планшета вносят по 0,1 см3 рабочего раствора ферментного конъюгата (см. 8.2.2.9). Заклеивают планшет пленкой для заклеивания планшетов либо закрывают крышкой, помещают его в полиэтиленовый пакет и плотно укупоривают. Выдерживают в термостате при температуре 37 °C в течение 1 ч, избегая попадания прямого солнечного света |
 |
| Содержимое лунок сливают и промывают планшет. Для этого в каждую лунку вносят по 0,2 см3 рабочего раствора буфера для промывки (см. 8.2.2.8) и сразу удаляют ее содержимое. Процедуру повторяют еще дважды. После этого тщательно стряхивают остатки раствора из лунок на фильтровальную бумагу |
 |
| Во все лунки планшета вносят по 0,1 см3 реагента № 6 (см. приложение Б). Выдерживают планшет при комнатной температуре в темном месте в течение 10 мин |
 |
| Вносят во все лунки планшета с той же скоростью и в той же последовательности по 0,1 см3 стоп-реагента № 7 (см. приложение Б) |
 |
| Планшет устанавливают в держатель планшета спектрофотометра и измеряют ОП при длине волны 450 нм. Время измерения оптической плотности не должно превышать 10 — 15 мин после добавления стоп-реагента № 7 (см. приложение Б) |
Рисунок 4 — Проведение анализа с помощью тест-системы 2
10 Обработка результатов измерения
10.1 По показателям ОП в лунках-дублях находят среднеарифметические значения. Разность значений ОП для них в процентах от среднего не должна превышать 10.
Связывание АТ (или относительное поглощение) П, %, вычисляют по формуле
\text{П } = \frac{\text{ОП}_{\text{к}}}{\text{ОП}_{0}} \cdot 100 , (1)
где ОПк — среднее значение ОП, измеренной в лунках с градуировочными растворами МЗ K5 — K1 (см. 8.2.1.5) или K4 — K1 (см. 8.2.2.10) или экстрактами анализируемых проб.
ОП0 — среднее значение ОП, измеренной в лунках с градуировочным раствором K0 (см. 8.2.1.5) для тест-системы 1 и реактивом № 5 (см. приложение Б) для тест-системы 2.
По значениям процентов связывания, вычисленным для градуировочных растворов и соответствующим известным значением массовой концентрации МЗ (нг/см3), строят градуировочный график в полулогарифмической системе координат.
10.2 Для построения градуировочного графика используют масштабно-координатную бумагу. На ось абсцисс наносят значения логарифмов концентраций МЗ в рабочих разведениях градуировочных растворов K5 — K1 (см. 8.2.1.5) или K4 — K1 (см. 8.2.2.10). По оси ординат откладывают значения процентов связывания, рассчитанные для массовых концентраций по формуле (1) и строят градуировочный график с использованием линейной зависимости.
10.3 С помощью градуировочного графика по значению процента связывания, полученного для растворов экстрактов испытуемых проб, находят логарифм массовой концентрации трифенилметановых красителей. С помощью калькулятора вычисляют его обратное значение (антилогарифм), соответствующее массовой концентрации определяемого трифенилметанового красителя в растворе экстракта.
10.4 Содержание трифенилметановых красителей C в анализируемой пробе, мкг/кг, рассчитывают по формуле
где c — массовая концентрация трифенилметановых красителей в экстракте анализируемой пробы, определяемая по градуировочному графику, мкг/дм3;
K — коэффициент пересчета мкг/дм3 в экстракте анализируемой пробы в мкг/кг, учитывающий как разведение, так и степень извлечения трифенилметановых красителей и равный 50 для тест-системы 1 и 1,25 для тест-системы 2.
Результаты измерений содержания трифенилметановых красителей, мкг/кг, округляют до двух значащих цифр после запятой.
10.5 Допускается использование программного обеспечения, позволяющего определять массовую концентрацию (содержание) трифенилметановых красителей в анализируемой пробе по средним значениям ОП, измеренным в лунках с градуировочными растворами и экстрактами анализируемых проб.
С помощью компьютерной системы обработки данных строят градуировочную зависимость оптической плотности раствора от массовой концентрации МЗ и аппроксимируют линейной функцией.
Градуировочная зависимость считается приемлемой, если рассчитанное программным обеспечением значение коэффициента корреляции r2 не менее 0,98.
Положительными считают пробы, показавшие значения содержания МЗ выше предела количественного определения (мкг/кг).
В комплектацию тест-системы входят:
Планшет 96-луночный полистироловый стрипованный, сенсибилизированный антигеном, готовый для использования.
№ 1 — буфер отмывочный, 5-кратный концентрат, маркированный «Буфер-ОТ»;
№ 2 — буфер для разведения образцов;
№ 3 — буфер для разведения ферментного конъюгата;
№ 4 — раствор для подготовки образцов к анализу, маркированный «Реагент A», 4-кратный концентрат;
№ 5 — порошок для подготовки образцов к анализу, маркированный «Реагент B»;
№ 6 — нейтральный оксид алюминия, фракция 100 — 200 меш;
№ 7 — градуировочный раствор с содержанием МЗ 100 мкг/кг, маркированный «C0»;
№ 8 — антитела, специфичные к МЗ;
№ 9 — конъюгат МЗ с пероксидазой хрена, 25-кратный концентрат;
№ 10 — смесь субстрата и хромогена;
№ 11 — стоп-раствор-1 н. раствор соляной кислоты.
В комплектацию тест-системы входят:
Планшет 96-луночный полистироловый стрипованный, сенсибилизированный антигеном, готовый для использования.
№ 1 — антитела к малахитовому зеленому, прозрачная опалесцирующая жидкость кремового цвета, готовая для использования, 6,0 см3;
№ 2 — раствор фосфатного буфера с добавлением твина-20 (20-кратный концентрат), pH 7,2 +/- 0,5, прозрачная бесцветная жидкость, 20,0 см3;
№ 3 — раствор малахитового зеленого с концентрацией 128 нг/мл, 1 см3;
№ 4 — конъюгат антивидовых антител с пероксидазой хрена (10-кратный концентрат), прозрачная бесцветная жидкость, 2,0 см3;
№ 5 — реакционный буферный раствор с добавлением твина-20 и бычьего сывороточного альбумина, pH 7,0 — 7,4, стерильный, прозрачная бесцветная жидкость, 20,0 см3;
№ 6 — раствор субстрата на основе 3,3',5,5'-тетраметил-бензидина с добавлением перекиси водорода, прозрачная бесцветная жидкость, готовая для использования, 11,0 см3;
№ 7 — стоп-реагент — раствор серной кислоты с молярной концентрацией 0,5 М, прозрачная бесцветная жидкость, готовая для использования, 11,0 см3.
СХЕМА ЗАПОЛНЕНИЯ ЛУНОК ПЛАНШЕТА
Внесение реагентов следует проводить согласно следующей схеме: