ГОСТ 32307-2013. Межгосударственный стандарт. Мясо и мясные продукты. Определение содержания жирорастворимых витаминов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
(введен в действие Приказом Росстандарта от 22.11.2013 № 1881-ст)
Примечание
Документ включен в Перечень международных и региональных (межгосударственных) стандартов, а в случае их отсутствия — национальных (государственных) стандартов, содержащих правила и методы исследований (испытаний) и измерений, в том числе правила отбора образцов, необходимые для применения и исполнения требований технического регламента Таможенного союза «О безопасности пищевой продукции» (ТР ТС 021/2011) и осуществления оценки соответствия объектов технического регулирования (Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 24.12.2019 № 236). Документ введен в действие с 01.07.2015.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 ноября 2013 г. № 1881-ст
ОПРЕДЕЛЕНИЕ СОДЕРЖАНИЯ ЖИРОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Meat and meat products. Determination of fat-soluble vitamins by high performance liquid chromatography
Дата введения 1 июля 2015 года
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»
Сведения о стандарте
1 РАЗРАБОТАН Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом мясной промышленности имени В.М. Горбатова Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии)
2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 226)
3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 14 ноября 2013 г. № 44)
4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 22 ноября 2013 г. № 1881-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32307-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 01 июля 2015 г.
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.
1. Область применения
Настоящий стандарт распространяется на мясо, субпродукты, мясные и мясосодержащие продукты и устанавливает метод определения массовой доли жирорастворимых витаминов: A (суммы ретинола и его сложноэфирных форм), D2 (эргокальциферола), D3 (холекальциферола), E (суммы \alpha - \text{токоферола} и его сложноэфирных форм) с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Диапазон измерения массовых долей витаминов: A — от 0,1 до 10,0 мг/кг, D2 и D3 - от 0,01 до 1,0 мг/кг, E — от 1,0 до 100,0 мг/кг.
2. Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание
ГОСТ OIML R 76-1-2011 ГСИ. Весы неавтоматического действия. Часть 1. Метрологические и технические требования. Испытания
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 4025-95 Мясорубки бытовые. Технические условия
ГОСТ 4166-76 Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия
ГОСТ 5717.2-2003 Банки стеклянные для консервов. Основные параметры и размеры
ГОСТ ИСО 5725-2-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 2. Основной метод определения повторяемости и воспроизводимости стандартного метода измерений
ГОСТ ИСО 5725-6-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 9792-73 Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб
ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный технический. Технические условия
ГОСТ 20469-95 Электромясорубки бытовые. Технические условия
ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 26272-98 Часы электронно-механические кварцевые наручные и карманные. Общие технические требования
ГОСТ 26678-85 Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия
ГОСТ 27460-87 Трубки, капилляры и палочки из боросиликатного стекла 3,3. Общие технические условия
ГОСТ 28165-89 Приборы и аппараты лабораторные из стекла. Аквадистилляторы. Испарители. Установки ректификационные. Общие технические требования
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3. Сущность метода
Метод основан на щелочном гидролизе пробы продукта и экстракции жирорастворимых витаминов диэтиловым эфиром. Анализ полученных экстрактов проводят методом высокоэффективной жидкостной хроматографии в ультрафиолетовой (УФ) области спектра с заданной длиной волны. Полученные результаты в виде пиков на хроматограмме сопоставляют с пиками стандартных растворов образцов витаминов известных массовых концентраций.
4. Средства измерений, вспомогательное оборудование, материалы и реактивы
Хроматограф жидкостной, укомплектованный:
- многоволновым УФ детектором, обеспечивающим измерение при длинах волн 270, 285 и 325 нм, с относительной погрешностью спектрофотометрического определения не более 2%;
- изократическим насосом;
- хроматографической колонкой для ВЭЖХ длиной 50 — 150 мм и диаметром 2,1 — 4,6 мм с обращенной фазой C18 размером частиц 1,8 — 5,0 мкм, имеющей эффективность не менее 5000 теоретических тарелок по пикам витаминов;
- блоком термостатирования колонок с поддержанием температуры 30 °C с точностью +/- 0,1 °C;
- записывающим устройством с компьютерным управлением и автоматической программой обработки хроматографических данных в соответствии с комплектацией хроматографа.
Примечание - Для разделения витаминов D2 и D3 рекомендуется использовать хроматографические колонки с обращенной фазой типа PAH (пористые силикагельные частицы, химически модифицированные фенильными группами, размер пор 95 A, эффективная поверхность 160 м2/г, углерод 14%).
Весы лабораторные по ГОСТ OIML R 76-1 со значением среднего квадратического отклонения (СКО), не превышающим 0,03 мг, и с погрешностью от нелинейности не более +/- 0,06 мг.
