ГОСТ 32799-2014. Межгосударственный стандарт. Продукция соковая. Определение свободных аминокислот методом ионообменной хроматографии

(введен в действие Приказом Росстандарта от 01.08.2014 № 854-ст)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["ГОСТ Р 54743-2011"]:::rst
  click n0 "https://bukva.ai/docs/gost-r-54743-2011" "ГОСТ Р 54743-2011. Национальный стандарт Российской Федерации. Продукция соковая. Определение свободных аминокислот методом ионообменной хроматографии (утв. и введен в действие При"
  n1["ГОСТ 32799-2014"]:::doc
  click n1 "https://bukva.ai/docs/standart-gost-32799-2014" "ГОСТ 32799-2014. Межгосударственный стандарт. Продукция соковая. Определение свободных аминокислот методом ионообменной хроматографии (введен в действие Приказом Росстандарта от 01"
  n0 --> n1
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 1 августа 2014 г. № 854-ст

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКЦИЯ СОКОВАЯ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ МЕТОДОМ ИОНООБМЕННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Juice products. Determination of free amino acids by ion-exchange chromatography

ГОСТ 32799-2014

МКС 67.050

67.080

Дата введения 1 января 2016 года

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1 ПОДГОТОВЛЕН Некоммерческой организацией «Российский союз производителей соков» (РСПС)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 25 июня 2014 г. № 45-П)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 1 августа 2014 г. № 854-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32799-2014 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2016 г.

5 В настоящем стандарте учтены основные положения и метрологические характеристики метода Международной федерации производителей фруктовых соков (International Federation of Fruit Juice Produces) IFUMA57 (1989) (Rev. 2005) Determination of free amino acids (метод ИФУ 57:1989 (Rev. 2005) Определение свободных аминокислот).

6 Настоящий стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 54743-2011

7 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет

1. Область применения

Настоящий стандарт распространяется на фруктовые и овощные соки, нектары, сокосодержащие напитки, фруктовые и овощные концентрированные соки, пюре и концентрированные пюре, морсы и концентрированные морсы, соковую продукцию из фруктов и овощей обогащенную и для детского питания (далее — соковая продукция) и устанавливает метод определения свободных аминокислот: аспарагиновой кислоты, глутаминовой кислоты, аланина, изолейцина, фенилаланина, глутамина, лизина, треонина, пролина, валина, лейцина, серина, глицина, метионина, тирозина, аминомасляной кислоты, орнитина, аргинина, гистидина, аспарагина с применением ионообменной хроматографии.

Метод может быть использован в том числе для определения этаноламина и аммиака.

Нижний предел измерений массовой (молярной) концентрации каждого из указанных выше компонентов составляет 1 мг/дм3 (1 ммоль/дм3). Верхний предел измерений массовой (молярной) концентрации каждого из указанных выше компонентов 5000 мг/дм3 (5000 ммоль/дм3).

Настоящий стандарт может применяться для целей идентификации.

2. Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.019-79 <*> Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

<*> На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009 «Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты».

ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ OIML R 76-1-2011 Государственная система обеспечения единства измерений. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания

ГОСТ 199-78 Реактивы. Натрий уксуснокислый 3-водный. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия

ГОСТ ISO 3696-2013 <**> Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы испытаний

<**> На территории Российской Федерации действует ГОСТ Р 52501-2005 «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».

ГОСТ ИСО 5725-1-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

ГОСТ ИСО 5725-6-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

ГОСТ 5820-78 Реактивы. Калий уксуснокислый. Технические условия

ГОСТ 9245-79 Потенциометры постоянного тока измерительные. Общие технические условия

ГОСТ 9656-75 Реактивы. Кислота борная. Технические условия

ГОСТ 11311-76 Фенол каменноугольный. Технические условия

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ ИСО/МЭК 17025-2009 Общие требования к компетентности испытательных и калибровочных лабораторий

ГОСТ 22280-76 Реактивы. Натрий лимоннокислый 5,5-водный. Технические условия

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26313-84 Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб

ГОСТ 26671-85 Продукты переработки плодов и овощей, консервы мясные и мясорастительные. Подготовка проб для лабораторных анализов

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

ГОСТ 31643-2012 Продукция соковая. Определение аскорбиновой кислоты методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3. Сущность метода

Метод основан на хроматографическом разделении смеси аминокислот на колонке с катионообменным сорбентом и последующим ступенчатым элюированием буферными растворами.

Разделенные аминокислоты вступают в реакцию с нингидрином при температуре 100 °C — 135 °C. Окрашенный элюат, содержащий смесь свободных аминокислот, детектируют с помощью фотометрического детектора при длинах волн 570 нм и 440 нм.

4. Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы

4.1 Анализатор аминокислот автоматический <*>, состоящий:

• из системы градиентного элюирования;
• системы постколоночной дериватизации;
• спектрофотометрического детектора для одновременного измерения оптической плотности при длинах волн 570 и 440 нм с проточной кюветой объемом 15 мм3, обеспечивающего предел детектирования аминокислот не более 1 пмоль;
• программно-аппаратного комплекса сбора и обработки результатов измерений;
• хроматографической колонкой следующих размеров (внутренний диаметр x длина): 9 мм x 500 мм, 6 мм x 200 мм, 4,6 мм x 200 мм или 270 мм, 4 мм x 200 мм, 3,2 мм x 140 мм, заполненной катионообменной смолой с привитыми сульфогруппами, <**> пригодной для работы в диапазоне от 2,0 до 7,0 ед. pH и обеспечивающей хроматографическое разделение аминокислот при использовании ступенчатого градиента pH подвижной фазы.

<*> Автоматический анализатор аминокислот фирмы Biochrom 30+ обеспечивает требуемую эффективность хроматографического разделения. Данная информация не является рекламой указанного прибора и не исключает возможность применения других анализаторов.

<**> Смолы Biotronik BTC 3118 и LKB Ultropac 8 обеспечивают требуемую эффективность хроматографического разделения. Данная информация не является рекламой указанных сорбентов и не исключает возможность применения других смол.

4.2 Комплект из семи готовых буферных растворов к анализатору аминокислот.

4.3 Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 специального (I) класса точности с наибольшим пределом взвешивания не более 150 г и пределом допускаемой абсолютной погрешности +/- 0,005 г.

4.4 Посуда лабораторная стеклянная по ГОСТ 25336:

• колбы П-2-1000-34;
• воронки лабораторные типа В;
• стаканы В или Н различной вместимости.

4.5 Пипетки градуированные с относительной погрешностью дозирования +/- 1% по ГОСТ 29227 1-го класса точности или дозаторы пипеточные с аналогичными или изменяемыми объемами доз с относительной погрешностью дозирования не более +/- 1% по технической документации изготовителя.

4.6 Микрошприцы для ВЭЖХ вместимостью 25, 100 и 250 мм3 с относительной погрешностью дозирования не более 1%.

4.7 Посуда мерная лабораторная стеклянная по ГОСТ 1770:

• цилиндры 1-50-2 и 1-1000-2;
• колбы мерные 2-25-2, 2-50-2, 2-100-2, 2-500-2 и 2-1000-2;
• пробирки 1-25-0,1.

4.8 Емкости для жидких проб вместимостью 2 — 6 см3.

4.9 Фильтры мембранные с диаметром пор 0,22 и 0,45 мкм для фильтрования подвижной фазы и проб.

4.10 Фильтры обеззоленные.

4.11 Центрифуга лабораторная с величиной фактора разделения не менее 1000g с адаптером для пробирок подходящей вместимости.

4.12 Установка лабораторная для вакуумной мембранной фильтрации с мининасосом.

4.13 Иономер (pH-метр) по ГОСТ 9245 с погрешностью измерения не более 0,05 ед. pH, снабженный комбинированным стеклянным электродом.

4.14 Баня ультразвуковая.

4.15 Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026.

4.16 Цитрат лития <*> 4-х водный Li₃C₆H₅O₇·4H₂O, массовой долей основного вещества не менее 98%.

4.17 Хлорид лития <*> массовой долей не менее 98%.

4.18 Гидроксид лития <*> массовой долей не менее 98%.

<*> Соли лития токсичны и влияют на центральную нервную систему.

4.19 Фенол кристаллический по ГОСТ 11311, массовой долей основного вещества не менее 99%.

4.20 Кислота соляная по ГОСТ 3118, х.ч.

4.21 Этилцеллозольв (моноэтиловый эфир этиленгликоля), C₄H₁₀O₂ для хроматографии, с массовой долей основного вещества не менее 99,8% и показателем преломления nD в пределах 1,407 — 1,408.

4.22 Кислота борная, х.ч. по ГОСТ 9656.

4.23 Полиэтиленгликольмонолауириловый эфир C58H118O24, плотностью 1,03 г/см3 (CAS No 9002-92-0), водный раствор с массовой долей 30%.

4.24 2,2-Тиодиэтанол, массовой долей основного вещества не менее 99%.

4.25 Нингидрин (2,2-дигидрокси-1,3-индандион), массовой долей основного вещества не менее 95%.

4.26 Натрий уксуснокислый 3-водный по ГОСТ 199 (или калий уксуснокислый по ГОСТ 5820), ч.д.а.

4.27 Кислота уксусная ледяная по ГОСТ 61, х.ч.

4.28 Хлорид титана (III) 6-водный TiCl3·6H2O, 15% раствор в соляной кислоте, ч.

4.29 Гидриндантин 2-водный C18H10O6, с массовой долей основного вещества не менее 98%.

4.30 Натрий лимоннокислый трехзамещенный (цитрат натрия) по ГОСТ 22280, ч.д.а.

4.31 Норлейцин, массовой долей основного вещества не менее 98%.

4.32 Норвалин, массовой долей основного вещества не менее 99%.

4.33 Вода по ГОСТ ISO 3696, 1-й степени чистоты.

4.34 Стандартная смесь аминокислот в комплекте к анализатору аминокислот или индивидуальные аминокислоты (в форме DL- или L-оптических изомеров): \eta - \text{аминомасляная} , аспарагиновая, глутаминовая, аланин, изолейцин, фенилаланин, глутамин, лизин, треонин, пролин, валин, лейцин, серин, глицин, метионин, тирозин, орнитин, аргинин, гистидин, аспарагин, с массовой долей основного вещества не менее 98%.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам, а также посуды, реактивов, в том числе готовых наборов реактивов, по качеству не ниже перечисленных в настоящем разделе и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

5. Отбор и подготовка проб

Отбор проб — по ГОСТ 26313, подготовка проб — по ГОСТ 26671. Подготовка проб концентрированной соковой продукции и пюре — по ГОСТ 31643 (раздел 6.2).

6. Подготовка к проведению измерений

Включение и подготовку анализатора к работе, вывод его на режим и выключение по окончании работы осуществляют в соответствии с руководством по эксплуатации.

6.1 Подготовка буферных растворов для анализатора аминокислот

При проведении определений применяют семь готовых буферных растворов, входящих в комплект анализатора по 4.2, с кислотностью 2,2, 2,8, 3,0, 3,15, 3,50, 3,55 и 6 ед. pH.

Допускается приготовление буферных растворов с кислотностью 2,2, 2,8, 3,0, 3,15, 3,50, 3,55 и 6 ед. pH в лабораторных условиях из компонентов по 4.16 - 4.18 и воды в соответствии с инструкцией по использованию автоматического анализатора аминокислот.

Кислотность буферных растворов регулируют с помощью соляной кислоты, регистрируя показания pH-метра. Растворы консервируют добавлением 0,01% по массе фенола (см. 4.19) или 2,2-тиодиэтанола (см. 4.24).

Условия и срок хранения буферных растворов — в соответствии с рекомендациями производителя анализатора.

6.2 Подготовка дериватизирующего (красящего) реагента

Для проведения определения применяют готовый нингидриновый реагент, входящий в комплект анализатора по 4.1.

Допускается приготовление дериватизирующего реагента в лабораторных условиях из компонентов по 4.25 - 4.30 и воды в соответствии с инструкцией по использованию автоматического анализатора аминокислот.

Условия и срок хранения дериватизирующего реагента — в соответствии с рекомендациями производителя анализатора.

6.3 Приготовление рабочих растворов

Рабочие растворы включают исходные растворы А, Б, В и градуировочный раствор из смеси аминокислот.

6.3.1 Для приготовления исходного раствора А используют отдельные аминокислоты, указанные в таблице 1, либо стандартную смесь аминокислот, входящую в комплект анализатора, а также этаноламин и аммиак.

Таблица 1

6.3.2 Для приготовления исходного раствора Б используют аминокислоты Аспарагин (Asn) и Глутамин (Gln) (см. 4.34).

6.3.3 Для приготовления исходного раствора В (раствора внутреннего стандарта) используют норлейцин (см. 4.31) или норвалин (см. 4.32).

