ГОСТ 35373-2026. Межгосударственный стандарт. Добавки пищевые. Методы идентификации и определения массовой доли основных красящих веществ пищевого красителя кармины E120
(введен в действие Приказом Росстандарта от 15.07.2026 № 809-ст)
Примечание
Документ вводится в действие с 01.01.2027 с правом досрочного применения.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 15 июля 2026 г. № 809-ст
МЕТОДЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАССОВОЙ ДОЛИ ОСНОВНЫХ КРАСЯЩИХ ВЕЩЕСТВ ПИЩЕВОГО КРАСИТЕЛЯ КАРМИНЫ E120
Food additives. Methods for identification and determination of total coloring matters percentage for food colours carmines E120
Дата введения 1 января 2027 года с правом досрочного применения
Предисловие
Цели, основные принципы и общие правила проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Всероссийским научно-исследовательским институтом пищевых добавок — филиалом Федерального государственного бюджетного научного учреждения «Федеральный научный центр пищевых систем имени В.М. Горбатова» РАН (ВНИИПД — филиал ФГБНУ «ФНЦ пищевых систем им. В.М. Горбатова» РАН)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 30 июня 2026 г. № 198-П)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 15 июля 2026 г. № 809-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 35373-2026 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2027 г. с правом досрочного применения
Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта и изменений к нему на территории указанных выше государств публикуется в указателях национальных стандартов, издаваемых в этих государствах, а также в сети Интернет на сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации.
В случае пересмотра, изменения или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации в каталоге «Межгосударственные стандарты»
1 Область применения
Настоящий стандарт распространяется на методы идентификации и количественного определения красящих веществ пищевой добавки кармины E120, представляющей собой карминовую кислоту (carminic acid) или кармин (carmine), предназначенной для использования в пищевой промышленности в качестве красителя (далее — краситель), и устанавливает:
- хроматографический метод определения (идентификации) основного красящего вещества красителя в тонком слое сорбента;
- спектрофотометрический метод определения (идентификации) основного красящего вещества красителя;
- спектрофотометрический метод измерения массовой доли основного красящего вещества красителя;
- метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с диодно-матричным и масс-спектрометрическим детектированием для определения (идентификации) и измерения массовой доли красящих веществ красителя.
Примечание - Основным красящим веществом красителя является карминовая кислота. Карминовую кислоту получают из водных, водно-спиртовых или спиртовых экстрактов кошенили, высушенных телец самок насекомого Dactylopius Coccus Costa. Кармин представляет собой алюминиевый лак карминовой кислоты, в котором алюминий и карминовая кислота присутствуют в молярном соотношении 1:2. Содержание основного красящего вещества должно составлять не менее 90% в карминовой кислоте и не менее 50% в алюминиевом лаке. В красителе может присутствовать 4-аминокарминовая кислота в количестве не более 3% от содержания карминовой кислоты.
2 Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.0.004 <1> Система стандартов безопасности труда. Организация обучения безопасности труда. Общие положения
<1> Не действует в Российской Федерации до 1 сентября 2026 г.
ГОСТ 12.1.004 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.005 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны
ГОСТ 12.1.007 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 12.2.007.0 Система стандартов безопасности труда. Изделия электротехнические. Общие требования безопасности
ГОСТ 12.4.009 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание
ГОСТ 12.4.021 Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования
ГОСТ 12.4.103 Система стандартов безопасности труда. Одежда специальная защитная, средства индивидуальной защиты ног и рук. Классификация
ГОСТ 1770 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 2603 Реактивы. Ацетон. Технические условия
ГОСТ 3118 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 3760 Реактивы. Аммиак водный. Технические условия
ГОСТ 4172 Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный. Технические условия
ГОСТ 4198 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия
ГОСТ 4517 Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, применяемых при анализе
ГОСТ 5848 Реактивы. Кислота муравьиная. Технические условия
ГОСТ 6709 <1> Вода дистиллированная. Технические условия
<1> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 58144-2018.
ГОСТ 14919 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 21241 Пинцеты медицинские. Общие технические требования и методы испытаний
ГОСТ 22300 Реактивы. Эфиры этиловый и бутиловый уксусной кислоты. Технические условия
ГОСТ 25336 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 29227 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
ГОСТ ISO 3696 Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы контроля <2>
<2> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 52501-2005 (ИСО 3696:1987) «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».
ГОСТ ИСО 5725-6-2003 <3> Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике
<3> В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002.
ГОСТ ISO 7886-1 Шприцы инъекционные однократного применения стерильные. Часть 1. Шприцы для ручного использования
ГОСТ ISO/IEC 17025 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий
ГОСТ OIML R 76-1 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов и классификаторов на официальном интернет-сайте Межгосударственного совета по стандартизации, метрологии и сертификации (www.easc.by) или по указателям национальных стандартов, издаваемым в государствах, указанных в предисловии, или на официальных сайтах соответствующих национальных органов по стандартизации. Если на документ дана недатированная ссылка, то следует использовать документ, действующий на текущий момент, с учетом всех внесенных в него изменений. Если заменен ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, то следует использовать указанную версию этого документа. Если после принятия настоящего стандарта в ссылочный документ, на который дана датированная ссылка, внесено изменение, затрагивающее положение, на которое дана ссылка, то это положение применяется без учета данного изменения. Если ссылочный документ отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Отбор проб
3.1 Для составления суммарной (объединенной) пробы красителя из каждой упаковочной единицы партии красителя отбирают мгновенные (точечные) пробы.
Определение партии — в соответствии с требованиями нормативных правовых актов, действующих на территории государства, принявшего стандарт.
Примечание — Информация о нормативных правовых актах приведена в приложении А.
3.2 Выборку упаковочных единиц из партии осуществляют методом случайного отбора в соответствии с таблицей 1.
| Количество упаковочных единиц в партии, шт. | Объем выборки, шт. |
|---|---|
| От 2 до 15 включ. | 2 |
| « 16 » 25 «» | 3 |
| « 26 » 90 «» | 5 |
| « 91 » 150 «» | 8 |
| « 151 » 500 «» | 13 |
| « 501 » 1200 и более | 20 |
3.3 Мгновенные (точечные) пробы отбирают из разных мест каждой упаковочной единицы, попавшей в выборку.
Масса мгновенной (точечной) пробы должна быть не более 10 г.
Масса мгновенной (точечной) пробы и число мгновенных (точечных) проб из каждой упаковочной единицы, попавшей в выборку, должны быть одинаковыми.
Мгновенные (точечные) пробы отбирают с помощью пробоотборника (щупа или металлической трубки), погружая его в краситель не менее чем на 3/4 глубины.
3.4 Мгновенные (точечные) пробы, отобранные по 3.3, помещают в сухую чистую емкость из стекла или полимерных материалов и тщательно перемешивают. Получают суммарную (объединенную пробу).
Рекомендуемая масса суммарной (объединенной) пробы — не менее 50 г.
3.5 Подготовленную суммарную (объединенную) пробу делят на две равные части, которые помещают в чистые, сухие, плотно закрывающиеся стеклянные или полимерные емкости.
Емкость с первой частью суммарной (объединенной) пробы направляют в лабораторию для проведения анализов.
Емкость со второй частью пробы опечатывают, пломбируют и хранят для повторного контроля в случае возникновения разногласий в оценке качества и безопасности красителя. Срок хранения пробы в темном месте при температуре от 5 °C до 25 °C и относительной влажности не более 60% — до окончания срока годности красителя.
3.6 Емкости с пробами снабжают этикетками, на которых должны быть указаны:
- полное наименование красителя и его индекс (например, кармины E120);
- наименование и местонахождение изготовителя;
- номер партии;
- масса нетто партии;
- количество упаковочных единиц в партии;
- дата изготовления;
- дата отбора проб;
- срок хранения пробы;
- фамилии лиц, проводивших отбор данной пробы.
4 Требования безопасности
4.1 При выполнении анализов необходимо соблюдать требования безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007 и ГОСТ 12.4.103.
4.2 Помещение, в котором проводят анализы, должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.4.021.
4.3 Электробезопасность при работе с электроустановками — по ГОСТ 12.2.007.0 и ГОСТ 12.1.019.
4.4 Организация обучения работающих требованиям безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004.
4.5 Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.
4.6 Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать норм, установленных ГОСТ 12.1.005.
5 Условия проведения анализа
При подготовке и проведении измерений должны быть соблюдены следующие условия: - температура окружающего воздуха .................. от 18 °C до 25 °C; - относительная влажность воздуха .................. от 30% до 75%.
Все операции с реактивами следует проводить в вытяжном шкафу.
6 Требования к квалификации оператора
К выполнению и обработке результатов анализа допускают специалиста, имеющего высшее или среднее специальное химическое образование и опыт работы в химической лаборатории, владеющего техникой выполнения анализов с применением методов спектрофотометрии, тонкослойной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии, изучившего руководство по эксплуатации спектрофотометра и жидкостного хроматографа, инструкцию по использованию системы обработки хроматографических данных и методов спектрального анализа, освоившего настоящие методики, прошедшего обучение по работе с приборами и инструктаж по технике безопасности.
7 Средства измерений, вспомогательное оборудование и устройства, посуда, реактивы
Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 специального (I) класса точности с пределами абсолютной допускаемой погрешности в эксплуатации +/- 0,001 г.
Весы утвержденного типа, поверенные в установленном порядке, с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более +/- 0,5 мг.
Спектрофотометр с диапазоном измерения в интервале длин волн от 350 до 900 нм, с допустимой абсолютной погрешностью коэффициента пропускания не более +/- 1%, укомплектованный компьютером, принтером и соответствующим аттестованным программным обеспечением.
Система высокоэффективной жидкостной хроматографии, оснащенная бинарным насосом, термостатом хроматографической колонки, инжектором для ручного или автоматического ввода проб, устройством дегазации подвижных фаз, диодно-матричным детектором, позволяющим проводить измерения оптической плотности в диапазоне длин волн 190 — 800 нм.
Масс-спектрометр, оснащенный источником ионизации с электрораспылением, квадрупольным анализатором с диапазоном измерений от 50 до 900 атомных единиц массы (а. е. м.), с массовым разрешением не менее 1 а. е. м., с пределами допускаемой абсолютной погрешности не более +/- 0,5 а. е. м., режимом получения и анализа фрагментных ионов.
Колонка аналитическая, заполненная обращенно-фазовым сорбентом С18 с размером частиц 1,8 мкм, внутренним диаметром 4,6 мм, длиной 150 мм для обращенно-фазовой хроматографии с защитной колонкой (предколонкой) размерами 12,5 x 4,6 мм.
Компьютер с установленным программным обеспечением для сбора и обработки хроматографических данных.
Фильтры мембранные из политетрафторэтилена с размером пор 0,45 мкм.
Шкаф сушильный, обеспечивающий поддержание заданного режима температуры от 20 °C до 200 °C с погрешностью +/- 2 °C.
pH-метр с диапазоном измерений -1,99 ... +19,99 с пределом погрешности измерения pH не более +/- 0,1.
Баня ультразвуковая лабораторная с рабочей частотой не менее 20 кГц и объемом не менее 1 дм3.
Встряхиватель (шейкер) вибрационный для пробирок орбитального типа движения с амплитудой встряхивания 3 мм, диапазоном скоростей от 150 до 2500 об/мин.
Холодильник бытовой с рабочим диапазоном температур от 2 °C до 8 °C.
Электроплитка бытовая по ГОСТ 14919.
Кюветы кварцевые толщиной поглощающего слоя 1 см.
Дозаторы механические одноканальные переменной вместимостью 10 — 100 мм3 с допустимой относительной погрешностью дозирования не более +/- 3%.
Дозаторы механические одноканальные переменной вместимостью 100 — 1000 мм3, 1000 — 5000 мм3 с допустимой относительной погрешностью дозирования не более +/- 2%.
Пипетки градуированные 2-1-2-1, 2-1-2-5, 2-1-2-10 по ГОСТ 29227.
Шприцы медицинские одноразовые вместимостью от 1 до 10 см3 по ГОСТ ISO 7886-1.
Виалы (флаконы) стеклянные с навинчивающимися крышками для хранения растворов вместимостью от 5 до 40 см3.
Виалы (флаконы) стеклянные для автоматического ввода проб вместимостью не менее 1,5 см3 с навинчиваемыми крышками и тефлоновыми прокладками диаметром 9 мм.
Колбы мерные 2-10-1, 2-50-1, 2-100-1, 2-500-1, 2-1000-1 со шлифом и пришлифованной пробкой, класса точности 1 по ГОСТ 1770.
Цилиндры 1-25-1, 1-50-1, 1-100-1 с ценой наименьшего деления 1 см3 по ГОСТ 1770.
Колбы плоскодонные любого типа исполнения вместимостью 50, 250 см3 по ГОСТ 25336.
Пластины для тонкослойной хроматографии на полимерной подложке со слоем микрокристаллической целлюлозы толщиной 100 мкм, размерами 20 x 20 см.
Камера хроматографическая стеклянная размерами 235 x 235 x 60 мм.
Пробки из пластмассы или стеклянные с конусами 7/16, 10/19, 19/26, 24/29 по ГОСТ 1770.
Стаканчики для взвешивания СВ-19/9 (24/10) или СН-34/12 по ГОСТ 25336.
Стаканы любого типа исполнения вместимостью 50 см3 по ГОСТ 25336.
Пинцет медицинский по ГОСТ 21241.
Карминовая кислота (carminic acid) с содержанием основного красящего вещества не менее 90% в сухом веществе (контрольный краситель).
Кармин (carmine) с содержанием основного красящего вещества не менее 50% в сухом веществе (контрольный краситель).
4-аминокарминовая кислота с содержанием основного красящего вещества не менее 90% (контрольный краситель).
Ацетонитрил, осч. сорт 0 или для высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Кислота соляная по ГОСТ 3118, х. ч.
Кислота муравьиная по ГОСТ 5848, ч. д. а.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Вода для лабораторного анализа с удельной электрической проводимостью при температуре 25 °C не более 0,010 мСм/м по ГОСТ ISO 3696.
Калий фосфорнокислый однозамещенный, х. ч., по ГОСТ 4198.
Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный, х. ч. по ГОСТ 4172.
Этиловый эфир уксусной кислоты по ГОСТ 22300, х. ч.
Допускается применение других средств измерений, вспомогательных оборудования и устройств, посуды и материалов, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающих необходимую точность измерения, а также применение реактивов по качеству не ниже вышеуказанных.
8 Хроматографический метод определения (идентификации) основного красящего вещества красителя в тонком слое сорбента
8.1 Сущность метода
Метод основан на разделении красящих веществ красителя при хроматографировании в тонком слое сорбента (ТСХ) и их идентификации путем сравнения цвета пятна и значения R\prime_{f} [отношение расстояния миграции пятна красящего вещества анализируемого красителя до линии старта к расстоянию миграции границы элюента (проявителя) до линии старта] каждого красящего вещества анализируемого красителя со значениями Rf красящих веществ контрольного образца (КО) красителя.
8.2 Подготовка к проведению анализа
8.2.1 Приготовление элюентов
8.2.1.1 Приготовление элюента 1
Раствор 1. В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,9080 г однозамещенного фосфорнокислого калия, затем прибавляют дистиллированную воду, перемешивают содержимое до полного растворения, доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают.
Раствор 2. В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,9475 г 12-водного двузамещенного фосфорнокислого натрия, затем прибавляют дистиллированную воду, перемешивают содержимое до полного растворения, доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают.
Для приготовления буферного раствора в колбу вместимостью 100 см3 вносят 94,8 см3 раствора 1 и 5,2 см3 раствора 2 и тщательно перемешивают.
Измеряют значение pH буферного раствора на pH-метре. В случае отклонения измеренного значения от заданного (5,6 +/- 0,1) ед. pH значение pH доводят добавлением раствора 1 или раствора 2.
Раствор используют свежеприготовленным.
8.2.1.2 Приготовление элюента 2
В колбу вместимостью 50 см3 вносят пипетками 8 см3 дистиллированной воды, 4 см3 соляной кислоты и 1 см3 муравьиной кислоты. Колбу закрывают стеклянной пробкой и тщательно перемешивают.
Раствор используют свежеприготовленным.
8.2.2 Приготовление растворов контрольных образцов красителей
В каждый стакан вносят по 0,2500 г одного из КО карминовой кислоты или 4-аминокарминовой кислоты, затем добавляют пипеткой по 5 см3 дистиллированной воды и перемешивают содержимое стакана стеклянной палочкой до полного растворения красителя.
Раствор используют свежеприготовленным.
8.2.3 Приготовление раствора анализируемого красителя
В стакан вместимостью 50 см3 вносят 0,2500 г анализируемого образца красителя, затем добавляют пипеткой 5 см3 дистиллированной воды и перемешивают содержимое стакана стеклянной палочкой до полного растворения красителя.
Раствор используют свежеприготовленным.
8.2.4 Подготовка пластины для тонкослойной хроматографии
На хроматографическую пластину карандашом наносят линию старта на расстоянии 1 см от нижнего края пластины и линию границы элюента — на расстоянии 15 см от линии старта (параллельно рискам на обратной стороне пластины). На линию старта стеклянным микрокапилляром точечно наносят в несколько приемов с промежуточным подсушиванием на воздухе растворы КО, приготовленные по 8.2.2, и раствор анализируемого красителя, приготовленный по 8.2.3, с расстоянием между точками не менее 2 см. Оптимальный диаметр пятен нанесенных проб должен быть 3 — 5 мм. Затем пластину подсушивают на воздухе до полного испарения растворителя.
8.2.5 Подготовка хроматографической камеры
В хроматографическую камеру вносят элюент, приготовленный по 8.2.1.1 или по 8.2.1.2, в количестве, необходимом для погружения хроматографической пластины на глубину не более 0,5 см от нижнего края пластины. Камеру плотно закрывают и выдерживают в течение 1 ч.
8.3 Проведение анализа
Хроматографическую пластину, подготовленную по 8.2.4, пинцетом помещают в хроматографическую камеру, подготовленную по 8.2.5, под углом примерно 45°. Камеру плотно закрывают. Элюирование заканчивают, когда элюент поднимется до линии границы элюента (на 15 см выше линии старта). По окончании элюирования хроматограмму вынимают пинцетом из хроматографической камеры и сушат на воздухе до полного испарения растворителя. Затем визуально осматривают пятно анализируемого красителя и идентифицируют его по цвету и значению Rf, сравнивая с пятном КО. Ориентировочные значения R\prime_{f} пятна контрольного красителя приведены в таблице 2.
| Элюент | R\prime_{f} пятна | |
| Кармины E120 | 4-аминокарминовая кислота | |
| 1 | 0,95 +/- 0,02 | 0,26 +/- 0,02 |
| 2 | 0,20 +/- 0,03 | 0,53 +/- 0,03 |
При выполнении условий идентичности цвета и Rf пятна анализируемого красителя с цветом и R\prime_{f} пятен контрольных красителей идентифицируют красящее вещество и делают заключение о соответствии/несоответствии анализируемого образца требованиям, установленным для красителя кармины E120. При обнаружении на хроматограмме анализируемого красителя пятна(ен), Rf которого(ых) не соответствует R\prime_{f} пятна контрольного красителя кармины E120, идентификацию и определение массовой доли основного красящего вещества анализируемого красителя проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием в соответствии с разделом 11.
9 Спектрофотометрический метод определения (идентификации) основного красящего вещества красителя
9.1 Сущность метода
Метод основан на определении положения максимумов светопоглощения и соответствующих им значений оптических плотностей, полученных при измерении спектра раствора красителя, спектрофотометрическим методом.
9.2 Подготовка к проведению анализа
9.2.1 Приготовление раствора соляной кислоты молярной концентрации c (HCl) = 2,0 моль/дм3 (2,0 М)
В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 18,0 см3 соляной кислоты, затем прибавляют дистиллированную воду, доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают.
Раствор используют свежеприготовленным.
9.2.2 Приготовление раствора аммиака с pH раствора, равным 9,5 ед. pH
Готовят водный раствор аммиака массовой долей 10% по ГОСТ 4517.
Раствор хранят в плотно закрытой полимерной емкости в условиях в соответствии с разделом 5 не более 1 мес.
Отбирают пипеткой 10 см3 приготовленного раствора, дозируют его в мерную колбу вместимостью 500 см3, доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают.
Раствор хранят в плотно закрытой полимерной емкости в условиях в соответствии с разделом 5 не более 1 мес.
Затем отбирают пипеткой 10 см3 приготовленного раствора, дозируют его в мерную колбу вместимостью 1000 см3, доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают.
Измеряют значение pH полученного раствора на pH-метре. В случае отклонения измеренного значения от заданного [(9,50 +/- 0,02) ед. pH] значение pH доводят добавлением водного раствора аммиака массовой долей 10%.
Раствор используют свежеприготовленным.
9.2.3 Приготовление раствора красителя в соляной кислоте
В стаканчик для взвешивания вносят 0,100 г анализируемого красителя. В стакан вместимостью 50 см3 вносят 30 см3 соляной кислоты, приготовленной по 9.2.1, подогревают до кипения на плитке и немедленно вносят в стаканчик с анализируемым красителем, перемешивают раствор до полного растворения красителя и охлаждают. Затем количественно переносят полученный раствор в мерную колбу вместимостью 1 дм3 и доводят объем раствора в колбе до метки дистиллированной водой, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают.
Раствор используют свежеприготовленным.
9.2.4 Приготовление раствора красителя в водном растворе аммиака
В мерную колбу вместимостью 1 дм3 вносят 0,100 г анализируемого красителя, добавляют водный раствор аммиака с pH раствора, равным 9,5 ед. pH, приготовленный по 9.2.2, перемешивают до полного растворения красителя, доводят объем раствора в колбе до метки тем же раствором, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают.
Раствор используют свежеприготовленным.
9.3 Проведение анализа
Раствор анализируемого красителя, приготовленный по 9.2.3 или 9.2.4, дозируют пипеткой в кювету и регистрируют спектр поглощения относительно оптической плотности растворителя в диапазоне длин волн от 300 до 900 нм в соответствии с инструкцией по эксплуатации спектрофотометра.
При совпадении положения максимумов светопоглощения анализируемого красителя с положением максимумов светопоглощения контрольных красителей, указанных в таблице 3, идентифицируют красящее вещество и делают заключение о соответствии/несоответствии анализируемого образца требованиям, установленным для красителя кармины E120.
При несовпадении максимумов светопоглощения анализируемого красителя с положением максимумов светопоглощения контрольного красителя кармины E120 идентификацию и определение массовой доли основного красящего вещества анализируемого красителя проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием в соответствии с разделом 11.
10 Спектрофотометрический метод измерения массовой доли основного красящего вещества красителя
10.1 Сущность метода
Метод основан на определении массовой доли основного красящего вещества красителя (карминовой кислоты) по измерению интенсивности окраски его раствора спектрофотометрическим методом при длине волны, соответствующей характеристическому максимуму светопоглощения.
10.2 Подготовка к проведению измерения — по 9.2.
10.3 Проведение измерения
Кювету спектрофотометра заполняют приготовленным по 9.2.3 или 9.2.4 раствором анализируемого красителя и измеряют оптическую плотность, соответствующую максимуму светопоглощения для каждого красителя относительно оптической плотности соответствующего растворителя, указанного в таблице 3 в соответствии с инструкцией по эксплуатации спектрофотометра.
Значения измеренной оптической плотности должны находиться в диапазоне измерения оптической плотности от 0,650 до 0,750 ед. опт. пл. при длинах волн, указанных в таблице 3. Если измеренная оптическая плотность выходит за пределы диапазона от 0,650 до 0,750 ед. опт. пл., необходимо приготовить раствор красителя, увеличив или уменьшив массу навески образца.
10.4 Обработка результатов измерения
Массовую долю основного красящего вещества в анализируемом красителе X, %, рассчитывают по формуле
X = \frac{A \cdot M}{E_{1\text{см}}^{1\%} \cdot d \cdot m} , (1)
где A — оптическая плотность раствора анализируемого красителя, измеренная по 10.3, ед. опт. пл.;
M — масса раствора анализируемого красителя, рассчитанная по формуле
где V — объем раствора анализируемого красителя, см3; V = 1000 см3;
\rho — плотность раствора анализируемого красителя по 9.2.3 или 9.2.4, численно равная 1,00 г/см3;
E_{1\text{см}}^{1\%} — удельный коэффициент светопоглощения, численно равный оптической плотности раствора красителя, с массовой долей красящего вещества 1% при толщине поглощающего слоя 1 см, ед. опт. пл.·%-1·см-1, численные значения которого указаны в таблице 3;
d — толщина поглощающего слоя, см; d = 1 см;
m — масса пробы анализируемого красителя, взятой для анализа, г, по 9.2.3 или 9.2.4; m = 0,100 г.
