ГОСТ 33634-2015. Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые, продовольственное сырье. Иммуноферментный метод определения остаточного содержания антибиотиков фторхинолонового ряда
(введен в действие Приказом Росстандарта от 18.01.2016 № 6-ст)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Евразийского экономического союза «О безопасности мяса птицы и продукции его переработки» (ТР ЕАЭС 051/2021) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 29.11.2022 № 188). Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов (п. п. 61(14), 61(54)), а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 24.12.2019 № 236). Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности мяса и мясной продукции» (ТР ТС 034/2013) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 19.11.2019 № 198). Текст данного документа приведен с учетом поправок, опубликованных в «ИУС», № 10, 2018; № 2, 2020. Документ введен в действие с 01.01.2017.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 18 января 2016 г. № 6-ст
ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ, ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЕ СЫРЬЕ
ИММУНОФЕРМЕНТНЫЙ МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ОСТАТОЧНОГО СОДЕРЖАНИЯ АНТИБИОТИКОВ ФТОРХИНОЛОНОВОГО РЯДА
Food products, food raw materials. Immunoenzymatic method for determination of fluoroquinolones residual content
67.100
67.120
Дата введения 1 января 2017 года
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»
1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт)
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 27 октября 2015 г. № 81-П)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 18 января 2016 г. № 6-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 33634-2015 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2017 г.
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет
Настоящий стандарт распространяется на мясо, мясо птицы, яйца, яичный меланж, яичный порошок, молоко и устанавливает иммуноферментный метод определения остаточного содержания антибиотиков фторхинолонового ряда (энрофлоксацина, ципрофлоксацина, норфлоксацина и офлоксацина) в диапазоне измерений от 5 до 1280 мкг/кг.
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019-79 <1> Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
<1> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009 «Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».
ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 245-76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый однозамещенный 2-водный. Технические условия
ГОСТ 334-73 Бумага масштабно-координатная. Технические условия
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 2652-78 Реактивы. Калия бихромат технический. Технические условия
ГОСТ 4172-76 Реактивы. Натрий фосфорнокислый двузамещенный 12-водный. Технические условия
ГОСТ 4204-77 Реактивы. Кислота серная. Технические условия
ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия
ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ ИСО 5725-6-2003 <2> Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике
<2> В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике».
ГОСТ 6552-80 Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 7269-79 Мясо. Методы отбора образцов и органолептические методы определения свежести
ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 26809-86 Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу
ГОСТ 29245-91 Консервы молочные. Методы определения физических и органолептических показателей
ГОСТ 31467-2012 Мясо птицы, субпродукты и полуфабрикаты из мяса птицы. Методы отбора проб и подготовка их к испытаниям
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю «Национальные стандарты», составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3 Термины, определения и сокращения
3.1 В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1.1 тест-система: Набор (комплект) специально подобранных реагентов (реактивов) и составных частей, предназначенный для определения одного или нескольких конкретных веществ.
3.1.2 вспомогательный раствор: Раствор, приготовляемый заблаговременно и необходимый для приготовления других типов растворов.
3.1.3 рабочий раствор: Раствор одного или нескольких реактивов, приготовляемый непосредственно перед использованием и необходимый для выполнения процедуры анализа.
3.2 В настоящем стандарте применены следующие сокращения:
ИФА — иммуноферментный анализ;
4.1 Иммуноферментный метод основан на измерении содержания фторхинолонов в растворах экстрактов исследуемых проб с помощью непрямого твердофазного конкурентного ИФА.
4.2 Непрямой твердофазный конкурентный ИФА основан на способности антибиотиков фторхинолонового ряда взаимодействовать со специфичными АТ, полученными к энрофлоксацину, в условиях конкуренции с белковым конъюгатом энрофлоксацина, нанесенным на поверхность лунок планшета, — твердофазным АГ.
4.3 Связавшиеся с твердой фазой АТ взаимодействуют с вторичными антивидовыми АТ, меченными пероксидазой хрена, которые выявляют путем измерения интенсивности окрашивания продукта реакции окисления 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (раствор № 11, см. приложение А) перекисью водорода.
Аналитический сигнал (регистрируемое значение ОП), характеризующий степень взаимодействия АТ с АГ, обратно пропорционален массовой концентрации фторхинолонов в исследуемом растворе.