6.3.4 Исходные растворы А, Б и В готовят путем растворения веществ, указанных в 6.3.1 - 6.3.3, в буферном растворе цитрата лития с кислотностью 2,0 ед. pH в мерных колбах вместимостью 25, 50 или 100 см3.

Требуемую массу каждого вещества, используемого для приготовления исходных растворов m, мг, вычисляют по формуле

m = \frac{C \cdot V_{1} \cdot V_{2}}{V_{3}} , (1)

где C — массовая концентрация вещества в градуировочном растворе, определяемая исходя из границ установленного диапазона линейности аналитического сигнала детектора, мг/см3;

V1 — объем градуировочного раствора, см3;

V2 — объем исходного раствора, см3;

V3 — объем исходного раствора, взятый для приготовления градуировочного раствора, см3.

Срок хранения исходных градуировочных растворов при температуре минус 18 °C — не более 6 мес.

6.3.5 Для приготовления рабочего градуировочного раствора в мерной колбе вместимостью 100 см3 с помощью пипеток подходящей вместимости смешивают объемы от 2 до 10 см3 исходных растворов А, Б и В, соблюдая при этом следующее требование: массовая концентрация каждой аминокислоты, этаноламина или аммиака в градуировочном растворе должна находиться в границах диапазона линейности аналитического сигнала детектора, указанного в инструкции по эксплуатации анализатора.

Градуировочный раствор готовят непосредственно перед проведением измерений.

6.4 Построение градуировочной характеристики

Процедуры построения градуировочной характеристики и обработку хроматограмм выполняют в соответствии с руководством пользователя программным обеспечением анализатора.

Для каждого градуировочного раствора выполняют два параллельных измерения в условиях повторяемости по ГОСТ ИСО 5725-1 (подраздел 3.14). Компоненты идентифицируют по абсолютным значениям времени удерживания.

Регистрируют площадь пика каждой аминокислоты, этаноламина и аммиака.

Градуировочный коэффициент ki для каждой аминокислоты, этаноламина и аммиака, вычисляют по результатам измерений градуировочных растворов с помощью программно-аппаратного комплекса сбора и обработки данных или при его отсутствии в составе хроматографа вручную методом внутреннего стандарта по формуле

k_{i} = \frac{C_{i} \cdot S_{\text{ст}}}{\text{С}_{\text{ст}} \cdot S_{i}} , (2)

где Ci — массовая концентрация i-ой аминокислоты, этаноламина или аммиака в градуировочном растворе, определяемая по 6.3.4, мг/см3;

Sст — площадь пика норлейцина или норвалина (внутреннего стандарта) по результатам измерения градуировочного раствора, мВ·с;

Cст — массовая концентрация норлейцина или норвалина (внутреннего стандарта) в градуировочном растворе, мг/см3;

Si — площадь пика i-ой аминокислоты, этаноламина или аммиака по результатам измерений градуировочного раствора, мВ·с.

Результаты вычисления градуировочного коэффициента считаются приемлемыми, если значение коэффициента корреляции составляет не менее 0,995 для каждого компонента градуировочного раствора.

Градуировочную характеристику строят каждый раз при смене оборудования, колонок, условий измерений или при выявлении несоответствия метрологическим требованиям результатов оперативного контроля или внутреннего аудита.

Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят ежедневно перед началом работ с применением одного рабочего градуировочного раствора по одной из аминокислот, чередуя их. В случае обнаружения отклонения результатов измерения массовой концентрации аминокислоты в градуировочном растворе более чем на 3,5% проводят его повторное измерение.

В случае повторного отклонения градуировочную характеристику строят заново во всем диапазоне измерений.

7. Порядок проведения измерений

7.1 Условия проведения измерений

При подготовке к проведению и проведении измерений соблюдают следующие условия:

• температура окружающего воздуха — (25 +/- 5) °C;
• атмосферное давление — (97 +/- 10) кПа;
• относительная влажность — не более 85%;
• напряжение в питающей сети — (220 +/- 20) В;
• частота тока в питающей сети — (50 +/- 1) Гц.

Помещение, в котором проводят работы с реактивами, должно быть обеспечено приточно-вытяжной вентиляцией.

Все операции с реактивами следует проводить в вытяжном шкафу.