Баня водяная лабораторная, имеющая диапазон температур от 20 °C до 100 °C с точностью поддержания температуры +/- 0,5 °C.
Испаритель роторный по ГОСТ 28165.
Мясорубка бытовая по ГОСТ 4025 или электромясорубка бытовая по ГОСТ 20469 с отверстиями решетки диаметром от 2 до 4 мм.
Холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678.
Часы электронно-механические по ГОСТ 26272.
Пипетки градуированные вместимостью 1, 5 и 10 см3 по ГОСТ 29227 или дозаторы автоматические с аналогичными или измененными объемами доз с относительной погрешностью дозирования не более +/- 1%.
Воронки делительные ВД-1-250(500) ХС по ГОСТ 25336.
Колбы мерные 2-50-2, 2-100-2 по ГОСТ 1770.
Колбы круглодонные К-1-250-29/32 по ГОСТ 25336.
Колба коническая Кн-1-250-24/29 ТС по ГОСТ 25336.
Холодильник стеклянный ХСВО 10 ХС по ГОСТ 25336.
Воронка В-56(75)-80 ХС по ГОСТ 25336.
Палочки из боросиликатного стекла по ГОСТ 27460.
Банки стеклянные вместимостью 250 — 500 см3 по ГОСТ 5717.2.
Флаконы — виалы из темного стекла вместимостью 1,5 см3.
Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Спирт этиловый ректификованный по ГОСТ 18300.
Калия гидроокись по ГОСТ 24363, х.ч.
Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166, х.ч.
Агидол (2,6-дитретбутил-4-метилфенол) с содержанием основного вещества не менее 99,0%.
Ретинол (Витамин A) с содержанием основного вещества не менее 98,0%.
Эргокальциферол (Витамин D2) с содержанием основного вещества не менее 98,0%.
Холекальциферол (Витамин D3) с содержанием основного вещества не менее 99,0%.
\alpha - \text{Токоферол} (Витамин E) с содержанием основного вещества не менее 96,0%.
Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, аппаратуры с техническими характеристиками, а также реактивов и материалов по качеству не ниже указанных в настоящем стандарте.
5. Отбор проб
5.1 Отбор проб по ГОСТ 9792.
5.2 Пробу измельчают, дважды пропуская через мясорубку с диаметром отверстий решетки 2 — 4 мм, и тщательно перемешивают.
5.3 Подготовленную пробу помещают в стеклянную банку по ГОСТ 5717.2 вместимостью 250 — 500 см3 и закрывают крышкой.
Подготовленную пробу хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C не более 4 ч.
Подготовку проб к испытаниям проводят по 6.3.
6. Подготовка к проведению измерений
6.1 Приготовление растворов витаминов
6.1.1 Приготовление основного раствора витамина A с массовой концентрацией 0,1 мг/см3
Взвешивают 5,0 мг ретинола, переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3 по ГОСТ 1770 и доводят до метки метанолом.
6.1.2 Приготовление основного раствора витамина D2 с массовой концентрацией 0,1 мг/см3
Взвешивают 5,0 мг эргокальциферола, переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3 по ГОСТ 1770 и доводят до метки метанолом.
6.1.3 Приготовление основного раствора витамина D3 с массовой концентрацией 0,1 мг/см3
Взвешивают 5,0 мг холекальциферола, переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3 по ГОСТ 1770 и доводят до метки метанолом.
6.1.4 Приготовление основного раствора витамина E с массовой концентрацией 1,0 мг/см3
Взвешивают 50,0 мг токоферола, переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3 по ГОСТ 1770 и доводят до метки метанолом.
6.1.5 Приготовление градуировочных растворов витаминов
Для определения витаминов A, D2 и D3 из основного раствора массовой концентрации 0,1 мг/см3 готовят градуировочные растворы массовой концентрации 0,01 мг/см3 (раствор 1), 0,005 мг/см3 (раствор 2) и 0,0005 мг/см3 (раствор 3).
Для этого градуированной пипеткой по ГОСТ 1770 в мерные колбы вместимостью 100 см3 по ГОСТ 1770 переносят соответственно 10 см3 основного раствора витамина (для раствора 1) и 5 см3 основного раствора витамина (для раствора 2). Объем раствора доводят до метки метанолом. Для приготовления градуировочного раствора 3 в мерную колбу вместимостью 100 см3 по ГОСТ 1770 переносят 10 см3 градуировочного раствора 2 и доводят объем до метки метанолом.
Для определения витамина E из основного раствора массовой концентрации 1,0 мг/см3 готовят градуировочные растворы массовой концентрации 0,1 мг/см3 (раствор 1), 0,05 мг/см3 (раствор 2) и 0,005 мг/см3 (раствор 3).