5 Метрологические характеристики
5.1 Установленный в настоящем стандарте метод обеспечивает определение содержания антибиотиков фторхинолонового ряда с расширенной неопределенностью результатов аналитических измерений при коэффициенте охвата k = 2, указанной в таблице 1.
Метрологические характеристики
5.2 Специфичность АТ, применяемых для определения содержания фторхинолонов, выраженная в коэффициентах перекрестного реагирования, представлена в таблице 2.
Специфичность АТ, применяемых для определения массовой концентрации фторхинолонов
| Фторхинолон | Коэффициент перекрестного реагирования, % |
|---|---|
| Энрофлоксацин | 100 |
| Ципрофлоксацин | 100 |
| Норфлоксацин | 60 |
| Офлоксацин | 20 |
6 Требования безопасности и условия выполнения измерений
6.1 При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.
6.2 Помещения, в которых проводится анализ и подготовка проб, должны быть оборудованы приточно-вытяжной вентиляцией, и соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и электробезопасности по ГОСТ 12.1.019.
6.3 К выполнению измерений допускаются лица, владеющие техникой ИФА и изучившие инструкцию по применению тест-системы и инструкции по эксплуатации используемых приборов.
6.4 При выполнении измерений соблюдают следующие условия:
7 Средства измерений, аппаратура, материалы, посуда и реактивы
7.1 При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, аппаратуру, материалы и посуду:
- весы неавтоматического действия высокого класса точности по ГОСТ OIML R 76-1 с пределом допускаемой абсолютной погрешности +/- 0,05 г;
- весы аналитические с пределом допускаемой абсолютной погрешности не более +/- 0,1 мг;
- калькулятор любого типа с логарифмической функцией;
- pH-метр любой марки, позволяющий проводить измерения в диапазоне от 3 до 10 ед. pH с погрешностью +/- 0,05 ед. pH;
- фотометр вертикального типа фотометрирования с диапазоном измерений ОП от 0 до 3 в комплекте с интерференционными светофильтрами для длин волн 450 и 620 нм;
- измельчитель-гомогенизатор лабораторный;
- морозильную камеру любого типа, обеспечивающую среднюю температуру в холодильной камере не выше минус 20 °C;
- роторный испаритель любого типа или устройство для испарения экстрактов, термостатируемый нагревательный модуль с системой отдувки растворителей инертным газом;
- термостат любого типа, поддерживающий температуру (37 +/- 1) °C;
- холодильник бытовой с цифровым контроллером температуры и рабочим диапазоном температур от 0 °C до 8 °C;
- центрифугу с бакет-ротором и адаптером для пробирок вместимостью 15 см3, частотой вращения не менее 4000 об/мин;
- шейкер вортексного типа, с вставкой для одной пробирки и диапазоном скорости от 150 до 2500 об/мин;
- шейкер переворачивающий вертикального вращения 360° в одной плоскости с адаптером для пробирок и диапазоном скорости от 20 до 100 об/мин;
- шкаф сушильный любого типа, обеспечивающий поддержание температуры не менее (95 +/- 5) °C;
- бумагу масштабно-координатную по ГОСТ 334, марки Н-1;
- бумагу фильтровальную по ГОСТ 12026;
- колбы 1-10(100, 1000)-2 по ГОСТ 1770;
- колбу типа Кн-1-50-24/29 ТС по ГОСТ 25336;
- пипетки многоканальные переменной вместимости 0,03 — 0,3 см3, с допустимой относительной погрешностью дозирования по метанолу и ацетонитрилу не более +/- 1,0%;
- пипетки одноканальные переменной вместимости 20 — 100 мм3, 200 — 1000 мм3, 500 — 5000 мм3 с допустимой относительной погрешностью дозирования по метанолу и ацетонитрилу не более +/- 1%;
- пробирки полипропиленовые вместимостью 15 см3 с завинчивающимися крышками;
- пробирки типа П-1-10-0,1 ХС по ГОСТ 25336;
- пробирки типа «Эппендорф» вместимостью 1,5 см3;
- цилиндры 1(2,3)-100(250)-1 по ГОСТ 1770.
7.2 При выполнении измерений применяют следующие реактивы:
- ацетонитрил для хроматографии, о.с.ч., с массовой долей основного вещества не менее 99,9%;
- воду дистиллированную по ГОСТ 6709;
- гексан с содержанием основного вещества не менее 98%, х.ч.;
- дихлорметан для газовой хроматографии с массовой долей основного вещества не менее 99,9%;
- калия бихромат по ГОСТ 2652;
- кислоту ортофосфорную по ГОСТ 6552, концентрированную, х.ч.;
- кислоту серную по ГОСТ 4204, концентрированную;
- натрия гидроксид по ГОСТ 4328, х.ч.;
- натрия гидрофосфат безводный, х.ч., по ГОСТ 4172;
- натрия дигидрофосфат 2-водный, ч.д.а., по ГОСТ 245;
- натрий хлористый по ГОСТ 4233, х.ч.;
- тест-систему для непрямого твердофазного конкурентного ИФА, укомплектованную в соответствии с приложением А.
8 Подготовка к выполнению измерений
8.1 Подготовка оборудования
8.1.1 При подготовке к проведению измерений лабораторную стеклянную посуду моют смесью водного раствора бихромата калия с концентрированной серной кислотой, многократно промывают водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и высушивают в сушильном шкафу.
8.1.2 Подготовку и проверку фотометра, pH-метра проводят в соответствии с руководствами по эксплуатации приборов.
8.2 Приготовление растворов
8.2.1 Приготовление раствора фосфорной кислоты молярной концентрацией 1 моль/дм3
В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 50 см3 дистиллированной воды и осторожно приливают 12 см3 концентрированной фосфорной кислоты, доводят объем раствора дистиллированной водой до метки, закрывают пробкой и тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора в вытяжном шкафу при комнатной температуре — не более 1 мес.
8.2.2 Приготовление фосфатного буферного раствора молярной концентрацией 0,067 моль/дм3 и pH 7,2
В мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят 7,67 г безводного гидрофосфата натрия, 2,02 г 2-водного дигидрофосфата натрия и 8,7 г хлорида натрия, растворяют в 500 см3 дистиллированной воды. Измеряют pH, устанавливают его значение до 7,2 +/- 0,2, осторожно по каплям прибавляя раствор фосфорной кислоты (см. 8.2.1) и постоянно перемешивая. Затем объем в колбе доводят до метки дистиллированной водой.
Срок хранения раствора при температуре 4 °C — не более 1 мес.
8.2.3 Приготовление раствора гидроксида натрия молярной концентрацией 0,1 моль/дм3
В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,4 г гидроксида натрия, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, перемешивают и доводят до метки дистиллированной водой.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 1 мес.
8.2.4 Приготовление рабочего буферного раствора
В мерную колбу вместимостью 10 см3 приливают до метки раствор № 10 (см. приложение А), добавляют 28 мм3 раствора № 13 (см. приложение А), перемешивают и закрывают притертой пробкой.
Используют свежеприготовленный раствор.
8.2.5 Приготовление смеси ацетонитрила и раствора гидроксида натрия молярной концентрацией 0,1 моль/дм3
В мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 90 см3 ацетонитрила и доводят до метки раствором гидроксида натрия (см. 8.2.3). Колбу закрывают пробкой и тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре в вытяжном шкафу — 2 сут.
8.2.6 Приготовление рабочих градуировочных растворов К0 — К5
Для приготовления рабочего разведения градуировочных растворов К0 — К5 в пробирки типа «Эппендорф», маркированные К0, К1, К2, К3, К4 и К5, вносят по 0,27 см3 рабочего буферного раствора (см. 8.2.4) и по 0,03 см3 реактивов № 3 — № 8 (см. приложение А), соответственно маркировке. Перемешивают, в результате получают растворы со следующими концентрациями энрофлоксацина: К0 — 0 мкг/см3; К1 — 0,5 мкг/см3; К2 — 2,0 мкг/см3; К3 — 8,0 мкг/см3; К4 — 32,0 мкг/см3; К5 — 128,0 мкг/см3.
Используют свежеприготовленные растворы.
Концентрированные градуировочные растворы после вскрытия флаконов хранят при температуре от 2 °C до 8 °C в течение всего срока годности набора.