Вычисления проводят с записью результата до второго десятичного знака.
За окончательный результат анализа принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений \overline{X} , %, округленное до первого десятичного знака, если выполняются условия приемлемости, по 10.5.
10.5 Метрологические характеристики метода
10.5.1 Абсолютное значение разности между результатами двух параллельных определений, полученными в условиях повторяемости при доверительной вероятности P = 95%, не должно превышать предела повторяемости r, представленного во второй графе таблицы 4.
10.5.2 Абсолютное значение разности между результатами двух параллельных определений, полученными в условиях воспроизводимости при доверительной вероятности P = 95%, не должно превышать предела воспроизводимости R, представленного в третьей графе таблицы 4.
10.5.3 Границы абсолютной погрешности определения массовой доли основного красящего вещества в анализируемом красителе \Delta при доверительной вероятности P = 95% представлены в таблице 4.
10.6 Оформление результатов
Результат определения массовой доли основного красящего вещества в пищевом красителе кармины E120 представляют в виде
(\overline{X} \pm \Delta)\%\text{при }P = 95\% .
11 Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии с диодно-матричным и масс-спектрометрическим детектированием для определения (идентификации) и измерения массовой доли красящих веществ красителя
11.1 Сущность метода
Метод основан на разделении красящих веществ красителя в хроматографической колонке, заполненной обращенно-фазовым сорбентом в режиме градиентного элюирования, диодно-матричном детектировании при длине волны 494 нм, определении массовой доли красящего вещества с использованием метода внешнего стандарта и построения градуировочной зависимости массовой концентрации красителя от площади хроматографического пика, регистрации масс-спектров молекулярных и дочерних ионов для подтверждения состава красителя.
11.2 Подготовка к проведению анализа
11.2.1 Подготовка лабораторной посуды
Чистую стеклянную посуду однократно промывают этилацетатом, затем дважды ацетоном, после чего высушивают.
11.2.2 Приготовление подвижной фазы (элюента)
Раствор А. В мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят около 500 см3 ацетонитрила и добавляют пипеткой 1 см3 муравьиной кислоты, перемешивают содержимое, доводят объем раствора до метки ацетонитрилом, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают.
Раствор хранят в плотно закрытой емкости в условиях в соответствии с разделом 5 не более 3 мес.
Раствор Б. В мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят около 500 см3 деионизированной воды с удельной электрической проводимостью при температуре 25 °C не более 0,010 мСм/м и добавляют пипеткой 1 см3 муравьиной кислоты, перемешивают содержимое, доводят объем раствора до метки деионизированной водой, закрывают колбу пробкой и тщательно перемешивают.
Раствор хранят в плотно закрытой емкости в условиях в соответствии с разделом 5 не более 1 мес.
11.2.3 Приготовление градуировочных растворов красителей
11.2.3.1 Приготовление исходных растворов красителей C0 с массовой концентрацией 1000 мкг/см3
В каждую мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят пробу контрольного красителя (карминовой кислоты или 4-аминокарминовой кислоты) массой, рассчитанной по формуле (3), прибавляют пипеткой в каждую мерную колбу по 8 см3 деионизированной воды с удельной электрической проводимостью при температуре 25 °C не более 0,010 мСм/м, перемешивают содержимое на вибрационном шейкере до полной растворимости. При необходимости колбы с растворами помещают в ультразвуковую баню и выдерживают до полного растворения красителя. Затем доводят объем раствора в каждой колбе до метки деионизированной водой с удельной электрической проводимостью при температуре 25 °C не более 0,010 мСм/м, закрывают пробкой и перемешивают. Растворы фильтруют через мембранные фильтры в виалы (флаконы) и закрывают их крышками.
Необходимую массу i-го вещества mi, мг, каждого красителя рассчитывают с точностью до первого десятичного знака, с учетом содержания основного вещества, по формуле
m_{i} = \frac{C_{0} \cdot V}{X_{1i}} \cdot 100 , (3)
где C0 — концентрация исходного раствора, мкг/см3;
X1i — массовая доля основного вещества красителя, %.
Исходные растворы хранят при температуре от 2 °C до 8 °C не более 1 мес.
11.2.3.2 Приготовление рабочих растворов красителей
Раствор 1. В виалу вместимостью не менее 10 см3 вносят по 5,0 см3 исходных растворов карминовой кислоты и 4-аминокарминовой кислоты, приготовленных по 11.2.3.1, закрывают пробкой и перемешивают на вибрационном шейкере.
Раствор хранят при температуре от 2 °C до 8 °C не более 2 недель.
Раствор 2. В мерную колбу вместимостью 10 см3 вносят по 1,0 см3 исходных растворов карминовой кислоты и 4-аминокарминовой кислоты, приготовленных по 11.2.3.1, доводят объем раствора до метки деионизированной водой и перемешивают на вибрационном шейкере.
Раствор хранят при температуре от 2 °C до 8 °C не более 2 недель.