7.2 Приготовление растворов проб для хроматографического измерения

7.2.1 При испытании соковой продукции, в которой объемная доля мякоти не превышает 10%, пробу для измерения отбирают по объему. Предварительно, при наличии в пробе видимой мякоти или нерастворимых частиц, их удаляют центрифугированием при факторе разделения не менее 990g в течение 15 мин или фильтруют через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм или обеззоленный фильтр.

Фильтрат объемом от 5 до 25 см3 пипеткой подходящей вместимости переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3. Объем пробы для измерения выбирают, исходя из ожидаемой массовой концентрации компонентов в пробе таким образом, чтобы массовая концентрация каждого из компонентов в растворе пробы для хроматографического измерения находилась в границах диапазона линейности детектора, но была не менее трехкратной величины предела детектирования, указанного в инструкции по эксплуатации анализатора. В колбу пипеткой вносят исходный раствор В (см. 6.3.3) (раствор внутреннего стандарта) в объеме, необходимом для получения массовой концентрации внутреннего стандарта в растворе пробы, максимально приближенной к массовой концентрации внутреннего стандарта в градуировочном растворе. Объем содержимого в колбе доводят до метки буферным раствором цитрата лития с 2,0 ед. pH.

Полученный раствор используют для хроматографического определения.

7.2.2 При испытании соковой продукции с объемной долей мякоти 10% и более пробу массой 10,0 г помещают в мерную колбу вместимостью 50 см3, объем содержимого в колбе доводят до метки водой, содержимое колбы тщательно перемешивают и центрифугируют при факторе разделения не менее 990g в течение 15 мин. В случае неполного осаждения нерастворимых в воде частиц пробу фильтруют в пробирку через мембранный или обеззоленный фильтр. Затем подготовленную пробу объемом от 5,0 до 25,0 см3 пипеткой подходящей вместимости переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3.

Объем пробы выбирают, исходя из ожидаемой массовой концентрации аминокислот в пробе таким образом, чтобы массовая концентрация каждого из компонентов в растворе пробы для хроматографического измерения находилась в границах диапазона линейности аналитического сигнала детектора, но была не менее трехкратной величины предела детектирования, указанного в инструкции по эксплуатации анализатора. В колбу пипеткой вносят исходный раствор В (см. 6.3.3) (раствор внутреннего стандарта) в объеме, необходимом для получения массовой концентрации внутреннего стандарта в растворе пробы, максимально приближенной к массовой концентрации внутреннего стандарта в градуировочном растворе. Объем содержимого в колбе доводят до метки буферным раствором цитрата лития с 2,0 ед. pH.

Полученный раствор используют для хроматографического определения.

8. Обработка и оформление результатов измерений

Обработку хроматограмм и определение массовой концентрации аминокислот проводят с использованием программного обеспечения анализатора.

8.1 Массовую концентрацию каждой аминокислоты, этаноламина и аммиака C, мг/дм3, вычисляют по формуле

C = \frac{k_{i} \cdot \text{С}_{\text{ст}} \cdot S_{i} \cdot V_{1}}{S_{\text{ст}} \cdot V_{2} \cdot 1000} , (3)

где ki — градуировочный коэффициент, мг/см3·(мВ·с)-1;

Cст — массовая концентрация внутреннего стандарта (норлейцина или норвалина) в градуировочном растворе, мг/см3;

Si — площадь пика i-ой аминокислоты, этаноламина или аммиака на хроматограмме, мВ·с;

V1 — вместимость мерной колбы, взятой для разбавления пробы, см3;

Sст — площадь пика внутреннего стандарта (норлейцина или норвалина) на хроматограмме, мВ·с;

V2 — объем пробы, см3.

8.2 Молярную концентрацию X, ммоль/дм3, каждой аминокислоты, этаноламина и аммиака, вычисляют по формуле

X = \frac{C}{M} , (4)

где M — молярная масса i-ой аминокислоты, г/моль (см. приложение Г, таблицу Г.1).

За окончательный результат определения принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений Xср, округленное до второго десятичного знака, если абсолютная величина разности между результатами двух параллельных определений, выполненных в условиях повторяемости по ГОСТ ИСО 5725-1, не превышает предела повторяемости (сходимости) r, приведенного в таблице Г.1 приложения Г.

Пример хроматограммы свободных аминокислот, этаноламина и аммиака в пробе свежеотжатого яблочного сока и значения молярных концентраций свободных аминокислот в свежеотжатом яблочном соке приведены в справочном приложении Б.

Метрологические характеристики метода приведены в справочном приложении Г.

Окончательный результат измерений регистрируют в протоколе испытаний согласно ГОСТ ИСО/МЭК 17025 с указанием метода определения и настоящего стандарта.

9. Контроль качества результатов измерений и процедуры контроля стабильности результатов измерений при реализации метода в лаборатории

9.1 Контроль качества результатов измерений при реализации метода в лаборатории предусматривает:

• контроль исполнителем процедуры выполнения измерений (на основе оценки внутрилабораторной прецизионности и погрешности при реализации отдельно взятой контрольной процедуры);
• контроль стабильности результатов измерений (на основе контроля стабильности среднеквадратического отклонения повторяемости, среднеквадратического отклонения внутрилабораторной (промежуточной) прецизионности, погрешности).

9.2 Оперативный контроль погрешности (точности) результатов измерений осуществляют в соответствии с рекомендациями [1].

9.3 Контроль стабильности результатов измерений при реализации метода в лаборатории осуществляют по ГОСТ ИСО 5725-6 и [1], используя методы контроля стабильности стандартного отклонения промежуточной прецизионности и погрешности по ГОСТ ИСО 5725-6 с применением контрольных карт Шухарта.

Периодичность контроля результатов измерений регламентируют в руководстве по качеству лаборатории в соответствии с ГОСТ ИСО/МЭК 17025 (подраздел 4.2).

10. Требования, обеспечивающие безопасность

10.1 Условия безопасного проведения работ

При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ ₁₂.1.007. При подготовке проб и выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила по электробезопасности — по ГОСТ 12.1.019 и инструкции по эксплуатации прибора.

10.2 Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений, обработке и оформлению результатов допускаются инженер-химик, техник или лаборант, имеющие высшее или среднее специальное образование, опыт работы в химической лаборатории и изучившие методику измерений с применением метода высокоэффективной жидкостной хроматографии. Первое выполнение метода высокоэффективной жидкостной хроматографии в лаборатории следует проводить под руководством специалиста, владеющего теорией метода высокоэффективной жидкостной хроматографии и имеющего практические навыки в этой области.

Приложение А (справочное)

СХЕМА РАБОТЫ АВТОМАТИЧЕСКОГО АНАЛИЗАТОРА АМИНОКИСЛОТ

А.1 Принципиальная схема работы автоматического анализатора аминокислот Biochrom приведена на рисунке А.1.

1 — линия подачи буферных растворов, 2 — линия подачи дериватизирующего реагента (нингидрина), 3 — ионообменная колонка, 4 — фотоэлектрический умножитель (детектор), 5 — реакционная петля

Рисунок А.1 — Принципиальная схема работы аминокислотного анализатора

Приложение Б (справочное)

ХРОМАТОГРАММА СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ В ПРОБЕ СВЕЖЕОТЖАТОГО ЯБЛОЧНОГО СОКА

Б.1 Пример хроматограммы свободных аминокислот в пробе свежеотжатого яблочного сока приведен на рисунке Б.1 <*>.

<*> Измерение выполнено на аминокислотном анализаторе Biochrom 30+ производства компании Biochrom (Великобритания).

Б.2 Молярная концентрация свободных аминокислот в соответствии с параметрами хроматограммы свободных аминокислот в пробе свежеотжатого яблочного сока (рисунок Б.1) приведена в таблице Б.1.

Таблица Б.1

Молярная концентрация свободных аминокислот

Рисунок Б.1 — Хроматограмма свободных аминокислот в образце свежеотжатого яблочного сока

Приложение В (справочное)

МАССОВАЯ (МОЛЯРНАЯ) КОНЦЕНТРАЦИЯ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСЛОТ В ЯБЛОЧНОМ СОКЕ ПО ДАННЫМ AIJN

В.1 Значения показателей, определяемых Сводом правил для оценки качества фруктовых и овощных соков ассоциации производителей соков Евросоюза (AIJN) приведены в таблице В.1.

Таблица В.1

Массовая (молярная) концентрация свободных аминокислот в яблочном соке по данным [2]

Приложение Г (справочное)

ОСНОВНЫЕ МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДА

Таблица Г.1

Основные метрологические характеристики метода ИФУ 57:1989 (Rev. 2005) «Определение свободных аминокислот»

БИБЛИОГРАФИЯ