8.2.7 Приготовление рабочего раствора буфера для промывки
В колбу вместимостью 50 см3 вносят 47,5 см3 дистиллированной воды, добавляют 2,5 см3 реактива № 2 (см. приложение А), перемешивают.
Срок хранения раствора при температуре от 2 °C до 8 °C не более — 1 мес.
8.2.8 Приготовление рабочего раствора ферментного конъюгата
В стеклянную пробирку вносят 2,25 см3 реактива № 10 (см. приложение А) и 0,25 см3 реактива № 9 (см. приложение А), перемешивают.
Используют свежеприготовленный раствор.
8.3 Отбор проб
8.3.1 Отбор проб мяса и мясных продуктов — по ГОСТ 7269.
8.3.2 Отбор проб мяса птицы — по ГОСТ 31467.
8.3.3 Отбор проб молока — по ГОСТ 26809.
8.3.4 Отбор проб яиц, яичного меланжа и яичного порошка проводят по нормативным документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.
8.3.5 Срок хранения отобранных проб при температуре от 2 °C до 8 °C — 2 сут. При отсутствии возможности исследования проб в течение двух суток они должны быть заморожены при температуре минус 20 °C со сроком хранения не более двух месяцев.
8.4 Подготовка проб
8.4.1 Подготовка проб мяса, мяса птицы, яиц, яичного меланжа, яичного порошка
Яйца отделяют от скорлупы и перемешивают на гомогенизаторе. Яичный меланж, яичный порошок тщательно перемешивают.
Мышечную ткань предварительно очищают от жира, грубой соединительной ткани и измельчают на гомогенизаторе. Далее обработку пробы проводят в соответствии с рисунком 1.
| 2,00 г гомогенизированной пробы помещают в полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см3. Вносят 8 см3 смеси ацетонитрила и раствора натрия гидроксида (см. 8.2.5), перемешивают в течение 2 мин на шейкере вортексного типа, после чего перемешивают на переворачивающем шейкере в течение 10 мин |
|---|
 |
| Центрифугируют при 4000 об/мин в течение 10 мин при температуре 15 °C |
 |
| 3 см3 надосадочной жидкости переносят в новую полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см3, добавляют 3,0 см3 фосфатного буферного раствора (см. 8.2.2) и 6 см3 дихлорметана. Перемешивают на переворачивающем шейкере в течение 10 мин |
 |
| Центрифугируют при 4000 об/мин в течение 10 мин при температуре 15 °C |
 |
| Удаляют верхний водный слой и промежуточную фазу. Переносят 3 см3 нижнего органического слоя в новую полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см3 и упаривают досуха в токе азота в системе упаривания при температуре 50 °C |
 |
| К сухому остатку добавляют 0,3 см3 раствора № 3 (см. приложение А) и тщательно перемешивают на шейкере вортексного типа до полного растворения |
 |
| Полученный экстракт обезжиривают. Для этого приливают 0,3 см3 гексана и центрифугируют при 4000 об/мин в течение 10 мин при температуре 15 °C. Удаляют верхний гексановый слой. Процедуру обезжиривания повторяют еще раз |
 |
| В пробирку типа «Эппендорф» отбирают 0,03 см3 обезжиренного экстракта, добавляют 0,27 см3 рабочего буферного раствора (см. 8.2.4), перемешивают и используют для проведении ИФА в соответствии с разделом 9 |
Рисунок 1 — Обработка испытуемых проб
8.4.2 Подготовка проб молока
Отобранную пробу молока перед анализом тщательно перемешивают.
В полипропиленовую пробирку вместимостью 15 см3 вносят 2 см3 пробы, 8 см3 смеси ацетонитрила и раствора натрия гидроксида (см. 8.2.5), гомогенизируют в течение 2 мин, после чего перемешивают на шейкере вортексного типа в течение 10 мин. Далее процедуру экстракции и обезжиривания пробы проводят согласно рисунку 1.
Сухие молочные продукты восстанавливают по ГОСТ 29245 (пункт 3.4).
9 Проведение иммуноферментного анализа
9.1 Общие положения
9.1.1 При проведении испытаний следует использовать реагенты и компоненты, входящие в один и тот же набор (тест-систему). Разбавление или замена реагентов из набора (тест-системы) другой серии не допускается.