11.2.3.3 Приготовление градуировочных растворов красителей
В каждую хроматографическую виалу вносят рабочие растворы красителей по 11.2.3.2 и деионизированную воду с удельной электрической проводимостью при температуре 25 °C не более 0,010 мСм/м в соответствии с объемами, указанными в таблице 5. Затем виалы с полученными растворами помещают в вибрационный встряхиватель (шейкер) и перемешивают.
Градуировочные растворы красителей хранят при температуре от 2 °C до 8 °C не более 72 ч.
11.2.4 Приготовление растворов анализируемых красителей
Раствор карминовой кислоты. В мерную колбу вместимостью 1 дм3 вносят 0,100 г анализируемого красителя, добавляют 500 см3 деионизированной воды с удельной электрической проводимостью при температуре 25 °C не более 0,010 мСм/м и перемешивают до полного растворения красителя. При необходимости помещают колбу в ультразвуковую баню и выдерживают в ней до полного растворения красителя. Затем доводят объем раствора в колбе до метки деионизированной водой с удельной электрической проводимостью при температуре 25 °C не более 0,010 мСм/м, закрывают колбу пробкой и перемешивают. Непосредственно перед анализом раствор фильтруют через политетрафторэтиленовый мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.
Раствор кармина готовят по 9.2.3. Непосредственно перед анализом полученный раствор фильтруют через политетрафторэтиленовый мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.
Допускается уменьшить или увеличить объем раствора и массу анализируемого красителя в зависимости от содержания в нем основных красящих веществ.
11.2.5 Подготовка хроматографа к работе
Включение и подготовку хроматографа к работе, вывод его на режим, кондиционирование колонки и выключение по окончании работы выполняют в соответствии с руководством (инструкцией) по эксплуатации. Перед проведением измерений хроматографическую систему кондиционируют подвижной фазой до установления стабильной базовой линии и давления в системе.
Условия хроматографического анализа выбирают с учетом характеристик используемой колонки и хроматографа.
11.2.6 Условия проведения хроматографического анализа:
- температура термостата колонки — (25 +/- 5) °C;
- температура в отсеке устройства ввода проб — 10 °C;
- объем вводимой пробы — от 0,002 см3 до 0,01 см3;
- скорость потока подвижной фазы — 0,7 см3/мин;
- режим элюирования — градиентный в соответствии с таблицей 6.
| Время, мин | Подвижная фаза А, % | Подвижная фаза Б, % |
|---|---|---|
| 0,00 | 2,0 | 98,0 |
| 1,00 | 2,0 | 98,0 |
| 20,00 | 35,0 | 65,0 |
| 30,00 | 2,0 | 98,0 |
| 35,00 | 2,0 | 98,0 |
11.2.7 Параметры диодно-матричного детектора:
11.2.8 Параметры масс-спектрометрического детектора
Настройки масс-спектрометрического детектора (источника ионов, ионной оптики) устанавливают при постановке метода на каждой единице оборудования путем прямого ввода анализируемых веществ в масс-спектрометр и установления оптимальных характеристик согласно рекомендациям производителя масс-спектрометра.
Параметры масс-детектирования указаны в таблице 7.
| Наименование красителя | Время удерживания, мин | Фрагментор | Молекулярный ион, m/z | Основные дочерние ионы, m/z | |
| Карминовая кислота | 15,5 | 200 | 491,20 | 447,10 | 472,10 |
| 4-аминокарминовая кислота | 17,3 | 210 | 490,10 | 447,10 | 472,10 |
Параметры настройки масс-спектрометрического детектора:
- напряжение на распыляющем капилляре — 4000 В;
- давление азота в распылителе — 35 psig;
- скорость газа осушения — 12 дм3/мин;
- температура газа осушения — 350 °C.
Параметры хроматографического разделения и масс-спектрометрического детектирования могут изменяться в зависимости от используемой аппаратуры.
11.3 Установление градуировочной характеристики
Для определения рабочего диапазона массовых концентраций и линейности функции градуировки выполняют начальную градуировку хроматографа. Градуировку выполняют как минимум по шести рабочим градуировочным растворам красителей, приготовленным по 11.2.3. Каждый раствор анализируют не менее двух раз в условиях, описанных в 11.2.7 и 11.2.8.
Параметры градуировочной зависимости вычисляют путем анализа линейной регрессии скорректированных площадей пиков с использованием программного обеспечения хроматографической системы. При построении градуировочной характеристики используют линейную регрессию вида y = ax, при этом коэффициент корреляции должен быть не менее 0,999.
Градуировку проводят при смене оборудования, колонок, условий хроматографического анализа или при выявлении несоответствий при оперативном контроле стабильности градуировки.
Детектирование красителей и установление градуировочной характеристики проводят с использованием диодно-матричного детектора.
11.4 Контроль стабильности градуировочной характеристики
Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят перед началом работы. Для этого анализируют один рабочий градуировочный раствор, значение массовой концентрации которого должно находиться в пределах от 60% до 80% рабочего диапазона градуировочной зависимости.
Градуировочную характеристику считают стабильной при выполнении следующего условия:
K_{k} = |X - C| \leq \sigma_{R} , (4)
где X — результат контрольного измерения градуировочного раствора;
C — массовая концентрация красителя в контрольном градуировочном растворе;
\sigma_{R} — значение показателя воспроизводимости в соответствии с таблицей 8.
Если это условие стабильности не выполняется, то проводят повторную градуировку прибора.
11.5 Контроль чистоты системы
Для контроля степени чистоты реактивов и правильности работы оборудования, а также для предотвращения появления ложноположительных пиков проводят измерение «холостой пробы» — деионизированной воды, используемой для приготовления растворов рабочих проб. Если в «холостой пробе» обнаруживают любое из анализируемых веществ, то выявляют причину и устраняют любые источники загрязнения. Контроль чистоты системы проводят перед и после проведения измерения.
11.6 Проведение измерения
Проводят измерение двух параллельных проб, подготовленных по 11.2.4. Хроматографический анализ каждой пробы проводят не менее двух раз в условиях, в которых были зарегистрированы хроматограммы градуировочных растворов. Пики красителей на полученных хроматограммах должны быть правильно проинтегрированы, при необходимости результаты интегрирования площадей пиков корректируют. В соответствии с данными, полученными при анализе градуировочных растворов, проводят обработку хроматограмм с использованием программного обеспечения, получая значения массовой концентрации красителей в анализируемой пробе. Если вычисленная массовая концентрация красителя в анализируемой пробе превышает градуировочный диапазон, то пробу разбавляют и повторяют измерение.
Результат идентификации красителя подтверждают сравнением характеристик масс-спектров анализируемого красителя с масс-спектрами контрольного красителя, полученными для градуировочного раствора, указанными в таблице 7.
11.7 Обработка результатов измерения
Массовую долю i-го красителя Xi, %, вычисляют по формуле
X_{i} = \frac{C_{i} \cdot V \cdot Q}{m \cdot 10000} , (5)
где Ci — массовая концентрация карминовой кислоты в анализируемом красителе, найденная по градуировочному графику, мкг/см3;
V — объем раствора пробы; см3;
Q — фактор разведения раствора пробы;
10 000 — коэффициент пересчета.
Вычисления проводят с записью результата до второго десятичного знака.
Окончательный результат записывают с точностью до первого десятичного знака.
11.8 Метрологические характеристики метода
За окончательный результат определения массовой доли красителя принимают среднеарифметическое значение результатов вычислений двух параллельных измерений X1 и X2, полученных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости
|X_{1} - X_{2}| \leq 0,01 \cdot r \cdot \overline{X} , (6)
где \overline{X} — среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений массовой доли красителя;
r — значение предела повторяемости, %;
При невыполнении условия (6) повторяют измерения и затем используют методы проверки приемлемости четырех результатов параллельных измерений. При повторном превышении указанного предела выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, их устраняют и измерение повторяют.
Если величина Xi оказывается меньше предела измерения метода XLOQ, то вычисления результата не проводят, а дают одностороннюю оценку массовой концентрации красителя в пробе Xi, %, в виде Xi < XLOQ, где XLOQ — предел измерения метода. Предел измерения метода составляет 0,1%.
Окончательный результат определения массовой доли красителей при доверительной вероятности P = 0,95 представляют в виде
\overline{X_{i}} \pm 0,01 \cdot U_{i} \cdot \overline{X_{i}} , (7)
где \overline{X_{i}} — среднее арифметическое значение вычислений двух параллельных определений массовой доли i-го красителя в пробе по 11.6, %;
Ui — значение относительной расширенной неопределенности содержания i-го красителя, %;
Числовое значение результата измерений должно оканчиваться цифрой того же разряда, что и значение расширенной неопределенности, выраженное в процентах.
Установленный в настоящем стандарте метод обеспечивает выполнение измерений содержания красителей с относительной расширенной неопределенностью результатов измерений при коэффициенте охвата k = 2 и доверительной вероятности P = 0,95, указанной в таблице 8.
12 Контроль качества результатов измерений
Контроль качества результатов измерений в лаборатории предусматривает проведение контроля стабильности результатов измерений с учетом требований ГОСТ ИСО 5725-6-2003 (раздел 6).
Периодичность контроля и процедуры контроля стабильности результатов измерений регламентируют в руководстве по качеству лаборатории в соответствии с ГОСТ ISO/IEC 17025.
ИНФОРМАЦИЯ О ПРИМЕНЯЕМЫХ НОРМАТИВНЫХ ПРАВОВЫХ АКТАХ В ГОСУДАРСТВАХ — УЧАСТНИКАХ СНГ
| Структурный элемент | Нормативный правовой акт | Государство — участник СНГ |
|---|---|---|
| 3.1 | Технический регламент Таможенного союза ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» | AM, BY, KZ, KG, RU |
| 3.1 | Технический регламент Таможенного союза ТР ТС 029/2012 «Требования безопасности пищевых добавок, ароматизаторов и технологических вспомогательных средств» | AM, BY, KZ, KG, RU |