Для этого градуированной пипеткой в мерные колбы вместимостью 100 см3 по ГОСТ 1770 переносят соответственно 10 см3 основного раствора витамина (для раствора 1) и 5 см3 основного раствора витамина (для раствора 2). Объем раствора доводят до метки метанолом. Для приготовления градуировочного раствора 3 в мерную колбу вместимостью 100 см3 по ГОСТ 1770 переносят 10 см3 градуировочного раствора 2 и доводят до метки метанолом.
Допускается использование смеси градуировочных растворов витаминов. Допускается приготовление градуировочных растворов с другими номинальными концентрациями целевых веществ в пределах измеряемого диапазона.
6.1.6 Растворы хранят в холодильнике при температуре (4 +/- 2) °C в течение 7 сут.
6.2 Приготовление раствора гидроокиси калия молярной концентрации c (KOH) = 10,0 моль/дм3
Взвешивают 56,0 г гидроокиси калия, переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 по ГОСТ 1770, растворяют в дистиллированной воде по ГОСТ 6709 и доводят объем до метки.
Раствор помещают в стеклянную колбу с притертой пробкой и хранят при комнатной температуре в темном месте не более одного месяца.
6.3 Подготовка пробы
6.3.1 Щелочной гидролиз пробы
Пробу анализируемого продукта массой (5,00 +/- 0,01) г помещают в круглодонную колбу со шлифом вместимостью 250 см3 по ГОСТ 25336. Последовательно добавляют 50 см3 этилового спирта по ГОСТ 18300, 10 см3 раствора гидроокиси калия и 50 мг агидола.
Колбу соединяют с обратным холодильником, помещают в водяную баню и нагревают при температуре (80 +/- 2) °C в течение 30 мин, периодически перемешивая палочкой из боросиликатного стекла по ГОСТ 27460 содержимое колбы. После этого содержимое колбы охлаждают до комнатной температуры.
6.3.2 Экстракция жирорастворимых витаминов
В колбу приливают 50 см3 дистиллированной воды и 50 см3 диэтилового эфира, перемешивают, сливают в делительную воронку вместимостью 500 см3 по ГОСТ 25336 и дают отстояться. После расслаивания нижний водно-спиртовой слой сливают в коническую колбу вместимостью 250 см3 по ГОСТ 25336, а верхний эфирный слой оставляют в делительной воронке. Переливают водно-спиртовой слой в другую делительную воронку, добавляют 50 см3 диэтилового эфира, встряхивают, отстаивают и после расслаивания верхний эфирный слой присоединяют к эфирному экстракту в первой делительной воронке.
Эфирный экстракт промывают дистиллированной водой порциями по 50 см3, отбрасывая нижний водный слой, повторяя данную процедуру трижды.
Промытый эфирный экстракт фильтруют в круглодонную колбу вместимостью 250 см3 через складчатый фильтр со слоем безводного сернокислого натрия (10 — 15 г), помещенный в коническую воронку. Эфир отгоняют на роторном испарителе при температуре не выше 30 °C под вакуумом.
Сухой остаток растворяют в 0,5 см3 метанола, переносят в виалу из темного стекла вместимостью 1,5 см3 и проводят хроматографический анализ в соответствии с разделом 7.
Примечание - Из-за высокой чувствительности витаминов к ультрафиолетовому свету и воздуху все процедуры, связанные с анализом, следует завершить в течение одного рабочего дня, избегая воздействия натурального и интенсивного флуоресцентного света.
7. Проведение измерений
7.1 Условия проведения хроматографического анализа подбираются в зависимости от вида применяемого жидкостного хроматографа и хроматографической колонки.
В качестве примера могут быть приведены следующие условия хроматографического определения жирорастворимых витаминов, выполненные на жидкостном хроматографе <*>.
<*> В настоящем стандарте используется жидкостной хроматограф Dionex Ultimate 3000 с колонкой Supelco SUPELCOSIL LC-PAH 5 мкм 4,6 x 150 мм. Данная информация является рекомендуемой, приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не исключает возможность использования других средств измерений с аналогичными свойствами.
0,02 см3 исследуемого раствора вводят в подготовленный к работе жидкостный хроматограф. Элюирование проводят в изократических условиях в течение 12 мин.
Состав элюента: смесь метанола и воды в объемном соотношении 92:8. Скорость подачи элюента 2,0 см3/мин.
Температура колонки 30 °C. Детектирование проводят при следующих длинах волн:
270 нм — для витаминов D2 и D3;
7.2 Идентификацию пиков хроматограммы исследуемого раствора проводят сравнением с хроматограммой градуировочного раствора по двум параметрам: времени удерживания и спектральному отношению R (отношение высот хроматографического пика на разных длинах волн).
7.3 Если время удерживания и спектральные отношения пиков хроматограммы исследуемого раствора совпадают в пределах допускаемых отклонений ( \Delta R \leq 0,05 , \Delta tR \leq 3\% ) с временем удерживания и спектральными отношениями соответствующих им пиков хроматограммы градуировочного раствора, результат идентификации считают положительным.
7.4 Если спектральные отношения совпадают в пределах допускаемого отклонения, а разница времени удерживания пиков хроматограммы исследуемого раствора и хроматограммы градуировочного раствора больше допускаемого отклонения, проводят хроматографический анализ соответствующего градуировочного раствора по 7.1 и сравнивают время удерживания. В случае совпадения в дальнейшем в качестве образца используют новую хроматограмму.
В случае повторного несовпадения времени удерживания используют метод добавок, для чего к исследуемому раствору добавляют известные количества определяемых витаминов с концентрацией, сравнимой с концентрацией «сомнительных» пиков, и анализируют по 7.1.
Если на хроматограмме пробы с добавкой площади «сомнительных» пиков увеличились на величину, соответствующую величине добавки, эти пики относятся к определяемым компонентам.
Если на хроматограмме пробы с добавкой наряду с «сомнительными» пиками присутствуют пики, время удерживания и спектральные отношения которых совпадают с соответствующими параметрами добавленных компонентов, сомнительные пики не относятся к определяемым компонентам.
7.5 Если время удерживания соответствующих пиков хроматограммы исследуемого раствора и хроматограммы градуировочного раствора совпадают в пределах допускаемого отклонения, а разница спектральных отношений больше допускаемого отклонения, настоящая методика неприменима к данному образцу.
7.6 Массовая концентрация витаминов в исследуемом растворе не должна превышать предельных значений концентраций градуировочных растворов. В случае превышения исследуемый раствор, содержащий витамины, с помощью механического дозатора разбавляют метанолом в рассчитанное количество раз и проводят хроматографический анализ разбавленных растворов. Если массовая концентрация витаминов в исследуемом растворе ниже предельного значения градуировочного раствора, необходимо увеличить массу пробы.
8. Обработка результатов
8.1 Массовую долю каждого витамина в продукте X, мг/кг, вычисляют по формуле
X = \frac{C_{\text{ст}} \cdot S_{x} \cdot V_{\text{р}}}{S_{\text{ст}} \cdot m \cdot 1000} , (1)
где Cст — массовая концентрация индивидуального витамина в градуировочном растворе, мг/см3;
Sx — площадь пика индивидуального витамина в анализируемой пробе, усл.ед.;
Sст — площадь пика индивидуального витамина в градуировочном растворе, усл.ед.;
Vр — объем растворителя, взятый для растворения сухого остатка после упаривания, см3;
m — масса исследуемой пробы, г;
1000 — коэффициент перевода массы г в кг анализируемой пробы.
За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение двух параллельных измерений, округленное до второго десятичного знака.
9. Метрологические характеристики
Метрологические характеристики метода при доверительной вероятности P = 0,95 приведены в таблице 1.
Расхождение между результатами двух параллельных определений, выполненных одним оператором при анализе одной и той же пробы с использованием одних и тех же средств измерений и реактивов, не должно превышать предела повторяемости (сходимости), r, значения которого приведены в таблице 1.
Результат анализа при доверительной вероятности P = 0,95 представляют в виде
где x1 и x2 — результаты параллельных измерений, мг/кг;
r — предел повторяемости, мг/кг.
Расхождение между результатами двух определений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предела воспроизводимости R, значения которого приведены в таблице 1.
Результат анализа при доверительной вероятности P = 0,95 представляют в виде
где X1 и X2 - результаты двух определений, выполненных в разных лабораториях, мг/кг;
R — предел воспроизводимости, мг/кг.
Границы относительной погрешности (\delta) , находящиеся с доверительной вероятностью P = 0,95, при соблюдении условий настоящего стандарта, не должны превышать значений, приведенных в таблице 1.
10. Точность метода
Точность метода была установлена при межлабораторном испытании, проведенном в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-6.
Показатели прецизионности метода определены в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО 5725-2.
11. Требования безопасности
11.1 При подготовке и проведении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007.
11.2 Помещение, в котором проводятся измерения, должно быть оснащено приточно-вытяжной вентиляцией. Работу необходимо проводить, соблюдая правила личной гигиены и противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.
11.3 При работе с электроприборами необходимо соблюдать требования безопасности по ГОСТ 12.1.019.