9.1.2 Наборы (тест-системы) следует хранить при температуре от 2 °C до 8 °C в пределах срока хранения.
9.1.3 Окрашивание раствора субстрата № 11 (см. приложение А) является признаком его порчи и делает невозможным его применение для анализа.
9.2 Подготовка тест-системы к проведению анализа
9.2.1 Перед использованием тест-систему вынимают из холодильника и выдерживают при комнатной температуре не менее 30 мин, после чего аккуратно встряхивают каждый флакон. Реактив № 2 (см. приложение А) необходимо прогреть в сушильном шкафу при температуре 37 °C до полного растворения кристаллов солей и тщательно перемешать.
9.2.2 После использования, реагенты тест-системы сразу помещают в холодильник.
9.2.3 На всех стадиях необходимо избегать воздействия прямого солнечного света.
9.2.4 Для каждого реактива и раствора используют отдельные съемные наконечники автоматических пипеток. Внесение растворов в лунки проводят осторожно, не касаясь наконечниками их дна и стенок.
9.2.5 Каждый исследуемый рабочий раствор экстрактов испытуемых проб анализируют в двух повторностях.
Примечание - Далее приведены расходы реактивов на два стрипа <1>, что достаточно для анализа двух исследуемых проб. Для другого числа проб количество используемых стрипов и смешиваемых объемов реагентов изменяют в соответствии с количеством исследуемых проб.
<1> Стрип — полоска из восьми лунок.
9.3 Проведение испытания
9.3.1 Из планшета извлекают необходимое число стрипов. Неиспользованные стрипы хранят в закрытом фольгированном полиэтиленовом пакете с зип-локом <2> при температуре от 2 °C до 8 °C в течение срока годности тест-системы.
<2> Зип-лок — замок, обеспечивающий герметизацию пакета.
9.3.2 В лунки планшета вносят по 0,05 см3 рабочих градуировочных растворов (8.2.6) и по 0,05 см3 растворов экстрактов испытуемых проб.
Каждый раствор вносят в двойной повторности (лунки-дубли).
Внесение растворов проводят согласно приложению Б.
Далее в каждую лунку вносят по 0,05 см3 раствора № 1 (см. приложение А). Стрипы заклеивают пленкой или закрывают крышкой, инкубируют в термостате при температуре 37 °C в течение 1 ч, после чего содержимое лунок сливают.
9.3.3 В лунки планшета вносят по 0,2 см3 раствора буфера для промывки (см. 8.2.7), оставляют на 1 — 2 мин и сливают. Процедуру промывки повторяют еще три раза. Остатки жидкости интенсивно стряхивают на чистую фильтровальную бумагу.
9.3.4 В лунки планшета вносят по 0,1 см3 раствора ферментного конъюгата (см. 8.2.8), заклеивают пленкой или закрывают крышкой, инкубируют в термостате при температуре 37 °C 1 ч и отмывают, как указано в 9.3.3.
9.3.5 В лунки планшета вносят по 0,1 см3 раствора № 11 (см. приложение А) и инкубируют при комнатной температуре в темноте в течение 15 мин. Добавляют 0,1 см3 раствора № 12 (см. приложение А) и аккуратно перемешивают легким постукиванием по ребру планшета. Помещают планшет в вертикальный фотометр и измеряют значения ОП при длине волны 450 нм.
Запись результатов проводят согласно приложению В.
10 Обработка результатов измерения
10.1 По показателям ОП в лунках-дублях находят среднеарифметические значения. Разность значений ОП для них в процентах от среднего не должна превышать 10.
Связывание АТ (или относительное поглощение) П, %, рассчитывают по формуле
\text{П } = \frac{\text{ОП}_{\text{п}}}{\text{ОП}_{\text{к}}} \cdot 100 , (1)
где ОПп — среднее значение ОП, измеренной в лунках с градуировочными растворами энрофлоксацина К1 — К5 (см. 8.2.6) или рабочими растворами экстрактов испытуемых проб;
ОПк — среднее значение ОП, измеренной в лунках с градуировочным раствором К0 (см. 8.2.6).
