ГОСТ 31662-2012. Межгосударственный стандарт. Препараты ферментные. Методы определения ферментативной активности целлюлазы

(введен в действие Приказом Росстандарта от 28.09.2012 № 443-ст)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["ГОСТ Р 53046-2008"]:::rst
  click n0 "https://bukva.ai/docs/gost-r-53974-2010-rosstandart-federalnoe" "ГОСТ Р 53046-2008. Национальный стандарт Российской Федерации. Препараты ферментные. Методы определения ферментативной активности целлюлазы (утв. Приказом Ростехрегулирования от 16"
  n1["ГОСТ 31662-2012"]:::doc
  click n1 "https://bukva.ai/docs/standart-gost-31662-2012" "ГОСТ 31662-2012. Межгосударственный стандарт. Препараты ферментные. Методы определения ферментативной активности целлюлазы (введен в действие Приказом Росстандарта от 28.09.2012 N "
  n0 --> n1
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 28 сентября 2012 г. № 443-ст

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРЕПАРАТЫ ФЕРМЕНТНЫЕ

МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ ЦЕЛЛЮЛАЗЫ

Enzyme preparation. Methods of cellulasa enzyme activity determination

ГОСТ 31662-2012

МКС 07.100.30

65.120

Дата введения 1 января 2014 года

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены»

Сведения о стандарте

1 РАЗРАБОТАН Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ») и Научно-техническим центром «Лекарства и биотехнология» (НТЦ «Лекбиотех»)

2 ВНЕСЕН Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии

3 ПРИНЯТ Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол № 50 от 20 июля 2012 г.)

За принятие проголосовали:

4 Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 28 сентября 2012 г. № 443-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31662-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2014 г.

5 Настоящий стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 53046-2008

6 ВВЕДЕН ВПЕРВЫЕ

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта публикуется в указателе «Национальные стандарты».

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в указателе «Национальные стандарты», а текст изменений — в информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована в информационном указателе «Национальные стандарты»

1 Область применения

Настоящий стандарт устанавливает методы определения ферментативной активности целлюлазы ферментных препаратов с использованием двух субстратов: хроматографической бумаги и натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы.

Методы, установленные в настоящем стандарте, могут быть также использованы для определения ферментативной активности целлюлазы ферментсодержащих смесей, в т.ч. кормовых смесей и кормов.

Примечания

1 Активность целлюлазы (целлюлолитическую активность) природных объектов обеспечивает комплекс, содержащий, в основном, три типа ферментов: \text{эндо} - 1,4 - \beta - \text{глюканазы} , \text{экзо} - 1,4 - \beta - \text{глюканазы} и \beta - \text{глюкозидазы} .

2 Системные названия ферментов:

• \text{эндо} - 1,4 - \beta - \text{глюкан} - 4 - \text{глюканогидролазы} (КФ 3.2.1.4) катализируют расщепление целлюлозы с образованием крупных фрагментов;
• \text{экзо} - 1,4 - \beta - \text{глюканцеллобиогидролазы} (КФ 3.2.1.91) отщепляют целлобиозу от нередуцирующего конца молекул целлюлозы и их фрагментов;
• \text{экзо} - 1,4 - \beta - \text{глюкан} - 4 - \text{глюкогидролазы} (КФ 3.2.1.74) отщепляют глюкозу от нередуцирующего конца цепей;
• \beta - \text{глюкозидглюкогидролазы} (КФ 3.2.1.21), или \beta - \text{глюкозидазы} (целлобиазы) катализируют гидролиз целлобиозы.

2 Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:

ГОСТ 61-75 Реактивы. Кислота уксусная. Технические условия

ГОСТ 199-78 Реактивы. Натрий уксуснокислый 3-водный. Технические условия

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

ГОСТ 4206-75 Реактивы. Калий железосинеродистый. Технические условия

ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 5845-79 Реактивы. Калий-натрий виннокислый 4-водный. Технические условия

ГОСТ 6038-79 Реактивы. D-глюкоза. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия

ГОСТ 13867-68 Продукты химические. Обозначения чистоты

ГОСТ 20264.0-74 Препараты ферментные. Правила приемки и методы отбора проб

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1:1981) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования

Примечание - При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю «Национальные стандарты», составленному по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3 Термины и определения

В настоящем стандарте применяют следующие термины с соответствующими определениями:

3.1 гидролиз: Расщепление исходного соединения на два более простых в присутствии молекул воды.

3.2 ферментативный гидролиз: Гидролиз высокомолекулярных соединений под воздействием катализаторов белковой природы — гидролитических ферментов (гидролаз, класс 3).

3.3 системные названия ферментов: Названия, указывающие природу химической реакции, катализируемой данным ферментом, в соответствии с современной классификацией (КФ), принятой Международной комиссией по ферментам.

3.4 субстрат: Соединение или вещество, на которое воздействует данный фермент.

3.5 целлюлоза: Высокомолекулярное соединение, полимер глюкозы.

3.6 целлюлолитический комплекс ферментов: Комплекс гидролитических ферментов, расщепляющий целлюлозу до конечного продукта — глюкозы.

4 Метод определения ферментативной активности целлюлазы с использованием субстрата хроматографической бумаги

4.1 Характеристика метода

4.1.1 Метод основан на количественном определении восстанавливающих сахаров, образующихся в результате гидролиза целлюлозы хроматографической бумаги под действием ферментов целлюлолитического комплекса.

Метод используется при возникновении разногласий в качестве арбитражного.

4.1.2 За единицу целлюлолитической активности (1 ед. ЦлА) принято количество ферментов, которое катализирует гидролиз целлюлозы хроматографической бумаги с образованием 1 мкмоля восстанавливающих сахаров (в пересчете на глюкозу) за 1 ч при температуре 50 °C и pH 4,7.

4.1.3 Содержание восстанавливающих сахаров, образующихся в результате ферментативной реакции, определяют колориметрическим методом с использованием реактива динитросалициловой кислоты или калия железосинеродистого (красной кровяной соли, калия феррицианида, калия гексационоферрата) и рассчитывают по градуировочному графику, построенному для глюкозы. Диапазон измерений контролируемого показателя 0,5 — 25,0 ед. ЦлА.

4.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы

4.2.1 Для определения ферментативной активности целлюлазы используют следующие средства измерений и оборудование:

• фотоэлектроколориметр (ФЭК) или спектрофотометр (СФ) любого типа, которые обеспечивают измерения при длине волны 540 нм и погрешностью измерения коэффициента пропускания не более 1% (не более 0,01 D (ед. ОП));
• pH-метр любого типа для измерения в диапазоне от 0 до 14 pH, с пределом допускаемой погрешности в эксплуатации +/- 0,1 ед. pH;
• магнитную мешалку любой марки, которая обеспечивает скорость вращения до 800 мин-1;
• ультратермостат или водяной термостат с точностью регулирования температуры +/- 1 °C;
• весы лабораторные высокого или специального класса точности с ценой поверочного деления 0,1 мг;
• лабораторную центрифугу любого типа, которая обеспечивает скорость вращения не менее 7000 мин-1;
• секундомер механический с пределом измерений 60 мин с ценой деления 0,2 с;
• водяную баню любого типа, которая обеспечивает поддержание температуры (100 +/- 1) C;
• таймер любого типа с погрешностью +/- 30 с;
• механическую мельницу, обеспечивающую размалывание исследуемого образца ферментного препарата до полного прохода пробы через сито;
• сито с размером отверстий 1,0 мм, сделанное из металлического проволочного тканого материала.

4.2.2 Для определения ферментативной активности целлюлазы используют следующие лабораторную посуду и материалы:

• колбы мерные 1(2)-50, 100, 200, 500, 1000-2 по ГОСТ 1770;
• воронки ВФ — 1(2)-60-ПОР 500 ТХС по ГОСТ 25336;
• пробирки П 1-14-120 ХС или П 1-16-150 ХС по ГОСТ 25336;
• пипетки по ГОСТ 29227;
• пипетки автоматические номинальной вместимостью от 0,1 до 1,0 см3 с наконечниками;
• колбы и стаканы (бюксы) СВ 19/9 и 24/10 по ГОСТ 25336;
• стаканы В-1-25, 50, 100, 150, 250, 600, 800, 1000 ТС по ГОСТ 25336;
• цилиндры 1(2, 3, 4)-50 (100) по ГОСТ 1770
• ступку и пестик фарфоровые по ГОСТ 9147.

4.2.3 Для определения ферментативной активности целлюлазы используют следующие реактивы:

• кислоту уксусную ледяную по ГОСТ 61;
• натрий уксуснокислый трехводный по ГОСТ 199;
• калий-натрий виннокислый четырехводный по ГОСТ 5845;
• калий железосинеродистый по ГОСТ 4206;
• натрия гидроокись по ГОСТ 4328;
• воду дистиллированную по ГОСТ 6709;
• кислоту 3,5-динитросалициловую (ДНС) кристаллическую с содержанием основного вещества 98%;
• D-глюкозу по ГОСТ 6038;
• хроматографическую бумагу массой от 98 до 102 мг (Watman № 1).

4.2.4 Все реактивы должны относиться к подгруппе чистоты 2 (х.ч.) или 3 (ч.д.а.) по ГОСТ 13867.

4.2.5 Допускается применение других средств измерений и вспомогательного оборудования с метрологическими и техническими характеристиками, а также реактивов по качеству не ниже указанных.

4.3 Подготовка к анализу

4.3.1 Для определения ферментативной активности целлюлазы приготавливают ацетатный буферный раствор молярной концентрации 0,1 моль/дм3 с pH 4,7.

4.3.1.1 Ацетатный буферный раствор готовят из растворов уксусной кислоты и уксуснокислого натрия молярной концентрации 0,1 моль/дм3 путем их смешивания.

4.3.1.2 Для приготовления раствора уксусной кислоты в мерную колбу вместимостью 1 дм3 вносят 5,7 см3 ледяной уксусной кислоты и разводят в дистиллированной воде объемом от 200 до 300 см3. Затем доводят объем раствора дистиллированной водой до метки и снова перемешивают.

Срок хранения раствора в стеклянной посуде при комнатной температуре — не более 1 мес.

4.3.1.3 Для приготовления раствора уксуснокислого натрия в мерную колбу вместимостью 1 дм3 вносят 13,6 г уксуснокислого натрия и растворяют в дистиллированной воде объемом от 200 до 300 см3. Затем доводят объем раствора до метки дистиллированной водой и перемешивают.

Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 1 мес.

4.3.1.4 Для приготовления ацетатного буферного раствора смешивают равные объемы растворов уксусной кислоты и уксуснокислого натрия, полученных в соответствии с 4.3.1.2 и 4.3.1.3, измеряют pH и при необходимости доводят значение pH до 4,7 одним из исходных растворов.

Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 1 мес.

4.3.2 Для приготовления раствора натрия гидроокиси массовой доли 10,7% растворяют 16,05 г гидроокиси натрия в 150 см3 дистиллированной воды. Полученный раствор охлаждают до комнатной температуры.

4.3.3 Для приготовления реактива динитросалициловой кислоты (ДНС) массовой доли 1,0% в стакан вместимостью 1 дм3 вносят 10,0 г ДНС добавляют 400 см3 дистиллированной воды и перемешивают на магнитной мешалке в течение 25 — 30 мин при комнатной температуре. Затем постепенно, при постоянном перемешивании, добавляют 150 см3 раствора гидроокиси натрия по 4.3.2. При этом окраска раствора меняется от светло-желтой до ярко-желтой.

Стакан с полученным раствором помещают в водяную баню с температурой (47 +/- 1) °C и постепенно небольшими порциями добавляют 300 г виннокислого калия-натрия. Перемешивание продолжают при той же температуре до полного растворения реактива.

Раствор охлаждают холодной водой до комнатной температуры, переносят в мерную колбу вместимостью 1 дм3 и доводят объем до метки дистиллированной водой.

Приготовленный реактив должен иметь ярко-желтое окрашивание (без красного оттенка).

Срок хранения раствора в темной бутыли при комнатной температуре — не более 6 мес.

При необходимости (в случае образования осадка) раствор фильтруют через воронку со стеклянным фильтром.

4.3.4 Приготовление щелочного раствора калия железосинеродистого (гексацианоферрата)

6,01 г гидроксида натрия растворяют в 200 см3 дистиллированной воды в мерной колбе на 1 дм3, добавляют 0,6 г калия гексацианоферрата, растворяют и доводят объем до метки дистиллированной водой.

Срок хранения раствора в темной стеклянной посуде при комнатной температуре — не более 1 мес.

4.3.5 Приготовление стандартных растворов глюкозы при определении по методу с ДНС-реактивом

Для приготовления стандартных растворов глюкозы при определении по методу с ДНС-реактивом готовят основной стандартный раствор концентрации 5 мкмоль/см3 (900 мкг/см3).

Для этого навеску D-глюкозы (далее — глюкоза) массой 90 мг, взятую с точностью до 0,2 мг, вносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в небольшом количестве буферного раствора (от 30 до 50 см3), доводят объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

Из основного стандартного раствора глюкозы готовят серию разведений в соответствии с таблицей 1.

Таблица 1

4.3.6 Приготовление стандартных растворов глюкозы при определении по методу с железосинеродистым калием

Для приготовления стандартных растворов глюкозы при определении по методу с железосинеродистым калием готовят основной стандартный раствор концентрации 1 мкмоль/см3 (180 мкг/см3). Для этого навеску безводной глюкозы массой 90 мг, взятую с точностью до 0,2 мг, вносят в мерную колбу вместимостью 500 см3, растворяют в небольшом количестве буферного раствора (от 30 до 50 см3), доводят объем до метки дистиллированной водой и тщательно перемешивают.

Из основного стандартного раствора глюкозы готовят серию разведений в соответствии с таблицей 2.

Таблица 2

4.3.7 Стандартные растворы глюкозы готовят в день построения градуировочного графика из трех параллельных навесок.

4.3.8 Для построения градуировочного графика с реактивом ДНС в пробирки вносят по 1 см3 стандартного раствора глюкозы, приготовленных по 4.3.5, различной концентрации в соответствии с таблицей 1, 1,0 см3 дистиллированной воды, 3,0 см3 реактива ДНС и быстро перемешивают. Одновременно готовят контрольную пробу на реактивы. Для этого в пробирку вносят 1 см3 ацетатного буферного раствора по 4.3.1, добавляют 1 см3 дистиллированной воды и 3 см3 реактива ДНС по 4.3.3.

Пробирки помещают в кипящую водяную баню и кипятят в течение 5 мин с точностью, измеряемой по секундомеру. Пробирки охлаждают до комнатной температуры и измеряют оптическую плотность растворов на ФЭК или СФ при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм, против контрольной пробы на реактивы.

По полученным данным строят градуировочный график оптической плотности (поглощения) как функции от концентрации глюкозы (мкмоль/см3). По оси абсцисс откладывают молярные концентрации глюкозы мкмоль/см3, по оси ординат — оптические плотности в единицах оптической плотности (ед. ОП). Рабочая зона градуировочного графика лежит в пределах оптической плотности от 0,15 до 0,65 ед. ОП.

Для построения каждой точки градуировочного графика вычисляют среднеарифметическое значение оптической плотности трех параллельных измерений.

Градуировочный график строят для каждой новой партии реактива ДНС, а также при замене прибора.

4.3.9 Для построения градуировочного графика с железосинеродистым калием вносят в серию пробирок по 2 см3 разведений стандартного раствора глюкозы, приготовленных по 4.3.6, и добавляют 6 см3 раствора гексацианоферрата калия. Пробирки помещают в кипящую водяную баню на 10 мин, затем вынимают и охлаждают до комнатной температуры. Измеряют оптическую плотность окрашенных растворов при длине волны от 400 до 440 нм и толщине поглощающего слоя 10 мм против дистиллированной воды.

На основании полученных результатов строят градуировочный график зависимости значений оптической плотности от концентрации глюкозы (мкмоль/см3). По оси абсцисс откладывают молярные концентрации глюкозы мкмоль/см3, по оси ординат — оптические плотности в единицах ОП. График имеет обратную линейную зависимость. Рабочая зона градуировочного графика лежит в пределах от 0,3 до 0,6 мкмоль/см3 глюкозы, что соответствует поглощению в единицах оптической плотности от 0,50 до 0,65 ед. ОП.

Для построения каждой точки градуировочного графика вычисляют среднеарифметическое значение оптической плотности трех параллельных измерений.

Градуировочный график строят для каждой новой партии реактивов, а также при замене прибора.

4.3.10 Для приготовления раствора ферментного препарата отбирают образец по ГОСТ 20264.0.

Анализируемые образцы в форме порошка или микрокапсулированные можно использовать без предварительной подготовки. Анализируемые образцы в форме гранул следует измельчать (например, в механической мельнице или фарфоровой ступке) и просеивать через сито с диаметром отверстий не более 1 мм.

4.3.10.1 Для приготовления основного раствора ферментного препарата берут его навеску массой от 0,1 до 10 г <*> с точностью до 0,2 мг и суспендируют в небольшом количестве дистиллированной воды (до 50 см3) на магнитной мешалке в течение 15 мин (порошок, измельченные микрогрануляты и др.) или 60 мин (корма, кормовые смеси). Суспензию количественно переносят в мерную колбу вместимостью 200 см3 и доводят объем дистиллированной водой до метки. Полученную суспензию центрифугируют при частоте вращения 7000 мин-1 в течение 15 мин. Для анализа используют надосадочную жидкость.

<*> В зависимости от предполагаемой активности.

4.3.10.2 Рабочий раствор готовят из основного раствора ферментного препарата путем его разведения в дистиллированной воде (например, в 10 раз) таким образом, чтобы при определении активности оптические плотности опытного и контрольного растворов находились в пределах рабочей зоны градуировочного графика.

4.4 Проведение анализа

4.4.1 Анализ проводят в двух параллельных определениях.

4.4.2 В три пробирки (две опытные и одна контрольная) помещают по полоске бумаги для хроматографии массой 98 — 102 мг (размером 1,5 x 8,0 см), сложенной гармошкой, заливают 2 см3 ацетатного буферного раствора и перемешивают. Пробирки закрывают пробками, помещают в ультратермостат с температурой (50 +/- 1) °C и выдерживают в течение 10 мин.

4.4.3 В две опытные пробирки добавляют по 2 см3 рабочего раствора ферментного препарата с той же температурой и перемешивают. Все три пробирки помещают в ультратермостат с температурой (50 +/- 1) C и выдерживают в течение 60 мин.

4.4.4 При определении восстанавливающих сахаров по методу с ДНС-реактивом после проведения гидролиза из двух пробирок (опытные пробы) отбирают по 1 см3 реакционной смеси в чистые пробирки. В третью пробирку (контрольную) вносят 2 см3 рабочего раствора, перемешивают и сразу же отбирают 1 см3 смеси в чистую пробирку.

Во все три пробирки (две опытные и одну контрольную) сразу же добавляют по 1 см3 дистиллированной воды и 3 см3 ДНС-реактива. Содержимое пробирок тщательно перемешивают и помещают в кипящую водяную баню на 5 мин (с точностью, определяемой по секундомеру), после чего охлаждают до комнатной температуры.

Оптические плотности измеряют в опытных и контрольной пробах на ФЭК или СФ при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм против контрольной пробы на реактивы по 4.3.7.

4.4.5 При определении восстанавливающих сахаров по методу с калием железосинеродистым после проведения гидролиза из двух пробирок (опытные пробы) отбирают по 2 см3 реакционной смеси в чистые пробирки. В третью пробирку (контрольную) вносят 2 см3 основного раствора препарата фермента, перемешивают и сразу же отбирают 2 см3 смеси в чистую пробирку.

Во все три пробирки добавляют по 6 см3 раствора калия гексацианоферрата. Пробирки закрывают пробками и кипятят в водяной бане ровно 10 мин (по секундомеру), после чего быстро охлаждают до комнатной температуры.

Измеряют оптическую плотность содержимого всех трех пробирок против дистиллированной воды при длине волны от 400 до 420 нм в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм.

Показатели оптических плотностей в опытных и контрольной пробах должны соответствовать значениям от 0,50 до 0,65 ед. ОП. В случае, если ОП опытных проб меньше 0,50, то основной раствор дополнительно разводят, если больше 0,65 — берут меньшее разведение основного раствора. Обыкновенно опытные пробы в сравнении с контрольной имеют в 10 раз большее разведение.

4.5 Обработка результатов

4.5.1 Молярную концентрацию глюкозы (в мкмоль/см3) в опытных и контрольном растворах определяют по градуировочному графику.

4.5.2 Целлюлолитическую активность ЦлА, ед/г, в ферментном препарате при определении с ДНС-реактивом вычисляют по формуле

\text{ЦлА } = \frac{\text{С}_{\text{о}} - \text{С}_{\text{к}}}{t\text{с}} , (1)

где Cо — молярная концентрация глюкозы в опытной пробе в соответствии с градуировочным графиком, мкмоль/см3;

Cк — молярная концентрация глюкозы в контрольной пробе в соответствии с градуировочным графиком, мкмоль/см3;

t — продолжительность гидролиза, ч (1 ч);

c — массовая концентрация ферментного препарата в реакционной смеси, г/см3, вычисляют по формуле

\text{с} = \frac{\text{т}}{VP2} , (2)

где m — масса навески ферментного препарата, г;

V — объем разведения навески при приготовлении основного раствора по 4.3.10.1, см3;

P — разведение основного раствора ферментного препарата для приготовления рабочего раствора по 4.3.10.2;

2 — разведение рабочего раствора в реакционной смеси.

4.5.3 Целлюлолитическую активность ЦлА, ед/г, при определении с феррицианидом калия вычисляют по формуле

\text{ЦлА } = \frac{\text{С}_{\text{о}} - \frac{\text{С}_{\text{к}}}{\text{р}}}{tc} , (3)

где Cо — молярная концентрация глюкозы в опытной пробе в соответствии с градуировочным графиком, мкмоль/см3;

Cк — молярная концентрация глюкозы в контрольной пробе в соответствии с градуировочным графиком, мкмоль/см3;

p — коэффициент разведения рабочего раствора препарата по отношению к контрольному (основному) раствору;

t — продолжительность гидролиза, ч;

c — массовая концентрация ферментного препарата в реакционной смеси, г/см3, по формуле (2).

4.5.4 За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, округленное до первого десятичного знака (\overline{X} \pm \Delta) , ед/г, при доверительной вероятности P = 0,95, где \Delta = 0,01\delta \cdot \overline{X} . Границы погрешности \delta = \pm 7% .

4.6 Сходимость и воспроизводимость результатов

4.6.1 Результаты измерений, полученные в условиях повторяемости (сходимости), признаются удовлетворительными, если выполняется условие приемлемости:

|X_{1} - X_{2}| \leq r \cdot 0,01 \cdot \overline{X} , (4)

где X₁ и X₂ - результаты двух параллельных определений, полученные в условиях повторяемости при P = 0,95, ед/г;

\overline{X} — среднеарифметическое двух параллельных определений, ед/г;

r = 5% — предел повторяемости (сходимости).

4.6.2 Результаты измерений, полученные в условиях воспроизводимости, признаются удовлетворительными, если выполняется условие приемлемости

|X_{1} - X_{2}| \leq R \cdot 0,01 \cdot \overline{X} , (5)

где X₁ и X₂ - результаты двух определений, выполненных в двух разных лабораториях, ед/г;

\overline{X} — среднеарифметическое двух определений, выполненных в двух разных лабораториях, ед/г;

R = 10% — предел воспроизводимости.

5 Метод определения ферментативной активности целлюлазы с использованием натриевой соли карбоксиметилцеллюлозы

5.1 Характеристика метода

5.1.1 Метод основан на количественном определении восстанавливающих сахаров, образующихся при действии ферментов целлюлолитического комплекса на натриевую соль карбоксиметилцеллюлозы (Na-КМЦ).

5.1.2 За единицу целлюлолитической активности (1 ед. КМЦлА) принято количество фермента, катализирующего гидролиз Na-КМЦ до образования 1 мкмоля восстанавливающих сахаров (в пересчете на глюкозу) за 1 мин при температуре 50 °C, значении pH 4,7 и продолжительности гидролиза 10 мин.

5.1.3 Содержание восстанавливающих сахаров, образующихся в результате ферментативной реакции, определяют колориметрическим методом с ДНС-реактивом и рассчитывают по градуировочному графику, построенному для глюкозы. Диапазон измерений контролируемого показателя 50 — 500 ед. КМЦлА.

5.2 Средства измерений, вспомогательное оборудование, реактивы

5.2.1 Для определения ферментативной активности целлюлазы с использованием субстрата Na-КМЦ применяют средства измерений, вспомогательное оборудование и реактивы, которые указаны в 4.2.1 - 4.2.3, за исключением хроматографической бумаги, вместо которой применяют Na-КМЦ (содержание основного вещества не менее 96%).

5.2.2 Допускается применение других средств измерений и вспомогательного оборудования с метрологическими и техническими характеристиками, а также реактивов по качеству не ниже указанных.

5.3 Подготовка к анализу

5.3.1 Приготовление ацетатного буферного раствора с молярной концентрацией 0,1 моль/дм3 при pH 4,7, осуществляют в соответствии с 4.3.1.

5.3.2 Приготовление раствора натрия гидроокиси с массовой долей 10,7% осуществляют в соответствии с 4.3.2.

5.3.3 Приготовление реактива ДНС с массовой долей 1,0% осуществляют в соответствии с 4.3.3.

5.3.4 Приготовление стандартного раствора глюкозы с молярной (массовой) концентрацией 5 мкмоль/см3 (900 мкг/см3) и серии разведений стандартного раствора осуществляют в соответствии с 4.3.5.

5.3.5 Градуировочный график соответствия концентраций глюкозы оптическим плотностям в реакции с ДНС-реактивом строят, как указано в 4.3.8.

5.3.6 Для приготовления субстрата, раствора Na-КМЦ массовой долей 1%, в коническую колбу вместимостью 100 см3 наливают около 70 см3 буферного раствора, помещают ее на магнитную мешалку и при включенной мешалке вносят 1,0 г Na-КМЦ. Перемешивание продолжают не менее 40 минут при комнатной температуре до получения однородного коллоидного раствора. Далее субстрат переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят объем до метки буферным раствором.

Субстрат готовят в день проведения анализа.

5.3.7 Приготовление основного и рабочего растворов ферментного препарата осуществляют в соответствии с 4.3.9.

5.4 Проведение анализа

5.4.1 Анализ проводят в двух параллельных определениях.

5.4.2 В три пробирки (две опытные и одну контрольную) вносят по 1 см3 субстрата, закрывают их пробками и термостатируют при (50 +/- 1) °C в течение 5 минут.

5.4.3 В две опытные пробирки вносят по 1 см3 рабочего раствора ферментного препарата. Содержимое пробирок тщательно перемешивают.

5.4.4 Все три пробирки выдерживают при температуре (50 +/- 1) °C в течение 10 минут (с точностью, определяемой по секундомеру).

5.4.5 После проведения гидролиза в две опытные пробирки вносят по 3 см3 реактива ДНС. В третью пробирку (контрольную) добавляют 3 см3 реактива ДНС и 1 см3 рабочего раствора препарата. Смеси тщательно перемешивают и помещают в кипящую водяную баню на 5 мин (с точностью, определяемой по секундомеру), после чего охлаждают до комнатной температуры.

5.4.6 Измеряют оптические плотности опытных и контрольной проб на ФЭК или СФ при длине волны 540 нм в кюветах с толщиной поглощающего свет слоя 10 мм против контрольной пробы на реактивы.

5.4.7 Если значения оптических плотностей опытных проб находятся за пределами рабочей зоны градуировочного графика, то определение активности повторяют с раствором, имеющим большее или меньшее содержание фермента.

5.5 Обработка результатов

5.5.1 Молярную концентрацию глюкозы (в мкмоль/см3) в опытных и контрольном растворах определяют по градуировочному графику.

5.5.2 Целлюлолитическую активность КМЦлА, ед/г, в ферментном препарате вычисляют по формуле

\text{КМЦлА } = \frac{\text{С}_{\text{о}} - \text{С}_{\text{к}}}{t\text{с}} , (6)

где Cо — молярная концентрация глюкозы в опытной пробе, найденная по градуировочному графику, мкмоль/см3;

Cк — молярная концентрация глюкозы в контрольной пробе, найденная по градуировочному графику, мкмоль/см3;

t — продолжительность гидролиза, мин (10 мин);

c — массовая концентрация ферментного препарата в реакционной смеси, г/см3, по формуле

\text{с} = \frac{\text{т}}{VP} ,

где m — масса навески ферментного препарата, г;

V — объем разведения навески при приготовлении основного раствора по 4.3.10.1, см3;

P — разведение основного раствора ферментного препарата для приготовления рабочего раствора по 4.3.10.2;

5.5.3 За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений, округленное до первого десятичного знака (\overline{X} \pm \Delta) , ед/г, при доверительной вероятности P = 0,95, где \Delta = 0,01\delta \cdot \overline{X} . Границы погрешности \delta = \pm 7% .

5.6 Сходимость и воспроизводимость результатов

5.6.1 Результаты измерений, полученные в условиях повторяемости (сходимости), признаются удовлетворительными, если выполняется условие приемлемости

|X_{1} - X_{2}| \leq r \cdot 0,01 \cdot \overline{X} , (7)

где X₁ и X₂ - результаты двух параллельных определений, полученные в условиях повторяемости при P = 0,95, ед/г;

\overline{X} — среднеарифметическое двух параллельных определений, ед/г;

r = 5% — предел повторяемости (сходимости).

5.6.2 Результаты измерений, полученные в условиях воспроизводимости, признаются удовлетворительными, если выполняется условие приемлемости:

|X_{1} - X_{2}| \leq R \cdot 0,01 \cdot \overline{X} , (8)

где X₁ и X₂ - результаты двух определений, выполненных в двух разных лабораториях, ед/г;

\overline{X} — среднеарифметическое двух определений, выполненных в двух разных лабораториях, ед/г;

R = 10% — предел воспроизводимости.