По значениям процентов связывания, вычисленным для градуировочных растворов и соответствующим известным значениям массовой концентрации энрофлоксацина (мкг/дм3), строят градуировочный график в полулогарифмической системе координат.
10.2 Для построения градуировочного графика используют масштабно-координатную бумагу. На ось абсцисс наносят значения логарифмов концентраций энрофлоксацина в рабочих разведениях градуировочных растворов (см. 8.2.6). По оси ординат откладывают значения процентов связывания, рассчитанные для массовых концентраций по формуле (1), и строят градуировочный график с использованием линейной зависимости.
10.3 С помощью градуировочного графика по значению процента связывания, полученного для рабочих растворов экстрактов испытуемых проб, находят логарифм массовой концентрации фторхинолонов. С помощью калькулятора вычисляют его обратное значение (антилогарифм), соответствующее массовой концентрации определяемого фторхинолона в растворе экстракта. После чего рассчитывают содержание фторхинолонов в пробе C, мкг/дм3 (мкг/кг), по формуле
где c — массовая концентрация фторхинолонов в рабочем растворе экстракта испытуемой пробы, определяемая по градуировочному графику, мкг/дм3;
K — коэффициент пересчета мкг/дм3 в рабочем растворе экстракта испытуемой пробы в мкг/дм3 (мкг/кг), учитывающий как разведение, так и степень извлечения фторхинолонов и равный 10.
Результаты измерений массовой концентрации (содержания) фторхинолонов C, мкг/дм3 (мкг/кг), округляют до целого числа.
За окончательный результат принимают среднеарифметическое двух измерений, выполненных в условиях повторяемости, если выполняется условие приемлемости
где C1 и C2 — результаты определений содержания фторхинолонов, полученные в условиях повторяемости, мкг/кг;
Cср — среднеарифметическое результатов двух определений содержания фторхинолонов в пробе, мкг/кг;
r — предел повторяемости, %, (см. таблицу 1).
10.4 Допускается использование программного обеспечения, позволяющего определять содержание фторхинолонов в пробе по средним значениям ОП, измеренным в лунках с градуировочными растворами и рабочими растворами экстрактов испытуемых проб.
11 Контроль точности результатов измерения
Проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (сходимости) и воспроизводимости, проводят с учетом требований ГОСТ ИСО 5725-6 (раздел 5).
Относительное расхождение между результатами, полученными в разных лабораториях, не должно превышать относительного стандартного отклонения воспроизводимости (см. таблицу 1).
КОМПЛЕКТАЦИЯ ТЕСТ-СИСТЕМЫ <1> «ФТОРХИНОЛОНЫ ИФА»
<1> Данный комплект реагентов является рекомендуемым и приведен для удобства пользователей настоящего стандарта.
В комплектацию тест-системы входят:
Планшет 96-луночный полистироловый стрипованный для иммунологических исследований, сенсибилизированный антигеном;
Пакет полиэтиленовый фольгированный с зип-локом.
Пленка полиэтиленовая самоклеющаяся для заклеивания планшетов.
№ 1 — АТ — антитела к энрофлоксацину;
№ 2 — раствор фосфатного буфера для промывки с добавлением твина-20 (20-кратный концентрат), pH (7,0 — 7,4);
№ 4 — К1, № 5 — К2, № 6 — К3, № 7 — К4, № 8 — К5 - градуировочные растворы с известным содержанием (мкг/дм3) энрофлоксацина;
№ 9 — ФК — конъюгат антител против IgG (H + L) кролика с пероксидазой хрена (10-кратный концентрат);
№ 10 — реакционный буферный раствор с добавлением твина-20 и бычьего сывороточного альбумина, pH 7,0 — 7,4, стерильный;
№ 11 — раствор субстрата на основе 3,3',5,5'-тетраметилбензидина с добавлением перекиси водорода;
№ 12 — стоп-реагент, раствор серной кислоты молярной концентрацией 0,5 моль/дм3;
№ 13 — натрия ацетат, раствор молярной концентрацией 1,5 моль/дм3.
СХЕМА ЗАПОЛНЕНИЯ ЛУНОК ПЛАНШЕТА
Внесение реагентов следует проводить согласно следующей схеме:
ТАБЛИЦА ДЛЯ ЗАПИСИ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЯