Решение Коллегии Евразийской экономической комиссии от 25.10.2022 № 150

"О внесении изменений в Фармакопею Евразийского экономического союза"

КОЛЛЕГИЯ ЕВРАЗИЙСКОЙ ЭКОНОМИЧЕСКОЙ КОМИССИИ

РЕШЕНИЕ от 25 октября 2022 г. N 150

О ВНЕСЕНИИ ИЗМЕНЕНИЙ В ФАРМАКОПЕЮ ЕВРАЗИЙСКОГО ЭКОНОМИЧЕСКОГО СОЮЗА

В соответствии со статьями 30 и 56 Договора о Евразийском экономическом союзе от 29 мая 2014 года, пунктом 14 Протокола о применении санитарных, ветеринарно-санитарных и карантинных фитосанитарных мер (приложение N 12 к Договору о Евразийском экономическом союзе от 29 мая 2014 года), пунктом 3 статьи 5 Соглашения о единых принципах и правилах обращения лекарственных средств в рамках Евразийского экономического союза от 23 декабря 2014 года и Концепцией гармонизации фармакопей государств - членов Евразийского экономического союза, утвержденной Решением Коллегии Евразийской экономической комиссии от 22 сентября 2015 г. N 119, Коллегия Евразийской экономической комиссии решила:

1. Внести в Фармакопею Евразийского экономического союза, утвержденную Решением Коллегии Евразийской экономической комиссии от 11 августа 2020 г. N 100, изменения согласно приложению.

2. Ввести в действие с 1 апреля 2023 г. общие фармакопейные статьи, предусмотренные пунктом 10 изменений (приложение к настоящему Решению).

3. Настоящее Решение вступает в силу по истечении 180 календарных дней с даты его официального опубликования.

Председатель Коллегии Евразийской экономической комиссии М.МЯСНИКОВИЧ

Приложение к Решению Коллегии Евразийской экономической комиссии от 25 октября 2022 г. N 150

ИЗМЕНЕНИЯ, ВНОСИМЫЕ В ФАРМАКОПЕЮ ЕВРАЗИЙСКОГО ЭКОНОМИЧЕСКОГО СОЮЗА

1. В абзаце четвертом общей фармакопейной статьи 2.1.2.25. слова "статья 2.2.2.36." заменить словами "статья 2.1.2.36.".

2. В общей фармакопейной статье 2.1.4.16. цифры "(600 +/- 5025) °C" заменить на "(600 +/- 25) °C".

3. В общей фармакопейной статье 2.1.6.6. слова "перечисленных в табл. 2.6.6.6.-1" заменить словами "перечисленных в табл. 2.1.6.6.-1".

4. В общей фармакопейной статье 2.1.9.3. рисунок 2.1.9.3.-2 заменить следующим рисунком:

Рисунок 2.1.9.3.-2. - Прибор 2, перемешивающий элемент - лопасть. Размеры в миллиметрах.

5. В нумерации раздела 2.2. "Реактивы, стандартные растворы, буферные растворы" цифры "2.2." заменить на "2.2.1.".

6. В общей фармакопейной статье 2.2.1.1. код "202010001-2019" заменить на "202010001-2022".

7. В общей фармакопейной статье 2.2.1.2. код "202010002-2019" заменить на "202010002-2022".

8. Общую фармакопейную статью 2.3.1.2. с кодом "203010002-2019" заменить на общую фармакопейную статью 2.3.1.2. с кодом "203010002-2022", указанную в пункте 10 настоящих изменений.

9. В общей фармакопейной статье 2.3.5.0. в рисунке 2.3.5.0.-1 слова "Субстанции для фармацевтического применения (2034)" заменить цифрами "2.3.18.0.".

10. Дополнить общими фармакопейными статьями следующего содержания:

2. ОБЩИЕ ФАРМАКОПЕЙНЫЕ СТАТЬИ

2.1 МЕТОДЫ АНАЛИЗА

2.1.2 ФИЗИЧЕСКИЕ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ АНАЛИЗА

201020044-2022

2.1.2.44 Температура каплепадения

Температура каплепадения представляет собой температуру, при которой в условиях, приведенных ниже, первая капля расплавленного испытуемого образца падает из чашки.

Определение температуры каплепадения проводят для образцов, не растирающихся в порошок и плавящихся ниже температуры кипения воды, таких, как жиры, воск, парафин, вазелин, смолы.

При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству применяют метод 1. Замена метода 1 на метод 2 должна быть подтверждена данными по валидации.

МЕТОД 1

Прибор. Для проведения испытания используют прибор, представленный на рисунке 2.1.2.44.-1. Прибор состоит из двух металлических гильз (А и Б), соединенных одна с другой посредством резьбы. Гильза А прикреплена к ртутному термометру. В нижней части гильзы Б с помощью двух уплотнителей Д свободно закреплена металлическая чашка Е. Точное положение чашки определяется фиксаторами Г длиной 2 мм, используемыми также для центровки термометра. Отверстие В в стенке гильзы Б предназначено для выравнивания давления. Отводящая поверхность чашки должна быть плоской, а края выходного отверстия - под прямым углом к поверхности. Нижняя часть ртутного термометра имеет форму и размер, как показано на рисунке 2.1.2.44.-1; пределы измерения термометра от 0 °C до 110 °C, расстояние на шкале в 1 мм соответствует разности температур в 1 °C. Шарик термометра имеет диаметр (3,5 +/- 0,2) мм и высоту (6,0 +/- 0,3) мм.

Рисунок 2.1.2.44.-1. - Прибор для определения температуры каплепадения. Размеры в миллиметрах. А - верхняя металлическая гильза; Б - нижняя металлическая гильза; В - отверстие для уравновешивания давления; Г - фиксаторы; Д - уплотнители; Е - металлическая чашка

Прибор устанавливают по оси пробирки длиной около 200 мм и наружным диаметром около 40 мм.

Прибор прикрепляют к пробирке с помощью пробки, в которую вставлен термометр и которая имеет боковую прорезь. Отверстие чашки должно находиться на расстоянии около 15 мм от дна пробирки. Все устройство погружают в стакан вместимостью около 1 л, заполненный водой. Дно пробирки должно находиться на расстоянии около 25 мм от дна стакана. Уровень воды должен достигать верхней части гильзы А. Для равномерного распределения температуры в стакане используют мешалку.

Методика. Испытуемый образец подготавливают в соответствии с указаниями частной фармакопейной статьи и (или) нормативного документа по качеству. Заполняют чашку до краев испытуемым образцом. Избыток образца удаляют с обеих сторон шпателем. После того, как гильзы А и Б соединены, проталкивают чашку внутрь на ее место в гильзе Б до упора. Удаляют шпателем образец, выдавленный термометром. Прибор помещают в водяную баню, как описано выше. Водяную баню нагревают до температуры примерно на 10 °C ниже предполагаемой температуры каплепадения и устанавливают скорость нагрева около 1 °C/мин. Отмечают температуру падения первой капли. Проводят не менее трех определений, каждый раз с новым образцом. Разность между показаниями не должна превышать 3 °C. За температуру каплепадения принимают среднее значение трех измерений.

МЕТОД 2 - АВТОМАТИЧЕСКИЙ МЕТОД

Прибор. Для проведения испытания используют прибор, представленный на рисунке 2.1.2.44.-2, который состоит из сборного картриджа, включающего держатель, в котором свободно фиксируется чашка с испытуемым образцом, и приемника с горизонтальным просветом, который фиксируется под чашкой. Данный картридж вставляют в блок нагревания. Блок представляет собой металлический цилиндр с цилиндрической щелью вдоль его вертикальной оси, внутри которой помещают сборный картридж. Кроме того, имеется другая, более узкая цилиндрическая вертикальная щель, в которую устанавливают температурный датчик на уровне чашки для проб. Снаружи нагревательного блока располагается электрический нагревательный элемент. Под нагревательный блок устанавливают лампу таким образом, чтобы поток света проходил через просвет в приемник на установленный напротив фотодатчик. Блок нагревания с помощью нагревательного элемента способен поддерживать точно установленную температуру, а также нагреваться медленно с постоянной определенной скоростью после начального изотермического периода.

Рисунок 2.1.2.44.-2. - Пример прибора автоматического определения температуры каплепадения. А - держатель чашки; Б - блок нагревания; В - источник света; Г - щель; Д - сборный картридж; Е - нагревательный элемент; Ж - чашка с испытуемым образцом; 3 - фотодатчик; И - приемник; К - температурный датчик

Методика. Испытуемый образец подготавливают согласно указаниям частной фармакопейной статьи и (или) нормативного документа по качеству и проводят испытание как указано ниже или в соответствии с инструкциями производителя. Избыток образца удаляют с обеих сторон чашки шпателем. Чашку помещают в держатель и присоединяют рукав. Сборный картридж помещают в блок нагревания. На приборе выставляют первоначальные изотермические условия и скорость постепенного нагревания в соответствии с указаниями частной фармакопейной статьи и (или) нормативного документа по качеству. Включают программу температурного режима. Когда первая капля расплавленного образца упадет через щель на дно чашки, тем самым прерывая поток света, сигнал фотодатчика приведет к автоматической регистрации температуры блока нагревания.

Калибровка прибора. Прибор используют в соответствии с инструкциями производителя. В зависимости от использования прибора и испытуемых образцов, регулярно проводят предписанную калибровку и проверку эксплуатационных характеристик системы. Обычно используют сертифицированные стандартные образцы бензойной кислоты и бензофенона. Допускается применение других веществ при условии, что они не проявляют полиморфизм. Калибровку проводят в соответствии с инструкциями производителя или следующим образом. Для каждого из двух сертифицированных стандартных образцов готовят по три чашки и размещают их на чистой поверхности. В каждую чашку помещают небольшое количество сертифицированного стандартного образца и уплотняют стержнем (диаметр около 4,5 мм). Проверяют, чтобы отверстие было полностью заполнено. Наполняют чашку примерно наполовину и уплотняют образцы с помощью стержня (диаметр около 9 мм). Чашку наполняют и уплотняют, при необходимости добавляя образец, пока чашка не будет полностью заполнена.

Температурная программа для бензойной кислоты: начальная температура - 118,0 °C; скорость нагрева - 0,2 °C/мин; конечная температура - 126,0 °C. После установки чашки выдерживают в течение 30 с при температуре 118 °C до начала нагревания.

Температурная программа для бензофенона: начальная температура - 44,0 °C; скорость нагрева - 0,2 °C/мин; конечная температура - 56,0 °C. После установки чашки выдерживают в течение 30 с при температуре 44 °C до начала нагревания.

Проверяют три отдельных результата. Результаты испытания считают достоверными, если полученные значения находятся в пределах +/- 0,3 °C от среднего значения.

Исправленное среднее значение температуры (T2) рассчитывают по формуле:

T1 - F,

где: T1 - средняя температура каплепадения по трем измерениям, в градусах Цельсия;

F - поправка на разницу температур образца и места измерения температуры в нагревательном блоке (ее значение изменяется в зависимости от конструкции прибора автоматического определения температуры каплепадения и представляется производителем).

Принимая в расчет температуру каплепадения (T0) сертифицированного стандартного образца, точность температурной шкалы считается удовлетворительной, если |T2 - T0| не превышает 0,3 °C.

201020045-2022

2.1.2.45 Спектрометрия ядерного магнитного резонанса

Спектрометрия ядерного магнитного резонанса (ЯМР) - аналитический метод, позволяющий исследовать химическую структуру органических молекул по интерпретации их спектров ЯМР по магнитным моментам изотопов 1H, 13C, 19F, 15N, 31P. Спектры ЯМР могут быть использованы для качественных и количественных анализов.

В соответствующих экспериментальных условиях интегрированная интенсивность сигналов ЯМР прямо пропорциональна числу спинов ядер молекулярной группы, ответственной за сигнал. Эти интегралы могут использоваться для количественного анализа.

ОБЩИЕ ПРИНЦИПЫ

При помещении группировки ядер с угловым моментом и магнитным моментом в статическое магнитное поле (B₀) ядра занимают по отношению к оси магнитного поля определенные ориентации, разрешенные в квантовой механике. Эти уровни энергетически различны. Колебательное высокочастотное магнитное поле (B₁), перпендикулярное магнитному полю B₀, вызывает переходы между этими уровнями с полным поглощением энергии. Согласно условию резонанса \omega_{0} = \gamma B_{0} , (где \gamma - гиромагнитное отношение, \omega_{0} - ларморова частота), магнитное поле B₀ или частота \omega_{0} поля B₁ могут изменяться для получения спектра (метод непрерывной волны (МНВ)). В настоящее время излучение B₁ получают при помощи радиочастотного импульса (метод Фурье преобразования). Когерентное излучение, испускаемое при возвращении в исходное состояние, регистрируют в виде затухающей кривой, называемой спадом свободной индукции (ССИ). Последующее Фурье-преобразование дает спектр в области частоты, предоставляя информацию о молекулярной структуре. Дополнительные радиочастотные области применяются во время регистрации сигнала ССИ подавления скалярных взаимодействий (прямая связь) между ядрами (так называемое "распаривание"). Для качественного и количественного анализа жидких или твердых образцов можно применить одно- и многомерные методы.

Важную информацию о структуре вещества получают из следующих спектроскопических параметров, приведенных в таблице 2.1.2.45.-1.

Таблица 2.1.2.45.-1.

Корреляции различных спектральных параметров (например, химический сдвиг и константа спин-спинового взаимодействия, или химические сдвиги различных ядер в пределах одной молекулярной системы) могут быть получены гомо- и гетероядерными двумерными и более многомерными методами. Информацию о времени релаксации T1 и T2, о ядерных эффектах Оверхаузера и кинетике процессов, зависящих от времени, также можно получить с помощью соответствующих экспериментов.

ПРИБОР

ЯМР-спектрометр с высокой разрешающей способностью состоит из следующих частей:

• магнит для создания постоянного магнитного поля;
• термостатируемый датчик с держателем образца, предназначенный для подачи высокочастотного импульса и определения излучения, испускаемого образцом;
• электронное устройство для создания мощных высокочастотных импульсов, регистрации и преобразования сигнала ССИ в цифровую форму; это устройство также поддерживает стабильность электроники прибора;
• устройства сбора и обработки данных (компьютер);

также включает:

• проточную кювету для проведения жидкостной хроматографии ЯМР или проточно-инъекционного анализа;
• систему для создания импульсного градиента магнитного поля ЯМР.

Сильное магнитное поле генерируется катушкой сверхпроводимости в сосуде Дьюара, заполненного жидким гелием. Датчик, как правило, содержит образец в пробирке с внешним диаметром 5 мм или в проточной кювете, и соединен радиочастотными кабелями с электронным блоком, настроенным на частоту 1H-ядер и изотопов X-ядер. Необходимыми являются дополнительные устройства для настройки и регулировки электронных контуров; кроме того, часто используют термостатирование образцов.

Следует подтвердить надлежащее функционирование ЯМР-спектрометра. Для этого используют соответствующие испытания, включающие, как правило, измерение ширины спектральной линии на полувысоте определенных пиков при определенных условиях, отношение сигнал/шум (S/N) для стандартных смесей, интенсивность импульса (измеренная как 90° ширины импульса), и воспроизводимость импульса. Все изготовители приборов предоставляют спецификации и протоколы измерения указанных параметров для определенных комбинаций прибор/датчик, и необходимо проводить проверку соответствия этим спецификациям.

ЯМР С ФУРЬЕ-ПРЕОБРАЗОВАНИЕМ (ЯМР-ФП)

Как правило, в современных спектрометрах используется принцип Фурье-преобразования: после возбуждения образца высокочастотным импульсом соответствующей частоты (v), амплитуды (B1) и продолжительности (\tau_{p}) и последующей короткой паузы (fd) (время восстановления чувствительности приемника), усиленный аналоговый сигнал ССИ регистрируют в течение определенного времени (tac) и переводят в цифровую форму аналогово-цифровым преобразователем (АЦП), результаты сохраняют в памяти спектрометра. Выходной сигнал усиливается перед оцифровкой для максимального повышения чувствительности, не перегружая АЦП. При наблюдении за X-ядрами стандартный эксперимент включает, при необходимости, широкополосное 1H распаривание (возбуждение) всех протонов. Для увеличения отношения сигнал/шум, многократные сигналы ССИ могут быть когерентно накоплены и суммированы. При Фурье-преобразовании данных этого временного интервала получают спектр области частот.

ПАРАМЕТРЫ

Следующие параметры влияют на результат эксперимента Фурье-преобразования, и должны контролироваться.

Ширина импульса (\tau_{p}) . Импульс возбуждения направлен вдоль оси x так называемой рамки вращения, его продолжительность (или "ширина") определяет угол переворота и, таким образом, интенсивность резонансного сигнала:

\theta = \gamma' \cdot B_{1} \cdot \tau_{p} , (1)

где: \tau_{p} - продолжительность ("ширина") импульса;

\theta - угол поворота рамки вращения;

\gamma' - гиромагнитное отношение.

M_{y} = M_{\text{о}} \cdot sin\theta , (2)

где: M - наблюдаемая намагниченность;

Mо - общая намагниченность;

\theta - угол поворота рамки вращения.

Наблюдаемая намагниченность максимальна при \theta = 90^{\circ} . Продолжительность импульса должна быть короткой, чтобы гарантировать, что все сигналы возбуждения в спектральной ширине имеют одинаковую интенсивность. Намагниченность затухает вследствие процессов релаксации.

Длительность паузы (td). Пауза - время между окончанием подачи импульса и началом сбора данных, необходимое по техническим причинам, поскольку ее длительность может влиять на интенсивность сигнала и фазу пика. Быстро затухающие сигналы (дающие начало широким спектральным линиям) уменьшаются в интенсивности больше, чем медленно затухающие сигналы (которые дают начало узким спектральным линиям).

Время сбора данных (tac). Время сбора данных связано со спектральной шириной (то есть всей наблюдаемой областью) и количеством точек цифрового разрешения, собранных во время обнаружения сигнала.

t_{ac} = \frac{DP}{2SW} , (3)

где: SW - спектральная ширина;

DP - количество точек цифрового разрешения.

Максимальная интенсивность сигнала и отношение сигнала к шуму будут достигнуты, если время сбора данных приблизительно равняется 1,2/(\pi v_{1/2}) , где v1/2 - полная ширина на полувысоте, но для минимизации искажения сигнала эта величина должна быть более 5/(\pi v_{1/2}) .

Время повторения (tr). Спин-решеточная релаксация влияет на время, требуемое для спиновой системы, чтобы прийти в равновесие после импульса. Релаксация может быть уменьшена при помощи специальных реактивов. В количественном анализе используемое время повторения должно устанавливаться относительно спин-решеточной релаксации и угла поворота рамки вращения, во избежание эффектов насыщения.

Усиление приемника. Аналоговый сигнал, детектируемый датчиком, усиливают до оцифровки и хранения. Усиление сигнала должно быть отрегулировано либо автоматически, либо вручную, чтобы сигнал не перегружал АЦП, что может вызывать в свою очередь искажение сигнала, и позволит оцифровывать случайный шум, произведенный при исследовании (то есть быть отличным от нуля).

ОПТИМИЗАЦИЯ ПАРАМЕТРОВ СБОРА И ОБРАБОТКИ ДАННЫХ ПРИ КОЛИЧЕСТВЕННОМ АНАЛИЗЕ

Помимо параметров сбора данных, интенсивность сигнала зависит еще от нескольких параметров. После сбора достаточного количества циклов сканирования, сводный сигнал ССИ преобразовывается с помощью Фурье-преобразования. Для достоверного количественного определения должны быть оптимизированы следующие параметры.

Цифровое разрешение. Цифровое разрешение - частотное разделение между измеренными точками. Обработанный сигнал должен иметь не менее 5 измеренных точек выше полувысоты интегрируемых сигналов. Для улучшения цифрового разрешения перед преобразованием к концу экспериментальной ССИ могут быть прибавлены дополнительные точки нулевой интенсивности ("нулевое заполнение").

Отношение сигнал/шум. Это отношение между интенсивностью (высотой пика) определенного сигнала в ЯМР-спектре и случайных колебаний, которые обычно измеряются в области спектра, который не содержит сигналов от анализируемого вещества. Низкое значение отношения сигнал/шум ограничивает точность интегрирования пика и количественных определений. При отношении сигнал/шум равным или более 150:1 стандартное относительное отклонение при интегрировании пика может быть менее 1%. В программном обеспечении современных спектрометров имеются алгоритмы по определению отношения сигнал/шум соответствующих пиков. При анализе разбавленных растворов получить достаточно высокое отношение сигнал/шум довольно трудно, особенно при детектировании ядер, отличных от 1H. Способы увеличения отношения сигнал/шум включают в себя:

• увеличение количества суммируемых измерений (n), поскольку отношение сигнал/шум увеличивается с увеличением \sqrt{n} ;
• использование экспоненциального умножения сигнала ССИ перед Фурье-преобразованием: экспоненциальный коэффициент умножения должен быть в зоне полной пиковой ширины на полувысоте;
• использование спектрометров с более высоким постоянным магнитным полем (B0), так как отношение сигнал/шум пропорционально B_{0}^{3/2} ;
• использование цифрового фильтра для уменьшения шума;
• использование датчиков, которые максимизируют фактор заполнения;
• использование криодатчиков, снижающих тепловые помехи.

Область интегрирования. Интенсивность ЯМР-сигналов получают интегрированием квази-аналогового сигнала или с помощью ступенчатого графика, или более точным интегрированием отдельных линий и цифровым представлением данных. При исследовании жидких образцов получают ЯМР-сигналы в виде линий лоренцевой формы. При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству или когда происходит перекрывание пика, для испытуемого пика и пика сравнения должен использоваться одинаковый диапазон интегрирования, выраженный в виде кратного числа полной ширине на полувысоте пика.

Динамический диапазон. Динамический диапазон аналогово-цифрового преобразователя (АЦП) определяет минимальную линию интенсивности, которую можно наблюдать или количественно определить, при интегрировании двух сигналов с той же самой шириной спектральной линии. 16-битовый АЦП позволяет идентифицировать сигнал интенсивностью 0,003% относительно сильного сигнала, полностью заполняющего динамический диапазон АЦП.

ЯМР СПЕКТРОСКОПИЯ ОБРАЗЦОВ В РАСТВОРАХ

Большинство ЯМР исследований проводят на разбавленных растворах (приблизительно 1%) испытуемого образца в соответствующем растворителе, к которому может быть прибавлен в известной концентрации подходящий стандарт для калибровки химического сдвига.

Растворители. Растворитель должен растворять испытуемый образец без дальнейшего взаимодействия, если иное не указано в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству. Для минимизации интенсивных сигналов растворителей используют полностью дейтерированные растворители (дейтерия оксид P, дейтерированный хлороформ P, дейтерированный диметилсульфоксид P, дейтерированный ацетон P, дейтерированный метанол P и т.д.). Атомы растворителя дают сигналы, которые легко идентифицируются по их химическому сдвигу, и могут использоваться для калибровки оси химического сдвига (вторичный стандарт).

Сравнение. Спектральная характеристика, наиболее зависящая от химического окружения атома в молекуле, называется химическим сдвигом, обозначается буквой \delta и измеряется в миллионных долях (ppm). Химический сдвиг резонансной частоты для ЯМР активного ядра X измеряется в миллионных долях (ppm), как разность между резонансной частотой этого ядра и резонансной частотой внутреннего стандарта сдвига, выраженная в герцах, деленная на основную рабочую частоту спектрометра, в мегагерцах, при данном постоянном магнитном поле:

\delta_{X,\text{образец}} = \frac{v_{X,\text{образец}} - v_{X,\text{сравнение}}}{v_{\text{прибор}}} , (4)

где: \delta_{X,\text{образец}} - химический сдвиг резонансной частоты для ЯМР активного ядра X, в ppm;

vX,образец - резонансная частота активного ядра X, в герцах;

vX,сравнение - резонансная частота внутреннего стандарта сдвига, в герцах;

vприбор - основная рабочая частота спектрометра, в мегагерцах.

Условно принято, что точный химический сдвиг устанавливается по 1H резонансной частоте тетраметилсилана P (ТМС), и обозначается как \delta_{TMC} = 0ppm . Установив шкалу сдвигов 1H относительно ТМС можно вычислить точную частоту любого другого X резонанса, и откалибровать масштаб его химического сдвига. Частоту (вторичного) стандартного образца при \delta_{X} = 0ppm рассчитывают по 1H частоте ТМС и табличному значению отношения частоты, определенной для изотопа, к частоте 1H в ТМС:

v_{X,\text{сравнение}} = v_{H,\text{ТМС}} \cdot \Xi_{X,\text{сравнение}} , (5)

где: vX,сравнение - частота (вторичного) стандартного образца при \delta_{X} = 0ppm ;

VH,ТМС - 1H частота тетраметилсилана;

SX,сравнение - табличное значение отношения частоты, определенной для изотопа, к частоте 1H в тетраметилсилане.

Стандартные образцы при \delta_{X} = 0ppm и соответствующие значения \Xi_{X,\text{сравнение}} приведены в таблице 2.1.2.45.-2.

Таблица 2.1.2.45.-2.

<1> Химический сдвиг зависит от значения pH.

<2> DSS - натрия 2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфонат.

На практике химические сдвиги X сравнивают, непосредственно используя соответствующий стандарт. В 1H и 13C ЯМР главным образом используется внутренний стандарт, который при исследовании непосредственно прибавляют к испытуемому образцу. В 15N, 19F и 31P ЯМР часто используется внешний стандарт, когда образец и стандарт находятся в отдельных коаксиальных цилиндрических пробирках.

Стабилизация. Для предотвращения смещения спектра во времени выполняют процедуру стабилизации (дейтериевая стабилизация). Для этого, если иное не указано в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству, используют сигнал 2H (дейтерия), вызываемый дейтерированными растворителями.

КАЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ

Качественные ЯМР спектры используются как испытания на подлинность, при котором 1H или 13C спектр испытуемого образца сравниваются со спектром стандартного образца или, реже, с опубликованным стандартным спектром. Спектры стандартных и испытуемых образцов должны быть получены с использованием тех же самых методик и условий проведения испытания. Пики в этих 2 спектрах или характеристичных областях спектров должны совпадать по положению, интенсивности и мульти-плетности. В соответствующих случаях может быть проведено математическое сопоставление, например, вычисление коэффициента корреляции. При отсутствии стандартного образца используют рабочий стандартный образец, идентичность которого была подтверждена альтернативными методами, или путем подтверждения того, что ЯМР спектр полностью совпадает с заявленной структурой материала.

КОЛИЧЕСТВЕННЫЙ АНАЛИЗ

Интенсивность сигнала в испытании ЯМР как правило представляет собой интегрированную площадь под кривой измеренного сигнала. Высота сигнала может быть мерой интенсивности только при одинаковом значении полной ширины на полувысоте и одинаковой мульти-плетности двух сигналов. В условиях практически полной релаксации между регистрируемыми сигналами интенсивность сигнала является истинной мерой количества ядер, ответственных за соответствующий сигнал:

IA = KS · NA IA = KS · NA, (6)

где: IA - интенсивность сигнала;

NA - количество ядер, ответственных за сигнал;

KS - константа, включающая фундаментальные постоянные, свойства образца и параметры приемника; может не учитываться в случаях, когда интенсивности сигналов сопоставимы и можно получить прямую зависимость между количеством ядер в двух сравниваемых структурных группах A и B:

\frac{I_{A}}{I_{B}} = \frac{N_{A}}{N_{B}} , (7)

где: Ni - количества ядер, принадлежащих различным структурным группам одной молекулы.

Количества ядер, принадлежащих различным структурным группам одной молекулы, представляют собой небольшие целые числа. Измеренные значения округляют до целых чисел. Однако правильное функционирование блока сбора и обработки данных легко проверяется путем сравнения точной интенсивности в пределах спектра любого подходящего органического соединения известной структуры.

Помимо того, что интенсивность сигналов, полученных от каждого компонента в смеси, связана друг с другом небольшими целыми числами, относительные молярные количества этих компонентов могут быть измерены сравнением нормализованных интенсивностей резонансов различных компонентов. Молярное отношение двух компонентов смеси вычисляют с помощью следующего уравнения:

\frac{n_{A}}{n_{B}} = \frac{I_{A}}{I_{B}} \cdot \frac{N_{B}}{N_{A}} . (8)

Результаты определения являются достоверными только в случаях, когда структуры молекул, для которых определены IA и IB, известны (или, по крайней мере, известны значения N для контролируемых групп). Определения проводят, используя метод внутреннего стандарта или метод нормализации пиков.

Метод внутреннего стандарта. Массу образца A можно определить, если к раствору в качестве стандарта интенсивности прибавляют известную массу вещества B с известным его процентным содержанием. Уравнение (8) может быть преобразовано в уравнение (9):

m_{A} = \frac{I_{A}}{I_{B}} \cdot \frac{N_{B}}{N_{A}} \cdot \frac{M_{A}}{M_{B}} \cdot m_{B} \cdot \frac{P_{B}}{100} , (9)

где: Mi - молекулярные массы;

mA - масса образца A;

mB - известная масса образца B;

PB - чистота образца B, выраженная в процентах.

Стандарт интенсивности должен быть тщательно выбран; он должен быть полностью растворим в растворителе, используемом для образца, должен производить лишь небольшое количество сигналов, и у "контролируемой группы" должен быть сигнал в пустой спектральной области. Для этих целей рекомендуется выбирать соединение с высокой чистотой и с относительно высокой молекулярной массой.

Метод внутренней нормализации. Относительное содержание компонентов в смеси, степень замещения в структурно-измененном полимере или количество примеси можно определить путем сравнения относительных интенсивностей полученных резонансов.

Методика должна быть валидирована в отношении отсутствия наложения соответствующих сигналов. Когда в образце присутствуют вещества с не четко установленной структурой или молекулярной массой (например, эмульгатор), прибавление известного количества этого материала в пробирку для ЯМР позволяет построить калибровочную кривую.

МЕТОД

Подготовка образца. Испытуемый образец растворяют в растворителе, к которому может быть прибавлен соответствующий стандартный образец для калибровки химического сдвига, как указано в частной фармакопейной статье. Для количественного анализа растворы не должны содержать нерастворенных частиц. При некоторых количественных определениях может потребоваться прибавление внутреннего стандарта для сравнения интегрированных резонансов испытуемого и стандартного образцов. Соответствующие стандартные образцы и их концентрации указаны в частных фармакопейных статьях. В других количественных определениях результат получают путем сравнения относительной интенсивности двух или всех резонансов, полученных при исследовании образца. После помещения образца в пробирку и укупорки, образец вводят в магнит ЯМР установки, устанавливают параметры испытания и проводят измерения. Основные параметры испытания приводятся в частных фармакопейных статьях.

Процедура измерения. Уравновешивают образец в датчике и регулируют прибор для получения наиболее оптимальных условий резонанса и максимального отношения сигнал/шум путем подбора настройки датчика для данного объема образца для обеспечения максимальной однородности магнитного поля во всем объеме испытуемого образца (процедура "шиммирования"). Параметры настройки записывают или сохраняют в компьютере. Условия испытания могут включать выполнение многократных последовательных циклов "импульс - сбор данных - пауза", и отдельные ССИ сигналы суммируются в памяти компьютера, с усреднением уровня шума. Когда соответствующий уровень отношения сигнал/шум достигнут, ССИ сохраняют и спектр области частот получают путем Фурье-преобразования суммированных ССИ сигналов.

ЯМР СПЕКТРОМЕТРИЯ ОБРАЗЦОВ В ТВЕРДОМ СОСТОЯНИИ

Анализ образцов в твердом состоянии может быть выполнен с помощью специально оборудованных ЯМР спектрометров. Определенные технические процедуры обеспечивают выделение отдельных линий для определенных положений атомов, а также позволяют использовать ЯМР для оценки неорганических материалов.

Одна из таких процедур - быстрое вращение (4 - 30 кГц) порошкообразного образца в роторе (внешний диаметр около 4 мм) находящегося под углом 54,7° ("магический угол") к оси магнитного поля B0. Этот способ называется вращением под магическим углом. Второй эффективный способ - силовое распаривание, и третий способ - перенос поляризации от легковозбудимых ядер к менее поляризуемым ядрам, то есть кросс-поляризация. Комбинация таких процедур позволяет получить спектры с высоким разрешением, содержащие большое количество информации о химических и структурных характеристиках твердых стекловидных тел, веществ в аморфном состоянии, кристаллов керамической, полимерной или минеральной природы.

При использовании ЯМР спектрометрии для оценки образца в твердом состоянии, полное описание процедуры приводят в частной фармакопейной статье.

201020046-2022

2.1.2.46 Термический анализ

Данная общая фармакопейная статья распространяется на группу методов термического анализа (МТА), при помощи которых определяется зависимость различных физических свойств веществ от температуры. Обычно в большинстве используемых методов определяют изменение энергии или массы испытуемого образца.

Эти методы имеют различные применения:

• определение фазовых изменений;
• определение изменений в химическом составе;
• определение чистоты.

К МТА относят термогравиметрию (ТГ), термометрическое титрование (ТТ), дифференциальный термический анализ (ДТА), дифференциальную сканирующую калориметрию (ДСК), дериватографию (ДГ), термомикроскопию (ТМ).

МТА, как правило, не требуют больших количеств веществ, непродолжительны по времени испытания. В случае применения МТА, в частных фармакопейных статьях и (или) нормативных документах по качеству следует указывать параметры, необходимые для корректного выполнения методики, например: скорость и температуру нагревания, инертный газ и скорость его потока.

ТЕРМОГРАВИМЕТРИЯ

Термогравиметрия (ТГ) или термогравиметрический анализ (ТГА) представляет собой метод, при помощи которого регистрируют изменение массы испытуемого образца от программированного изменения температуры.

Прибор. Основными составляющими частями прибора являются: устройство для нагревания или охлаждения образца в соответствии с заданной температурной программой, камера для образца с контролируемой средой, электронные весы и устройства для регистрации.

Проверка температурной шкалы. Поверку температурного датчика, находящегося близко к образцу или контактирующего с ним, проводят, используя температуру фазового перехода второго рода (точка Кюри) ферромагнитного вещества (например, никеля). В случае прибора, позволяющего одновременно проводить ТГ/ТГА и ДТА или ДСК, могут быть использованы те же сертифицированные (аттестованные) стандартные образцы, что и для ДТА и ДСК, например, индий, олово и (или) цинк.

Калибровка электронных весов. Необходимое количество подходящего сертифицированного (аттестованного) стандартного вещества (например, СО ФЕАЭС кальция оксалата моногидрата) помещают в держатель и регистрируют его массу. Устанавливают скорость нагревания соответственно инструкции изготовителя (например, 5 °C/мин) и начинают повышение температуры. Термогравиметрическую кривую регистрируют в виде графика: величины температуры или времени указывают по оси абсцисс по возрастанию значений слева направо; показания массы - по оси ординат по возрастанию значений снизу вверх. При температуре около 250 °C повышение температуры останавливают. На графике измеряют расстояние между начальным и конечным плато масса-температура или плато масса-время, что соответствует изменению массы образца. Полученную величину потери в массе аттестованного стандартного вещества сопоставляют с величиной, указанной на маркировке.

Методика. Для испытуемого образца проводят ту же процедуру в условиях, указанных в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству. Потерю в массе испытуемого образца определяют, измеряя расстояние между начальным и конечным плато на гравиметрической кривой, и выражают в процентах (\Delta\text{м }/\text{м}) .

При регулярном использовании прибора периодически проводят калибровку и проверку температурной шкалы. В противном случае эти операции проводят перед каждым использованием.

Так как условия проведения испытания являются критичными, для каждого измерения отмечают следующие параметры: давление или скорость потока; состав газа, масса образца, скорость нагревания, диапазон температуры и предварительная обработка образца, включая любой изотермический период.

ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНАЯ СКАНИРУЮЩАЯ КАЛОРИМЕТРИЯ

ДСК является методом, который используется для демонстрации энергетических явлений, происходящих при нагревании (или охлаждении) вещества (или смеси веществ) и для определения изменений в энтальпии и удельной теплоемкости, а также температур, при которых эти изменения происходят.

Данный метод используют для установления различий в количестве теплоты (относительно температуры), выделенной или поглощенной испытуемым образцом и с ячейкой сравнения в зависимости от температуры. Существует 2 типа приборов для ДСК: приборы, использующие компенсацию энергии для удерживания нулевой разницы температуры между испытуемым образцом и ячейкой сравнения; приборы, поддерживающие постоянную скорость нагревания и определяющие температурный дифференциал как разность в тепловом потоке между испытуемым образцом и ячейкой сравнения.

Прибор. Для ДСК с компенсацией энергии используют прибор, состоящий из печи, имеющей держатель образцов с испытуемой ячейкой и ячейкой сравнения. Прибор для ДСК с тепловым потоком состоит из печи, содержащей единственную ячейку с держателем образца для испытуемого тигля и тигля сравнения.

К прибору присоединяют: устройство для программирования температуры, температурный детектор (детекторы) и регистрирующую систему, подсоединенную к компьютеру. Измерения проводятся в контролируемой среде.

Калибровка прибора. Прибор калибруют на предмет изменения температуры и энтальпии с использованием сертифицированных (аттестованных) стандартных образцов.

Калибровка температуры. Калибровка температуры может быть проведена с использованием сертифицированных (аттестованных) стандартных образцов, имеющих характеристическое теплофизическое свойство, такое как температура плавления чистых металлов или органических веществ или температура фазового перехода кристаллических неорганических солей или оксидов. Обычно для калибровки используют значения температуры плавления индия, олова и (или) цинка.

Калибровка количества теплоты. Для точной оценки изменения количества теплоты (изменение энтальпии) испытуемого образца, вызванного определенным физическим изменением, происходящим при изменении температуры, необходимо проводить калибровку прибора с использованием подходящих сертифицированных (аттестованных) стандартных образцов. По аналогии с калибровкой температуры калибровка количества теплоты может быть выполнена с использованием сертифицированных (аттестованных) стандартных образцов с известными установленными значениями изменения энтальпии, вызванного физическими изменениями, такими как плавление чистых металлов и (или) органических веществ или фазовый переход кристаллических неорганических солей. Обычно для калибровки используют значения теплоты плавления индия, олова и (или) цинка.

Проведение испытания. В подходящий тигель взвешивают испытуемый образец в количестве, указанном в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству, и помещают в держатель образца. Пустой тигель помещают в держатель для тигля сравнения. Устанавливают температуру начала и конца испытания и скорость нагрева, указанные в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству.

Начинают испытание и регистрируют кривую ДСК с указанием величины температуры или времени по оси абсцисс (по возрастанию значений слева направо) и изменения энергии по оси ординат (уточняют, процесс эндотермический или экзотермический).

Температура, при которой происходит явление (начальная температура), соответствует точке пересечения (A) продолжения базовой линии и касательной к точке наибольшего наклона (точке перегиба) кривой (см. рисунок 2.1.2.46.-1). Конечная температура теплового явления соответствует пику на кривой.

Рисунок 2.1.2.46.-1. - Термограмма

Значение энтальпии пропорционально значению площади под кривой, ограниченной базовой линией; коэффициент пропорциональности находят путем измерения теплоты плавления известного вещества (например, индия) при тех же условиях проведения испытания.

Каждая термограмма сопровождается следующими данными: условия испытания, запись последней калибровки, масса испытуемого образца, идентификация (включая тепловые изменения) образца, емкость (контейнер), среда (состав, скорость потока, давление), направление и скорость температурных изменений, чувствительность прибора и регистрирующего устройства.

ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ

Фазовые изменения. Определение температуры, изменения теплоемкости и энтальпии при фазовых изменениях, происходящих с веществом в зависимости от температуры. В таблице 2.1.2.46.-1 приведены возможные наблюдаемые переходы.

Таблица 2.1.2.46.-1.

Изменения химического состава. Измеряя теплоту и температуру реакции при данных условиях, определяют, например, кинетику разложения или десольватацию.

Использование для построения диаграмм фазового равновесия. Построение диаграмм фазового равновесия для твердых смесей. Создание фазовой диаграммы может быть важным этапом при предварительной разработке и оптимизации процесса лиофилизации.

Определение чистоты. Измерение теплоты плавления и температуры плавления с помощью ДСК делает возможным определение содержания примесей в веществе по одной диаграмме, с использованием нескольких миллиграмм образца, и без необходимости проведения повторных точных измерений истинной температуры.

Теоретически, плавление полностью чистого кристаллического вещества при постоянном давлении характеризуется теплотой плавления в бесконечно узком диапазоне, соответствующем температуре плавления. Расширение этого диапазона является чувствительным индикатором присутствия примесей. Таким образом, при испытании образцов одного и того же вещества с содержанием примесей, отличающимся на несколько десятых процента, получают визуально отличающиеся друг от друга термические диаграммы (см. рисунок 2.1.2.46.-2).

Рисунок 2.1.2.46.-2. - Термограмма вещества в зависимости от чистоты

Определение молярной чистоты с помощью ДСК основано на использовании математического приближения интегральной формы уравнения Вант-Гоффа применительно к концентрациям (не к активностям) в бинарной системе [In(1 - x_{2}) = - x_{2}\text{и }T \cdot T_{0} \approx T_{0}^{2}] . Для небольших содержаний примесей (x2 << 1) и для значений температуры, близких к температуре плавления, уравнение может быть представлено, как приведено ниже, где температура образца и молярная доля примеси являются переменными:

T = T_{0} - \frac{RT_{0}^{2}}{\Delta H_{f}} \cdot x_{2} , (1)

где: T - температура образца, в кельвинах

T0 - температура плавления химически чистого вещества, в кельвинах;

R - газовая постоянная для идеальных газов, в джоуль · кельвин-1 · моль-1;

\Delta H_{f} - молярная теплота плавления вещества, в джоуль · моль-1

x2 - молярная доля примеси, то есть число молекул примеси, разделенное на общее число молекул в жидкой фазе (или в расплавленной фазе) при температуре T (выраженной в кельвинах).

Таким образом, определение чистоты с помощью ДСК ограничено обнаружением примесей, образующих эвтектические смеси с основным веществом и присутствующих в испытуемом образце с молярной долей менее 2%.

Данный метод не применяют для:

• аморфных веществ;
• сольватов или полиморфных соединений, которые нестабильны в пределах, используемых при испытании температур;
• примесей, образующих твердые растворы с основным веществом;
• примесей, которые нерастворимы в жидкой фазе или в расплаве основного вещества.

Во время нагревания испытуемого образца примеси полностью плавятся при температуре эвтектической смеси. Выше этой температуры твердая фаза содержит только чистое вещество. Так как температура постепенно увеличивается от температуры эвтектической смеси до температуры плавления чистого вещества, молярная доля примеси в жидкой фазе постоянно падает по причине увеличения количества расплавленного чистого вещества. Для всех температур выше эвтектической точки:

x_{2} = \frac{1}{F} \cdot x_{2}^{*} , (2)

где: F - расплавленная доля анализируемого образца;

x_{2}^{*} - молярная доля примеси в анализируемом образце.

Если образец расплавлен полностью, то F = 1 и x_{2} = x_{2}^{*} .

При объединении уравнений (1) и (2) получается следующее выражение:

T = T_{0} - \frac{RT_{0}^{2}}{\Delta H_{f}} \cdot \frac{1}{F} \cdot x_{2}^{*} .

Значение теплоты плавления получают путем интегрирования пика плавления.

Температура плавления чистого вещества экстраполируется из графика зависимости 1/F от температуры, выраженной в кельвинах. Наклон графика, при необходимости полученного после линеаризации, соответствующий RT_{0}^{2} \frac{x_{2}^{*}}{\Delta H_{f}} , позволяет определить значение молярной доли примеси в анализируемом образце.

Молярная доля примеси в анализируемом образце, умноженная на 100, дает молярную долю всех эвтектических примесей в процентах.

201020047-2022

2.1.2.47 Потенциометрическое определение концентрации ионов с использованием ионоселективных электродов

Теоретически электродный потенциал (E) ионоселективного электрода находится в линейной зависимости от логарифма активности данного иона, что выражается уравнением Нернста:

E = E_{0} + 2,303 \frac{RT}{z_{i}F} lga_{i} ,

где: E0 - стандартный электродный потенциал используемого электрода;

R - универсальная газовая постоянная;

T - абсолютная температура;

F - число Фарадея;

zi - величина заряда иона с обозначением его знака;

ai - активность иона.

При постоянной ионной силе выполняется уравнение:

E = E_{0} + \frac{k}{z_{i}} lgfC_{i} ,

где: Ci - молярная концентрация иона;

f - коэффициент активности (ai = f · Ci);

k - \frac{RT}{F} .

Если: E_{0} + \frac{k}{z_{i}} lgf = E_{0}\prime\text{и }b = \frac{k}{z_{i}} , где b - наклон калибровочной кривой электрода (наклон электродной функции), в таком случае выполняется уравнение:

E = E0' + blgCi, и для -lgCi = pCi: E = E0' - bpCi.

Потенциометрическое определение концентрации ионов проводят путем измерения разницы потенциалов между двумя подходящими электродами, погруженными в испытуемый раствор; индикаторный электрод является селективным по отношению к определяемому иону, другой является электродом сравнения.

Прибор. Используют вольтметр, позволяющий выполнять измерения с точностью 0,1 мВ, с входным сопротивлением в 100 раз превышающим сопротивление используемых электродов.

В качестве ионоселективных электродов используют преимущественно электроды с кристаллической или некристаллической мембраной или с твердой основой (например, стеклянные электроды), или электроды с заряженными (положительно или отрицательно) или с незаряженными подвижными носителями, или сенсибилизированные электроды (ферментные электроды, газ-индикаторные электроды). Электродом сравнения обычно является хлорсеребряный электрод с подходящими соединяющими инертными жидкостями, исключающими их перемешивание.

Методика. Измерения проводят при постоянной температуре с точностью +/- 0,5 °C, учитывая изменение наклона электродной функции электрода в зависимости от температуры (см. таблицу 2.1.2.47.-1).

Таблица 2.1.2.47.-1. - Значения k при различных температурах

Ионную силу и, если необходимо, pH испытуемого раствора корректируют буферными растворами, указанными в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству; для уравновешивания электрод погружают в испытуемый раствор, который медленно перемешивают с постоянной скоростью, и регистрируют установившееся показание прибора.

Если электродная система используется часто, то регулярно проверяют воспроизводимость и стабильность сигнала, линейность калибровочной кривой или расчетного алгоритма в пределах концентраций испытуемого раствора, если нет, то проводят проверку перед каждой серией измерений.

Показания прибора считают линейными, если наклон калибровочной кривой приблизительно равен отношению:

\frac{k/z_{i}}{pC_{i}} .

МЕТОД 1 (МЕТОД КАЛИБРОВОЧНОЙ КРИВОЙ)

Последовательно измеряют не менее трех раз потенциалы не менее трех растворов сравнения в диапазоне ожидаемой концентрации испытуемого раствора. Рассчитывают уравнение калибровочной кривой или строят график зависимости среднего значения потенциала от соответствующего ему значения концентрации определяемого иона, выраженного как -lgCi или pCi.

Испытуемый раствор готовят в соответствии с указаниями частной фармакопейной статьи и (или) нормативного документа по качеству; три раза измеряют потенциал и рассчитывают концентрацию определяемого иона по среднему значению потенциала, используя калибровочную кривую.

МЕТОД 2 (МЕТОД МНОГОКРАТНЫХ СТАНДАРТНЫХ ДОБАВОК)

Испытуемый раствор готовят в соответствии с указаниями частной фармакопейной статьи и (или) нормативного документа по качеству. Измеряют при установившемся равновесии потенциал в объеме этого раствора с неизвестной концентрацией определяемого иона. К известному объему испытуемого раствора не менее трех раз последовательно прибавляют объем раствора сравнения, незначительный в сравнении с объемом испытуемого раствора (не более 0,01 от объема испытуемого раствора), с известной концентрацией, значения которой находятся в пределах линейной части калибровочной кривой. После каждого прибавления измеряют потенциал и рассчитывают разность потенциалов \Delta E между измеряемым потенциалом и потенциалом при установившемся равновесии. Величина разности потенциалов связана с концентрацией определяемого иона уравнением:

\Delta E = blg(1 + \frac{C_{S}V_{S}}{C_{T}V_{T}})

или

10^{\frac{\Delta E}{b}} = 1 + \frac{C_{S}V_{S}}{C_{T}V_{T}} ,

где: VT - объем испытуемого раствора;

CT - концентрация определяемого иона в испытуемом растворе;

VS - объем прибавляемого раствора сравнения;

CS - концентрация определяемого иона в растворе сравнения;

b - наклон электродной функции, установленный экспериментально при постоянной температуре путем измерения разности потенциалов, полученной при измерении двух растворов сравнения, концентрации которых отличаются в 10 раз и находятся в пределах линейной части калибровочной кривой.

Строят график зависимости 10^{\frac{\Delta E}{b}} (ось ординат) от объема прибавляемого раствора сравнения (ось абсцисс) и экстраполируют полученную линию до пересечения с осью абсцисс. В точке пересечения концентрацию определяемого иона в испытуемом растворе рассчитывают по формуле:

C_{T} = \frac{C_{S}V_{S}}{V_{T}} .

МЕТОД 3 (МЕТОД ОДНОКРАТНОЙ СТАНДАРТНОЙ ДОБАВКИ)

К известному объему испытуемого раствора, приготовленного в соответствии с указаниями частной фармакопейной статьи и (или) нормативного документа по качеству, прибавляют объем раствора сравнения известной концентрации определяемого иона, находящейся в линейной части калибровочной кривой. Параллельно в тех же условиях готовят контрольный раствор. Потенциалы испытуемого раствора и контрольного раствора измеряют не менее трех раз до прибавления и после прибавления раствора сравнения. Рассчитывают концентрацию определяемого иона, используя уравнение и учитывая контрольный раствор:

C_{T} = \frac{C_{S}V_{S}}{10^{\frac{\Delta E}{b}} (V_{T} + V_{S}) - V_{T}} ,

где: VT - объем испытуемого раствора или контрольного раствора;

CT - концентрация определяемого иона в испытуемом растворе;

VS - объем прибавляемого раствора сравнения;

CS - концентрация определяемого иона в растворе сравнения;

\Delta E - среднее значение разницы потенциалов, измеренных до и после прибавления объема VS;

b - наклон электродной функции, установленный экспериментально при постоянной температуре путем измерения разности потенциалов, полученный из двух растворов сравнения, концентрации которых отличаются в 10 раз и находятся в пределах линейной части калибровочной кривой.

201020048-2022

2.1.2.48 Рентгенофлуоресцентная спектрометрия

Метод рентгенофлуоресцентной спектрометрии основан на измерении рентгеновского излучения, испускаемого атомами при их облучении внешним источником излучения, и используется для определения содержания химических элементов с атомными номерами от 4 до 92.

Измерение рентгеновского излучения проводят с помощью волнодисперсионных или энергодисперсионных рентгенофлуоресцентных спектрометров, различающихся способом детектирования.

В волнодисперсионных рентгенофлуоресцентных спектрометрах рентгеновское излучение, испускаемое образцом, направляется на кристалл, где происходит его преломление на угол, зависящий от энергии излучения. Интенсивность преломленного рентгеновского излучения последовательно измеряется детектором.

В энергодисперсионных рентгенофлуоресцентных спектрометрах рентгеновское излучение образца направляется на твердотельный детектор, генерирующий электрические импульсы с амплитудой, пропорциональной энергии каждого детектируемого фотона рентгеновского излучения. Спектрометры такого типа позволяют получить спектр исследуемого образца, содержащий полную информацию о его составе.

Интенсивность флуоресценции элемента зависит от его концентрации в образце, а также от поглощения матрицей возбуждающего и испускаемого излучения. Если концентрация следовых количеств определяемого элемента входит в область линейности калибровочного графика, интенсивность измеренной при определенной длине волны флуоресценции элемента, находящегося в матрице определенного состава, прямо пропорциональна концентрации данного элемента и обратно пропорциональна массовому коэффициенту ослабления (поглощения) матрицы при этой длине волны, который может быть обусловлен присутствием и концентрацией других элементов в образце, составом матрицы образца и размером частиц материала.

Методика. Настройку и использование прибора проводят в соответствии с инструкциями производителя. Жидкие образцы измеряют непосредственно; твердые образцы могут быть измерены непосредственно, после предварительного прессования в таблетки (гранулы), иногда после смешивания с подходящим связывающим материалом либо сплавления. Необходимо, чтобы образец имел достаточную толщину для того, чтобы возможные небольшие отклонения в толщине не влияли на измеряемое рентгеновское излучение. Для повышения чувствительности при количественном определении легких элементов измерения могут проводиться в вакууме, в среде азота или гелия. Для калибровки прибора, проверки пригодности системы и контроля работоспособности используют подходящие сертифицированные стандартные образцы, при этом при анализе лекарственных средств предпочтительно использовать стандартные образцы с высоким содержанием углерода.

Проверка пригодности системы. Перед проведением испытания для подтверждения правильности работы системы проверяют ее пригодность. Проверка считается пройденной, если полученные результаты не отличаются от действительного значения более чем на 5% в случае количественного определения содержания компонентов лекарственных средств или вспомогательных веществ, и более чем на 20% в случае количественного определения содержания примесей элемента. Сравнение с результатами, полученными альтернативным методом, например, с помощью атомно-абсорбционной спектрометрии, также может быть использовано для проверки пригодности системы, при этом в случае количественного определения критерий приемлемости может быть принят равным 10%.

Контроль работоспособности прибора. Для обеспечения достоверности результатов измерений необходимо гарантировать стабильную работу прибора в течение продолжительного периода времени. Выбор процедур, критериев приемлемости и временных интервалов для этого должен отталкиваться от типа используемого оборудования и его предполагаемого использования. Например, контроль можно осуществлять путем оценки x-оси (угол или энергия) и y-оси (интенсивность), а также разрешающей способности детектора (с требованиями, что значения разрешающей способности не должны отклоняться от значения, определенного при калибровке оборудования, более чем на 20% для количественного определения компонентов и более чем на 25% для подлинности и количественного определения примесей элементов).

Валидационные требования. В случае методик определения примесей руководствуются требованиями к валидации, представленными в общей фармакопейной статье 2.1.4.23. Определение примесей элементов. В остальных случаях пользуются общей фармакопейной статьей 2.3.14.0. Валидация аналитических методик.

Если при проведении испытания требуется проведение пробоподготовки, то введение добавок в испытуемый образец осуществляют до начала ее первой стадии.

201020049-2022

2.1.2.49 Молекулярно-массовое распределение декстранов

Определение проводят методом эксклюзионной хроматографии (2.1.2.29).

Испытуемый раствор. 0,200 г испытуемого образца растворяют в подвижной фазе и доводят тем же растворителем до объема 10 мл.

Маркерный раствор. 5 мг глюкозы P и 2 мг СО ФЕАЭС декстрана V0 растворяют в 1 мл подвижной фазы.

Калибровочные растворы. Навеску каждого из указанных стандартных образцов: 15 мг СО ФЕАЭС декстрана 4 для калибровки, 15 мг СО ФЕАЭС декстрана 10 для калибровки, 20 мг СО ФЕАЭС декстрана 40 для калибровки, 20 мг СО ФЕАЭС декстрана 70 для калибровки и 20 мг СО ФЕАЭС декстрана 250 для калибровки по отдельности растворяют в 1 мл подвижной фазы.

Раствор для проверки пригодности хроматографической системы. 20 мг СО ФЕАЭС декстрана 40 для проверки пригодности хроматографической системы (для анализа субстанции декстрана 40) или 20 мг СО ФЕАЭС декстрана 60/70 для проверки пригодности хроматографической системы (для анализа субстанций декстрана 60 и декстрана 70) растворяют в 1 мл подвижной фазы.

При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье допускается использовать следующие условия хроматографирования:

• колонка длиной 0,3 м и внутренним диаметром 10 мм, заполненная агарозой поперечно-сшитой для хроматографии P, или серия колонок длиной 0,3 м и внутренним диаметром 10 мм каждая, заполненных полиэфирным гидроксилированным гелем для хроматографии P;
• подвижная фаза: раствор 7 г натрия сульфата безводного P и 1 г хлорбутанола P в 1 л воды P;
• скорость подвижной фазы: от 0,5 мл/мин до 1 мл/мин, поддерживаемая постоянно с точностью +/- 1% в час;
• детектор: дифференциальный рефрактометрический;
• петлевой дозатор: объем от 100 мкл до 200 мкл;
• температура системы: поддерживают постоянной с точностью +/- 0,1 °C.

КАЛИБРОВКА ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ

Хроматографируют несколько раз выбранный объем маркерного раствора. На хроматограмме должны присутствовать 2 пика: первый пик соответствует СО ФЕАЭС декстрана V0, второй пик - глюкозе P. Исходя из объема элюирования декстрана V0, рассчитывают объем эксклюзии V0; полный объем Vt рассчитывают по пику, соответствующему глюкозе.

Хроматографируют определенный объем каждого из калибровочных растворов. Для каждой полученной хроматограммы проводят базовую линию. Каждую хроматограмму делят вертикальными равноудаленными линиями на p секций (количеством не менее 60), что соответствует равным объемам элюирования. Для каждой секции i, соответствующей объему элюирования Vi, измеряют высоту (yi) от базовой линии до линии хроматограммы и рассчитывают коэффициент распределения (Ki) по формуле:

\frac{(V_{i} - V_{0})}{(V_{t} - V_{0})} , (1)

где: V0 - объем эксклюзии, определенный по пику, соответствующему СО ФЕАЭС декстрана V0 на хроматограмме маркерного раствора;

Vt - полный объем колонки, определенный по пику, соответствующему глюкозе на хроматограмме маркерного раствора;

Vi - объем элюирования для секции i, полученный для хроматограммы каждого из калибровочный растворов.

Калибровку проводят, используя один из следующих методов.

Калибровка путем построения калибровочного графика. По уравнению (1) для каждого из декстранов для калибровки рассчитывают коэффициент распределения Kmax, соответствующий максимальной высоте линии хроматограммы. На полулогарифмической бумаге строят зависимость значений Kmax (ось абсцисс) от молекулярной массы для максимальной высоты линии хроматограммы (Mmax) каждого из декстранов для калибровки и глюкозы (ось ординат). Через все полученные точки проводят первую калибровочную линию, экстраполируя ее из точки Kmax, полученной для СО ФЕАЭС декстрана 250 для калибровки, до более низких значений K, полученных для тех же стандартных растворов (см. рисунок 2.1.2.49.-1).

Рисунок 2.1.2.49.-1. - Пример калибровочного графика. Пунктиром обозначена часть калибровочного графика, полученная экстраполированием. Горизонтальными линиями в нижней части рисунка указаны ширина и положения хроматографических линий, полученных для каждого декстрана для калибровки

Используя полученный первый калибровочный график, находят для всех значений Ki для всех хроматограмм соответствующие значения молекулярных масс Mi, получая таким образом графическую зависимость для расчета молекулярно-массового распределения. Для каждого декстрана для калибровки рассчитывают среднюю молекулярную массу по уравнению (3), приведенному ниже. Калибровочный график может быть использован для расчетов, если рассчитанные значения для каждого из декстранов для калибровки не отличаются от указанных в сопроводительной документации значений больше чем на 5% и среднее отклонение для всех декстранов не превышает +/- 3%. Если данные условия не выполняются, калибровочный график смещают вдоль оси ординат и повторяют вышеописанные операции, пока рассчитанные и указанные в сопроводительной документации значения будут отличаться не более чем на 5%.

Калибровка при помощи расчетного метода. При помощи уравнений (2) и (3), приведенных ниже, и подходящего метода (возможно использование итеративного метода, такого как модифицированного Хартли метода Гаусса-Ньютона; также возможно построение кривой при помощи компьютерных программ, которые используют принцип нелинейного регрессионного анализа) рассчитывают значения коэффициентов b1, b2, b3, b4 и b5, которые должны составлять для глюкозы 180 +/- 2, а для декстранов для калибровки могут отличаться не более чем на 5% от соответствующих значений, указанных в сопроводительной документации.

M_{i} = b_{5} + e^{(b_{4} + b_{1}K_{i} + b_{2}K_{i}^{2} + b_{3}K_{i}^{3})} , (2)

\overline{M_{\omega}} = \frac{\sum_{i = 1}^{p} (y_{i}M_{i})}{\sum_{i = 1}^{p} y_{i}} , (3)

где: p - число секций, на которые поделена хроматограмма;

yi - высота хроматографической линии над базовой линией в i-той секции;

Mi - молекулярная масса для секции i.

ПРИГОДНОСТЬ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОЙ СИСТЕМЫ

Хроматографируют подходящий объем соответствующего раствора для проверки пригодности хроматографической системы.

Средняя молекулярная масса СО ФЕАЭС декстрана для проверки пригодности хроматографической системы. Рассчитывают значение M_{\omega} , как указано в разделе "Калибровка хроматографической системы", используя калибровочный график или значения коэффициентов b1, b2, b3, b4 и b5. Результаты анализа считаются достоверными, если полученное значение находится в пределах:

• от 41 000 до 47 000 (для СО ФЕАЭС декстрана 40 для проверки пригодности хроматографической системы);
• от 67 000 до 75 000 (для СО ФЕАЭС декстрана 60/70 для проверки пригодности хроматографической системы).

Средняя молекулярная масса 10% высокомолекулярной фракции декстрана. Значение M_{\omega} для 10% высокомолекулярной фракции декстрана, которая элюируется в секциях от 1 до n включительно, рассчитывают по формуле:

M_{\omega} = \frac{\sum_{i = 1}^{n} (y_{i}M_{i})}{\sum_{i = 1}^{n} y_{i}} , (4)

где n определяется неравенствами:

\sum_{i = 1}^{n} y_{i} \leq 0,1(\sum_{i = 1}^{p} y_{i}) , (5)

\sum_{i = 1}^{n + 1} y_{i}>0,1(\sum_{i = 1}^{p} y_{i}) , (6)

где: p - количество секций, на которые разделена хроматограмма;

yi - высота хроматографической линии над базовой линией для секции i;

Mi - молекулярная масса для секции i.

Результаты анализа считаются достоверными, если полученное значение для 10% высокомолекулярной фракции декстрана находится в пределах:

• от 110 000 до 130 000 (для СО ФЕАЭС декстрана 40 для проверки пригодности хроматографической системы);
• от 190 000 до 230 000 (для СО ФЕАЭС декстрана 60/70 для проверки пригодности хроматографической системы).

Средняя молекулярная масса 10% низкомолекулярной фракции декстрана. Значение для 10% низкомолекулярной фракции декстрана, которая элюируется в секции и после секции хроматограмм m, рассчитывают по формуле:

M_{\omega} = \frac{\sum_{i = m}^{p} (y_{i}M_{i})}{\sum_{i = m}^{p} y_{i}} , (7)

где m определяется неравенствами:

\sum_{i = m}^{p} y_{i} \leq 0,1(\sum_{i = 1}^{p} y_{i}) , (8)

\sum_{i = m - 1}^{p} y_{i}>0,1(\sum_{i = 1}^{p} y_{i}) , (9)

где: p - количество секций, на которые разделена хроматограмма;

yi - высота хроматографической линии над базовой линией для секции i;

Mi - молекулярная масса для секции i.

Результаты анализа считаются достоверными, если полученное значение для 10% низкомолекулярной фракции декстрана находится в пределах:

• от 6000 до 8500 (для СО ФЕАЭС декстрана 40 для проверки пригодности хроматографической системы);
• от 7000 до 11 000 (для СО ФЕАЭС декстрана 60/70 для проверки пригодности хроматографической системы).

МОЛЕКУЛЯРНО-МАССОВОЕ РАСПРЕДЕЛЕНИЕ ИСПЫТУЕМОГО ДЕКСТРАНА

Хроматографируют выбранный объем испытуемого раствора и рассчитывают: значение Mw для молекулярно-массового распределения декстрана, значение Mw для 10% высокомолекулярной фракции декстрана и значение Mw для 10% низкомолекулярной фракции декстрана рассчитывают, как описано в разделе "Пригодность хроматографической системы".

201020050-2022

2.1.2.50 Круговой дихроизм

При прохождении плоскополяризованного света через оптически активное вещество вблизи его полос поглощения происходит аномальное изменение угла вращения плоскости поляризованного света, что приводит к круговому дихроизму.

Круговым дихроизмом называют разность поглощений, присущую оптически активным веществам в пределах полосы поглощения для света с левой и правой круговой поляризацией.

Из линейно поляризованного световой луч становится при выходе из раствора оптически активного вещества эллиптически поляризованным, причем эллиптичность проходит через максимум в области полосы поглощения (эффект Коттона).

Поглощение кругового дихроизма определяется прямым измерением поглощения света с левой и правой круговой поляризацией:

\Delta A = A_{L} - A_{R} ,

где: AL - поглощение света с левой круговой поляризацией;

AR - поглощение света с правой круговой поляризацией.

Круговой дихроизм рассчитывают по формуле:

\Delta\epsilon = \epsilon_{L} - \epsilon_{R} = \frac{\Delta A}{c \cdot l} ,

где: \Delta\epsilon - молярный круговой дихроизм или молярный дифференциальный дихроичный коэффициент поглощения, л · моль-1 · см-1;

\epsilon_{L} - молярный коэффициент поглощения (2.1.2.24) для света с левой круговой поляризацией;

\epsilon_{R} - молярный коэффициент поглощения для света с правой круговой поляризацией;

c - молярная концентрация вещества в испытуемом растворе, моль · л-1;

l - длина оптического пути, см.

Для характеристики кругового дихроизма могут быть также использованы следующие величины:

Коэффициент диссимметрии:

g = \frac{\Delta\epsilon}{\epsilon} ,

где: \epsilon - молярный коэффициент поглощения (2.1.2.24).

Молярная эллиптичность:

Молярной эллиптичностью называют величину угла в градусах для 1 M раствора оптически активного вещества при длине оптического пути 1 м. Молярная эллиптичность может быть рассчитана по показаниям приборов (дихрографов), непосредственно измеряющих величину эллиптичности в градусах, по формуле:

[\Theta] = \frac{\Theta \cdot M}{c \cdot l \cdot 10} ,

где: [\Theta] - молярная эллиптичность, градус · см2 · дмоль-1;

\Theta - значение эллиптичности, показываемое прибором;

M - молярная масса испытуемого вещества;

c - массовая концентрация вещества в испытуемом растворе, г · мл-1;

l - длина оптического пути, см.

Молярная эллиптичность также связана с молярным круговым дихроизмом следующим уравнением:

\Theta = 2,303\Delta\epsilon \frac{4500}{\pi} \approx 3300\Delta\epsilon .

Молярная эллиптичность часто используется при анализе белков и нуклеиновых кислот. В этом случае молярную концентрацию раствора рассчитывают с учетом средней относительной молекулярной массы элементарного звена белка или нуклеиновой кислоты, найденной по формуле:

\frac{M_{r}}{N} ,

где: Mr - относительная молекулярная масса белка или нуклеиновой кислоты;

N - число элементарных звеньев белка или нуклеиновой кислоты.

Средняя относительная молекулярная масса элементарного звена составляет для белков от 100 до 120 (в среднем 115), для нуклеиновых кислот (в виде натриевой соли) - около 330.

Прибор. Источником света (S) является ксеноновая лампа (рисунок 2.1.2.50.-1); свет проходит через двойной монохроматор (M), снабженный кварцевыми призмами (P1, P2).

Рисунок 2.1.2.50.-1. - Оптическая схема дихрографа

Линейный луч из первого монохроматора расщепляется на 2 компонента, поляризуемые под правым углом вторым монохроматором. Дополнительный луч устраняется выходной щелью монохроматора.

Поляризованный и монохроматический свет проходит через двоякопреломляющий модулятор (Cr); в результате образуется переменный свет с круговой поляризацией.

Затем луч проходит через исследуемый образец (C) и попадает на фотоумножитель (P.M.), за которым следует усилитель, производящий 2 электрических сигнала: один - постоянного тока Vc, а другой - переменного тока с частотой модуляции Vac, характерной для исследуемого образца. Фаза является показателем кругового дихроизма. Отношение Vac/Vc пропорционально дифференциальной оптической плотности \Delta A , которая создается сигналом. Дихрограф обычно позволяет проводить измерения в диапазоне длин волн от 170 нм до 800 нм.

КАЛИБРОВКА ПРИБОРА

Точность шкалы оптической плотности. 10,0 мг изоандростерона P растворяют в диоксане P и доводят тем же растворителем до объема 10,0 мл. Снимают спектр кругового дихроизма раствора в диапазоне от 280 нм до 360 нм. Величина \Delta\epsilon , измеренная в максимуме при 304 нм, равна +3,3.

Допускается использование раствора (1S)-(+)-10-камфорсульфоновой кислоты P.

Линейность модуляции. 10,0 мг (1S)-(+)-10-камфорсульфоновой кислоты P растворяют в воде P и доводят тем же растворителем до объема 10,0 мл. Определяют точную концентрацию камфорсульфоновой кислоты в растворе методом спектрофотометрии в ультрафиолетовой области (2.1.2.24), используя значение удельного показателя поглощения при 285 нм, равное 1,49.

Снимают спектр кругового дихроизма раствора в диапазоне от 185 нм до 340 нм. Величина \Delta\epsilon , измеренная в максимуме при 290,5 нм, составляет от +2,2 до +2,5, а измеренная в максимуме при 192,5 нм - от -4,3 до -5.

Допускается использование аммония (1S)-(+)-10-камфорсульфоната P или его оптического изомера аммония (1R)-(-)-10-камфор-сульфоната P.

201020051-2022

2.1.2.51 Масс-спектрометрия

Масс-спектрометрия основана на прямом измерении отношения массы к числу элементарных положительных или отрицательных зарядов ионов (m/z), полученных из анализируемого образца, находящихся в газовой фазе. Данное отношение выражается в атомных единицах массы (1 а.е.м. = одной двенадцатой массы нуклида 12C) или в дальтонах (1 Да = массе атома водорода).

Ионы, образовавшиеся в ионизаторе прибора, ускоряются и перед попаданием в детектор разделяются с помощью масс-анализатора. Все эти действия происходят в камере, в которой насосная система поддерживает вакуум от 10-3 до 10-6 Па.

Результирующий масс-спектр является графиком зависимости относительного количества различных ионов от отношения m/z. Сигнал, отвечающий иону, представлен несколькими пиками, соответствующими статистическому распределению различных изотопов этого иона. Такая диаграмма называется изотопным профилем, а пик (по крайней мере, для небольших молекул), представляющий наиболее распространенные изотопы для каждого атома, - моноизотопным пиком.

Масс-спектрометрический анализ дает важную качественную (определение молекулярных масс; информация, касающаяся структуры определяемых фрагментов) и количественную (с использованием внешнего или внутреннего стандартов) информацию с пределом обнаружения от пикомоля до фемтомоля.

ВВОД ОБРАЗЦА

Первой стадией анализа является ввод образца в прибор без значительного нарушения вакуума. В широко распространенном методе, называемом прямым вводом жидкости, образец помещается на конце цилиндрического штока (в кварцевом тигле, на проволоке или на металлической поверхности). Этот шток через вакуумный шлюз, в котором поддерживается первичный промежуточный вакуум между атмосферным давлением и вторичным вакуумом прибора, вводится в спектрометр.

Другие системы ввода позволяют проанализировать компоненты смеси, которые разделяются с помощью соответствующего прибора, соединенного с масс-спектрометром.

Газовая хроматография/масс-спектрометрия. При использовании подходящих колонок (капиллярных или полукапиллярных) возможно непосредственное введение конца колонки в ионизатор прибора без применения сепаратора.

Жидкостная хроматография/масс-спектрометрия. Такая комбинация особенно полезна для анализа полярных соединений, которые являются недостаточно летучими либо слишком термолабильными для того, чтобы их можно было проанализировать методом газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией. Данный метод осложняется трудностью получения ионов в газовой фазе из жидкой фазы, что требует применения специальных интерфейсов, таких, как:

• прямой ввод жидкости: подвижная фаза распыляется, и растворитель испаряется перед ионизатором прибора;
• интерфейс с пучком частиц: подвижная фаза, скорость которой может достигать 0,6 мл/мин, распыляется в десольватационной камере, в результате в ионизатор прибора попадают лишь определяемые вещества в нейтральной форме; данный способ может быть использован для соединений с относительно низкой полярностью и молекулярными массами менее 1000 Да;
• интерфейс с движущейся лентой: подвижная фаза, скорость которой может достигать 1 мл/мин, наносится на поверхность движущейся ленты; после выпаривания растворителя, анализируемый образец переносится к ионизатору прибора, где подвергается ионизации; данный способ мало эффективен для сильно полярных или термолабильных соединений.

Другие виды интерфейсов (электрораспыление, термораспыление, химическая ионизация при атмосферном давлении) могут рассматриваться как самостоятельные методы ионизации и описаны в разделе, посвященном способам ионизации.

Сверхкритическая флюидная хроматография/масс-спектрометрия. Подвижная фаза, обычно состоящая из находящегося в сверхкритическом состоянии углерода диоксида, переходит в газообразное состояние после прохождения через нагретую заслонку, находящуюся между колонкой и ионизатором.

Капиллярный электрофорез/масс-спектрометрия. Элюент вводится в ионизатор, в некоторых случаях после добавления дополнительного растворителя, для достижения скорости потока порядка нескольких миллилитров в минуту. Ограничениями данного метода являются малые количества вводимого образца и необходимость использования летучих буферных растворов.

СПОСОБЫ ИОНИЗАЦИИ

Электронный удар. Образец, находящийся в газообразном состоянии, ионизируется потоком электронов, энергия которых (обычно 70 эВ) больше энергии ионизации образца. При этом кроме молекулярного иона M+ образуются осколочные ионы, характерные для данной молекулярной структуры. Главным ограничением данного способа является необходимость испарения образца, что делает невозможным его применение для полярных, термолабильных или высокомолекулярных соединений. Ионизация электронным ударом может быть использована в газовой хроматографии, соединенной с масс-спектрометрией, а в некоторых случаях и в жидкостной хроматографии.

Химическая ионизация. Этот тип ионизации предполагает использование газа-реактива, такого, как метан, аммиак, азота монооксид, азота диоксид или кислород. Спектр характеризуется ионами (M + H)+ или (M - H)- типов или ионами-аддуктами, образованными из образца и используемого газа. Осколочные ионы образуются реже, чем при ионизации электронным ударом. Для термолабильных веществ используется разновидность данного метода ионизации, при которой образец, находящийся на проволоке, очень быстро испаряется вследствие эффекта Джоуля-Томсона (десорбционная химическая ионизация).

Бомбардировка быстрыми атомами (FAB) или ионизация бомбардировкой быстрыми ионами (жидкостная масс-спектрометрия вторичных ионов - LSIMS). Образец, растворенный в вязкой матрице (например, в глицерине), наносится на металлическую поверхность и ионизируется потоком нейтральных атомов, например, аргона, ксенона или обладающими большой кинетической энергией ионами цезия. Образуются ионы (M + H)+ или (M - H)- типов либо ионы-аддукты, сформированные матрицей или образцом. Данный тип ионизации подходит для полярных, термолабильных соединений, имеющих молекулярную массу до 10 000 Да. При прибавлении к подвижной фазе от 1% до 2% глицерина он может быть использован для жидкостной хроматографии, однако скорость подвижной фазы должна быть очень низкой (несколько микролитров в минуту). При нанесении тонкого слоя матрицы на поверхность хроматографических пластинок такой способ ионизации допускается использовать и в тонкослойной хроматографии.

Полевая десорбция или полевая ионизация. Образец испаряется около вольфрамовой проволоки, покрытой микроиглами (полевая ионизация) или помещается на эту проволоку (полевая десорбция). Сильное электрическое поле (напряжение около 10 кВ), возникающее между проволокой и противоэлектродом, ионизирует образец. При данных способах ионизации образуются преимущественно молекулярные ионы M+ и (M + H)+ ионы. Эти способы используются для малополярных и (или) термолабильных соединений.

Матрично-активированная лазерная десорбция/ионизация (MALDI). Образец, смешанный с подходящей матрицей и помещенный на металлическую подложку, ионизируется импульсным лазерным излучением с длиной волны от УФ- до ИК-диапазона (продолжительность импульсов может составлять от пикосекунды до нескольких наносекунд). Данный способ ионизации играет важную роль при анализе соединений с молекулярной массой более 100 000 Да, но ограничен использованием времяпролетного анализатора (см. ниже).

Электрораспылительная ионизация. Данный способ ионизации проводится при атмосферном давлении. Образец, находящийся в растворе, вводится в источник через капилляр, конец которого имеет потенциал порядка 5 кВ. Для облегчения распыления может использоваться газ. Испарение молекул растворителя из образующихся микрокапель приводит к образованию в газовой фазе однозарядных или многозарядных ионов. Скорости подвижной фазы при данном виде ионизации могут изменяться от нескольких микролитров в минуту до 1 мл/мин. Такая ионизация подходит для полярных соединений, а также для исследования биомолекул с молекулярными массами до 100 000 Да. Она может сочетаться с жидкостной хроматографией или капиллярным электрофорезом.

Химическая ионизация при атмосферном давлении (APCI). Ионизация проводится при атмосферном давлении под действием электрода, имеющего потенциал несколько киловольт и помещенного на пути подвижной фазы, которая распыляется как вследствие тепловых эффектов, так и благодаря использованию потока азота. Образующиеся ионы являются однозарядными и относятся к (M + H)+ типу в случае положительного заряда и к (M - H)- типу в случае отрицательного. Возможность использования высоких скоростей подвижной фазы (до 2 мл/мин) делает этот способ ионизации идеальным для сочетания с жидкостной хроматографией.

Термораспылительная ионизация. Образец, находящийся в подвижной фазе, состоящей из воды и органических модификаторов и содержащей летучий электролит (обычно ацетат аммония) вводится в распыленной форме после прохождения через металлический капилляр, температура которого контролируется. Допускаются скорости подвижной фазы порядка 1 - 2 мл/мин. Ионы электролита ионизируют анализируемое соединение. Такой процесс ионизации может быть заменен или усилен электрическим разрядом напряжением около 800 В, особенно при использовании только органического растворителя. Данный способ ионизации может быть использован в методе жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией.

АНАЛИЗАТОРЫ

Различия в работе анализаторов зависят, главным образом, от двух параметров:

• диапазона, в котором могут быть измерены отношения m/z (массовый диапазон);
• разрешающей способности, характеризующееся возможностью разделить два иона одинаковой интенсивности с отношениями m/z, отличающимися на \Delta M и перекрывающиеся при определенном процентном превышении базовой линии; например, разрешающая способность (M/\Delta M) , равная 1000 с 10% превышением базовой линии, позволяет провести разделение отношений m/z 1000 и 1001 с интенсивностями, на 10% превышающими базовую линию. В некоторых случаях (времяпролетные анализаторы, квадрупольные анализаторы, ионные ловушки) разрешающая способность может быть определена как отношение между молекулярной массой и шириной пика на половине высоты (50% превышение базовой линии).

Магнитные и электростатические анализаторы. Ионы, образовавшиеся в ионизаторе, ускоряются потенциалом V и сосредотачиваются, в зависимости от устройства прибора, между магнитным (магнитное поле B) или электростатическим анализаторами (электростатическое поле E). В соответствии с законом Лапласа они перемещаются по траектории с радиусом r:

\frac{m}{z} = \frac{B^{2}r^{2}}{2V} .

Для накопления и измерения различных ионов, образовавшихся в ионизаторе, могут быть использованы два типа сканирования: изменение B при постоянной величине V или изменение V при постоянной величине B. За магнитным анализатором обычно следует электрический сектор, который действует как фильтр кинетической энергии и позволяет заметно увеличить разрешающую способность прибора. Максимальная разрешающая способность такого прибора (двойной сектор) изменяется от 10 000 до 150 000 и в большинстве случаев позволяет достаточно точно оценить величину отношений m/z для определения элементного состава соответствующих ионов. Для однозарядных ионов массовый диапазон составляет от 2000 Да до 15 000 Да. Некоторые ионы могут разрушаться спонтанно (метастабильные переходы) или при столкновении с газом (диссоциация, активированная столкновением (CAD)) в областях между ионизатором и детектором, где отсутствует поле. Исследование этих процессов разрушения очень полезно для определения структуры и характеристики определенного соединения, входящего в состав смеси, и делает возможным использование тандемной масс-спектрометрии. В зависимости от места, в котором протекают процессы разрушения, известно много методик его проведения:

• режим дочернего иона (определение состава ионов, образовавшихся при разрушении определенного родительского иона): B/E = константа, MIKES (Mass-analysed Ion Kinetic Energy Spectroscopy);
• режим родительского иона (определение всех ионов, образовавшихся при разрушении иона с определенным отношением m/z): B2/E = константа;
• режим нейтральных частиц (определение всех ионов, которые теряют идентичные фрагменты): B/E(1 - E/E0)1/2 = константа, где E0 - базовый потенциал электрического сектора.

Квадрупольные анализаторы. Анализатор состоит из четырех параллельных металлических стержней, имеющих цилиндрическое или гиперболическое поперечное сечение. Они расположены симметрично по отношению к траектории движения ионов; пары противоположных стержней присоединены к электрическому источнику. Потенциалы двух пар стержней противоположны. Они состоят из постоянного и изменяющегося компонентов. Ионы, образовавшиеся в ионизаторе, пропускаются и разделяются вследствие изменения потенциалов, приложенных к стержням, причем отношение постоянного потенциала к переменному должно оставаться неизменным. Квадрупольные анализаторы обычно имеют массовый диапазон от 1 а.е.м. до 2000 а.е.м., хотя в некоторых случаях он может достигать 4000 а.е.м. Несмотря на то, что такие анализаторы имеют меньшее разрешение, чем магнитные, они позволяют получать моноизотопный профиль однозарядных ионов во всем массовом диапазоне. Для получения спектров можно использовать три квадруполя, соединенных друг с другом, Q1, Q2, Q3 (Q2 служит ионизационной камерой и в действительности не является анализатором; чаще всего в качестве ионизирующего газа применяют аргон).

Наиболее часто используемыми режимами сканирования являются:

• режим дочернего иона: Q1 выбирает m/z ион, фрагменты которого, полученные при ионизации в квадруполе Q2, анализируются квадруполем Q3;
• режим родительского иона: Q3 пропускает ионы только с определенным соотношением m/z, в то время как Q1 сканирует определенный массовый диапазон. Детектируются только ионы, при разрушении которых образуется ион, отбираемый квадруполем Q3;
• режим нейтральных частиц: Q1 и Q3 сканируют определенный массовый диапазон, но в интервале, соответствующем фрагментам, которые теряет определенное вещество или группа веществ.

Для получения спектров возможно сочетание квадрупольных анализаторов с магнитными или электростатическими. Такие приборы называют гибридными масс-спектрометрами.

Ионные ловушки. Данные анализаторы имеют такой же принцип работы, что и квадрупольные, но в них используются трехмерные электрические поля. Анализаторы такого типа позволяют получать спектры ионов нескольких генераций (MSn).

Циклотронно-резонансные масс-анализаторы. Ионы, образовавшиеся в ячейке и подвергнутые действию интенсивного магнитного поля, движутся по круговым траекториям с частотами, которые могут быть непосредственно связаны с величинами отношений m/z для этих ионов при помощи Фурье преобразования. Данное явление называется ионно-циклотронным резонансом. Анализаторы такого типа состоят из сверхпроводящих магнитов и обладают очень высокой разрешающей способностью (до 1 000 000 и выше), а также позволяют получать MSn спектры. Их недостатком является необходимость использования очень глубокого вакуума (порядка 10-7 Па).

Времяпролетные анализаторы. Ионы, образовавшиеся в ионизаторе, ускоряются потенциалом величиной от 10 кВ до 20 кВ. Они проходят через анализатор, состоящий из бесполевой трубы длиной от 25 см до 1,5 м, обычно называемой пролетной трубой. Время (t), за которое ион достигает детектора, пропорционально квадратному корню из отношения m/z. Теоретически массовый диапазон для такого анализатора бесконечен. Практически он определяется методом ионизации или десорбции. Времяпролетные анализаторы используются, главным образом, для высокомолекулярных соединений (вплоть до нескольких сотен тысяч дальтон). Данный анализатор обладает очень высокой чувствительностью (достаточно несколько пикомолей вещества). Точность измерений и разрешающая способность таких приборов могут быть значительно улучшены при использовании электростатического зеркала (рефлектрона).

ПОЛУЧЕНИЕ СИГНАЛА

Существует три возможных режима получения сигнала.

Режим полного спектра. Записывается полный сигнал, полученный для выбранного массового диапазона. Спектр представляет собой зависимость относительной интенсивности различных ионов от величины m/z. Получаемые результаты являются главным образом качественными. Для более быстрой идентификации возможно использование библиотек спектров сравнения.

Фрагментометрический режим (селективное сканирование ионов). Получаемый сигнал ограничен одним (сканирование одного иона, single-ion monitoring (SIM)) или несколькими (множественное ионное сканирование, multiple-ion monitoring (MIM)) ионами, характерными для анализируемого вещества. В этом режиме предел обнаружения значительно ниже. При использовании внутреннего или внешнего стандартов (например, дейтерированные стандарты) могут быть проведены количественные или полуколичественные измерения. При использовании времяпролетных анализаторов такие измерения невозможны.

Двойной фрагментометрический масс-спектрометрический режим (множественный мониторинг реакций, multiple reaction monitoring (MRM)). Включает специфическую мономолекулярную или бимолекулярную реакцию разрушения выбранного иона-предшественника, характерного для анализируемого вещества. Селективность и высокая специфичность данного режима получения сигнала обеспечивают превосходную чувствительность и делают его наиболее подходящим для количественных определений с использованием подходящих внутренних стандартов (например, дейтерированных). Данный вид анализа может быть проведен только при использовании приборов, снабженных тремя соединенными квадруполями, ионными ловушками или циклотронно-резонансными анализаторами.

КАЛИБРОВКА

Калибровка позволяет установить соответствие между величиной m/z и детектируемым сигналом. Как правило, она проводится с использованием вещества сравнения. Калибровка может быть внешней (данные находятся в отдельном файле) или внутренней (вещество (вещества) сравнения смешивается с исследуемым веществом и результаты вносятся в файл с данными анализа). Число ионов или точек, необходимое для надежной калибровки, зависит от типа анализатора и требуемой точности измерений, например, в случае магнитного анализатора, где отношение m/z экспоненциально изменяется при изменении величины магнитного поля, необходимо брать настолько много точек, насколько это возможно.

ОБНАРУЖЕНИЕ СИГНАЛА И ОБРАБОТКА ДАННЫХ

Ионы, разделенные анализатором, преобразуются в электрические сигналы такими детектирующими системами, как фотоумножитель или электронный умножитель. Затем данные сигналы усиливаются и превращаются в цифровые сигналы, которые используются при обработке данных и позволяют проводить различные операции: калибровку, получение спектров, автоматические количественные расчеты, архивирование данных, создание или использование библиотек масс-спектров. Различные физические параметры, требуемые для работы прибора, в целом контролируются компьютером.

201020052-2022

2.1.2.52 Сверхкритическая флюидная хроматография

Сверхкритическая флюидная хроматография (СФХ) - это метод хроматографического разделения, в котором подвижной фазой является жидкость (флюид), находящаяся в сверхкритическом или субкритическом состоянии. В этом состоянии свойства вещества являются промежуточными между свойствами газа и жидкости. Неподвижная фаза, содержащаяся в колонке, состоит либо из тонко измельченных твердых частиц, таких как силикагель или пористый графит, химически модифицированной неподвижной фазы, используемой в жидкостной хроматографии, либо, в случае капиллярных колонок, поперечно-сшитой жидкой пленки, равномерно нанесенной на стенки колонки.

СФХ основана на механизмах адсорбции или распределения по массе.

С точки зрения применения флюида в качестве подвижной фазы в хроматографии важны его плотность, коэффициенты диффузии и вязкость:

• коэффициенты диффузии в сверхкритических фазах примерно на порядок больше коэффициентов диффузии в жидкостях, но примерно на порядок меньше, чем в газах;
• вязкость сверхкритических флюидов примерно на порядок меньше, чем жидкостей, но примерно на порядок больше, чем газов;
• растворяющая способность веществ в состоянии сверхкритического флюида больше, чем у газов;
• плотность основных флюидов, используемых в хроматографии, примерно на 2 - 3 порядка больше плотности газов и в несколько раз меньше плотности соответствующих жидкостей.

Применительно к сверхкритической флюидной хроматографии это означает что:

• достигаются меньшие времена анализа по сравнению с высокоэффективной жидкостной хроматографией (ВЭЖХ);
• оптимальное значение линейной скорости потока выше, чем в ВЭЖХ;
• падение давления на колонке значительно меньше, чем в ВЭЖХ, что дает возможность использования колонок большей длины;
• хроматографическая эффективность в сверхкритической флюидной хроматографии выше, чем в ВЭЖХ (хотя и ниже, чем в газовой хроматографии);
• возможно проведение разделения при более низких температурах, чем это принято в газовой хроматографии без существенной потери эффективности;
• возможно проведение разделения соединений с большей молекулярной массой, чем это допускается в газовой хроматографии.

ПРИБОР

Прибор обычно состоит из охлаждаемой насосной системы, устройства для ввода проб (инжектора), хроматографической колонки, помещенной в термостат, детектора, автоматического регулятора давления и регистрирующего устройства сбора данных.

Насосная система

Насосная система необходима для поддержания постоянной скорости подвижной фазы. Колебания давления должны быть сведены к минимуму, например, путем пропускания сжатого растворителя через устройство, подавляющее пульсацию. Трубы и соединения способны выдерживать давление, создаваемое насосной системой.

Точная доставка подвижной фазы при постоянных или изменяющихся по определенной программе условиях осуществляется системами, контролируемыми микропроцессором. В случае градиентного элюирования могут быть использованы насосные системы, доставляющие растворитель(и) из нескольких резервуаров. Смешивание растворителей может быть достигнуто как со стороны насоса(ов), имеющего низкое давление, так и со стороны насоса(ов), имеющего(их) высокое давление.

Устройство для ввода проб (инжекторы)

Ввод пробы осуществляется непосредственно в колонку с помощью специального крана-дозатора.

Неподвижные фазы

Неподвижные фазы находятся в колонках, описанных в разделах общих фармакопейных статей 2.1.2.28. Высокоэффективная жидкостная хроматография (набивные колонки) и 2.1.2.27. Газовая хроматография (капиллярные колонки). Максимальный внутренний диаметр (\text{Ø}) капиллярной колонки составляет 100 мкм.

Подвижные фазы

Обычно в качестве подвижной фазы используют углерода диоксид, который может содержать полярный модификатор, например, метанол, 2-пропанол или ацетонитрил. Состав, давление (плотность), температура и скорость потока подвижной фазы, указанные в частной фармакопейной статье или нормативном документе по качеству, могут быть либо постоянными в течение всего хроматографического процесса (изократическое, изотермическое элюирование, элюирование при постоянной плотности), либо изменяться по определенной программе (градиентное элюирование модификатора, давление (плотность), температура или скорость потока).

В качестве других подвижных фаз допускается использование азота (I) оксида, аммиака, метанола, н-бутана, диэтилового эфира, дифтордихлорметана.

Детекторы

Наиболее часто используются спектрофотометрические детекторы, работающие в ультрафиолетовой и видимой областях (UV/Vis), масс-спектрометрический детектор и пламенно-ионизационные детекторы. Допускается использование детекторов по светорассеянию, ИК-спектрофотометров, детекторов по теплопроводности или других специальных детекторов.

МЕТОДИКА

Испытуемый(ые) раствор(ы) и раствор(ы) сравнения готовят в соответствии с указаниями в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству.

Критерии оценки пригодности хроматографической системы описаны в общей фармакопейной статье 2.1.2.36. Хроматографические методы разделения. Пределы, в которых могут корректироваться параметры хроматографической системы для соответствия требованиям пригодности системы, также приведены в указанной общей фармакопейной статье.

201020053-2022

2.1.2.53 Рамановская спектрометрия

Рамановская спектрометрия (неупругое рассеяние света или спектрометрия комбинационного рассеяния - процесс рассеяния света, при котором испытуемый образец облучается интенсивным монохроматическим светом (обычно излучение лазера) и для света, рассеиваемого образцом, определяется сдвиг частоты.

Рамановская спектрометрия является дополнительным методом по отношению к ИК-спектрометрии в том смысле, что оба этих метода основаны на молекулярных колебаниях частиц испытуемого вещества. Однако рамановская и ИК-спектрометрия отличаются по относительной чувствительности для различных функциональных групп. Рамановская спектрометрия особенно чувствительна к неполярным связям (например, одинарные или кратные связи C-C), тогда как вода, для которой характерно сильное поглощение в ИК-области, обладает слабым рамановским рассеянием и поэтому хорошо подходит на роль растворителя в рамановской спектрометрии.

Прибор. Спектрометры для получения рамановских спектров обычно состоят из следующих компонентов:

• источник монохроматического света, чаще всего лазер с длиной волны в ультрафиолетовой, видимой или ближней инфракрасной области;
• подходящая оптика (линзы, зеркала, оптико-волоконные устройства), которые направляют возбуждающее излучение на образец и собирают свет, рассеиваемый образцом;
• оптическое устройство (монохроматор или фильтр), которое пропускает сдвинутое по частоте рамановское рассеяние и препятствует попаданию на детектор интенсивного света, частота которого равна частоте возбуждающего света (рэлеевское рассеяние);
• диспергирующее устройство (дифракционная решетка или призма), соединенное со щелью, регулирующей длину волны, и детектором (обычно фотоумножитель);

или:

• диспергирующее устройство (дифракционная решетка или призма), соединенное с многоканальным детектором (обычно прибор с зарядовой связью (ПЗС, CCD));

или:

• интерферометр с детектором, регистрирующий интенсивность рассеянного света во времени (например, компьютер и соответствующее программное обеспечение), и устройство обработки данных, которое с помощью Фурье-преобразования переводит данные в диапазон частот или волновых чисел.

ПОДГОТОВКА ОБРАЗЦА

Рамановские спектры могут быть получены для твердых веществ, жидкостей и газов, причем как помещенных в стеклянные контейнеры или трубки, как правило, без предварительной подготовки образца или растворения, так и напрямую.

Основным ограничением рамановской спектрометрии является флуоресценция примесей, которая мешает детектору улавливать значительно более слабый рамановский сигнал. Флуоресценции можно избежать при использовании в качестве возбуждающего света лазерного излучения с большой длиной волны, например, находящейся в ближней инфракрасной области. Интенсивность некоторых рамановских линий может быть усилена несколькими способами, например, путем использования резонансной рамановской спектрометрии (RR) или поверхностно-усиленной рамановской спектрометрии (SERS).

Из-за узости светового потока падающего лазерного излучения для получения спектра необходимо всего лишь несколько микролитров образца. Тем не менее следует учитывать неоднородность образца, если только его объем не увеличен, например, путем вращения.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СТАНДАРТНЫХ ОБРАЗЦОВ

Испытуемый образец и стандартный образец подвергают одинаковой обработке и затем при одинаковых условиях получают их спектры. Максимумы в спектре испытуемого образца должны совпадать по расположению и интенсивности с соответствующими максимумами в спектре стандартного образца Фармакопеи Евразийского экономического союза (СО ФЕАЭС). Если спектры, полученные для твердых веществ, имеют различия в положениях максимумов, испытуемый образец и стандартный образец подвергают одинаковой обработке для того, чтобы они выкристаллизовались или образовались в одинаковой форме, либо поступают так, как описано в частной фармакопейной статье, и затем снимают спектры.

Поскольку закон Бера-Ламберта для рамановской спектроскопии не выполняется, интенсивность рамановского излучения прямо пропорциональна концентрации рассеивающих частиц. Как и в случае других спектроскопических методов, количественное определение может быть проведено с использованием известных количеств или концентраций стандартных образцов. Вследствие небольшого пространственного разрешения метода следует обращать внимание на качество испытуемых образцов и стандартных образцов - например, необходимо быть уверенным в том, что они находятся в одном и том же физическом состоянии либо использовать внутренний стандарт для жидких образцов.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СПЕКТРАЛЬНЫХ БИБЛИОТЕК И СТАТИСТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ДЛЯ КЛАССИФИКАЦИИ И КАЛИБРОВКИ

Контроль за работой прибора. При использовании прибора следуют инструкциям производителя; регулярно, в зависимости от применения прибора и испытуемых образцов, проводят предписанные калибровки и испытания работы системы. При использовании рамановской спектрометрии для количественных определений либо при создании спектральных библиотек сравнения для (хемометрической) классификации или калибровки необходимо обращать особое внимание на то, чтобы были сделаны все поправки к измерениям либо предприняты меры для контроля за изменяемостью величин волновых чисел и интенсивности сигнала прибора.

Проверка шкалы волновых чисел. Шкалу волновых чисел рамановских сдвигов (обычно выражаемую в обратных сантиметрах) проверяют с помощью подходящих стандартов, которые имеют характерные максимумы при исследуемых величинах волновых чисел (например, органическое вещество, неоновая лампа или линии Ar+ плазмы из аргон-ионного лазера).

Калибровка прибора должна соответствовать типу образца, т.е. для твердых испытуемых образцов следует использовать твердые стандартные образцы, а для жидких - жидкие. Выбирают подходящее вещество (например, полистирол, парацетамол, циклогексан), для которого установлены точные значения сдвигов волновых чисел.

Таблица 2.1.2.53.-1. - Сдвиги волновых чисел (и допустимые отклонения) для полистирола, парацетамола и циклогексана

<1> Используют полистирольную пленку (например, толщиной 76 мкм), гранулы или стержень.

<2> СО ФЕАЭС парацетамола для квалификации оборудования, представляющий собой моноклинальную форму I.

<3> Циклогексан P.

<4> Не применимо в связи с выходом за пределы диапазона детектора.

Проверка шкалы интенсивностей. На абсолютную и относительную интенсивность рамановских полос могут оказывать влияние следующие факторы:

• поляризация падающего света;
• поляризация собирающей оптики;
• интенсивность падающего света;
• различия в отклике прибора;
• различия в фокусе и геометрии образца;
• различия в насыпной плотности для твердых образцов;
• показатель преломления n или изменение n (\Delta n) между образцом и окружающей средой;
• размер частиц и распределение частиц по размерам;
• сечение рассеяния;
• сечение поглощения.

Подходящие критерии приемлемости могут изменяться в зависимости от применения, но в большинстве случаев допустимы колебания (изо дня в день) в относительных интенсивностях полос +/- 10%.

Создание спектральных библиотек сравнения. Снимают спектры подходящего числа полностью исследованных (например, так, как описано в частной фармакопейной статье) веществ, имеющих отличия в производителе, серии, кристаллической модификации, размерах частиц и т.д., типичные для анализируемого материала. Набор спектров дает информацию, определяющую границы подобия или количественного определения, которые могут быть использованы для того, чтобы, например, идентифицировать вещество или проконтролировать его количество, образовавшееся в процессе производства. Количество веществ в базе данных зависит от особенностей ее применения. Подходящее математическое преобразование спектра рассеяния может облегчить качественное сравнение спектров (например, коррекция базовой линии, нормализация минимума-максимума, нормализация вектора, производные).

Селективность базы данных, которая позволяет уверенно идентифицировать конкретное вещество или отличить его от других материалов базы данных, устанавливается во время валидации. Для уверенности в пригодности базы данных эта селективность должна регулярно проверяться; в особенности это необходимо делать после любых значительных изменений, произошедших с веществом (например, изменения поставщика или производственного процесса), либо при настройке прибора для рамановской спектрометрии (например, при проверке шкалы волновых чисел или повторяемости отклика спектрометра)

Полученная таким образом спектральная библиотека пригодна только для данного прибора либо аналогичного при условии подтверждения достоверности работы библиотеки после переноса.

Методика. Подготовку и исследование образца проводят таким же образом, как и при создании базы данных. Для облегчения сравнения спектров и количественных расчетов могут быть использованы подходящие математические преобразования рамановских спектров.

Сравнение или преобразования спектров, количественный прогноз свойств веществ, находящихся в испытуемом образце, могут проводиться с использованием подходящих методов хемометрики, статистической классификации и калибровки.

201020054-2022

2.1.2.54 Методы вискозиметрии с падающим и катящимся шариками

Определение динамической вязкости ньютоновских жидкостей проводят, используя вискозиметр с падающим шариком или катящимся шариком, при температуре (20,0 +/- 0,1) °C, при отсутствии в частной фармакопейной статье других указаний температур. Измеряют время падения или движения шарика в испытуемой жидкости от одной отметки или датчика вискозиметра до другой.

ВИСКОЗИМЕТР С ПАДАЮЩИМ ШАРИКОМ

Оборудование. Вискозиметр с падающим шариком состоит из стеклянной трубки, заключенной в кожух, который позволяет контролировать температуру; 6 шариков различной плотности и диаметра, изготовленных из стекла, железно-никелевого сплава или стали. Трубку фиксируют таким образом, чтобы отклонение от вертикальной оси составляло (10 +/- 1)°. На трубке имеются две метки, определяющие расстояние падения шарика. К промышленным вискозиметрам прилагаются таблицы со значениями постоянных, плотности шариков и данные по пригодности различных шариков для использования в предполагаемом диапазоне вязкости.

Методика. Чистую, сухую трубку вискозиметра, предварительно выдержанную при температуре (20,0 +/- 0,1) °C, заполняют испытуемой жидкостью, избегая образования пузырьков. Подбирают в трубку шарик для получения времени падения не менее 30 с с учетом предполагаемого диапазона вязкости. Закрывают трубку и термостатируют раствор при температуре (20,0 +/- 0,1) °C в течение не менее 15 мин. Вначале пропускают шарик между двумя метками без измерения времени падения, во второй раз измеряют время падения шарика с верхней до нижней метки секундомером с точностью до 1/5 секунды. Испытание повторяют не менее 3 раз для получения не менее 4 значений времени падения шарика. Результат считается достоверным, если время последовательных 2 падений не отличаются более, чем на 1,5%.

Используя среднее значение времени падения шарика рассчитывают динамическую вязкость ( \eta , мПа·с) по формуле:

\eta = k(\rho_{1} - \rho_{2}) \cdot t ,

где: k - постоянная вискозиметра, в мм2/с2;

\rho_{1} - плотность используемого шарика, г/см3;

\rho_{2} - плотность испытуемой жидкости, в г/см3, полученная умножением относительной плотности (d_{20}^{20}) на 0,9982;

t - среднее время падения шарика между крайними метками, с.

АВТОМАТИЧЕСКИЙ ВИСКОЗИМЕТР С КАТЯЩИМСЯ ШАРИКОМ

Оборудование. Автоматический вискозиметр с катящимся шариком состоит из нескольких капилляров из стекла или других подходящих материалов с разными диаметрами, помещенных в термостатически контролируемый блок, позволяющий проводить точный контроль температуры; шариков из нержавеющей стали (необязательно имеющих покрытие) или других подходящих материалов; мотора-редуктора, который определяет местоположение капилляра под углом наклона от (10,0 +/- 0,2)° до (80,0 +/- 0,2)° от вертикальной оси. Прибор имеет не менее 2 датчиков для измерения времени движения шарика на заданном расстоянии. К промышленным вискозиметрам прилагаются таблицы со значениями их постоянных, плотности шариков и данные по пригодности различных капилляров для использования в предполагаемом диапазоне вязкости. Контроль температуры, контроль угла наклона, определение времени движения, повторы движений и расчет среднего значения и относительного стандартного отклонения выполняются программным обеспечением прибора.

Методика. Настраивают программное обеспечение таким образом, чтобы в результате проведения измерений получить 4 значения времени движения (2 цикла вперед/назад) и относительное стандартное отклонение не более 0,5%. Выбирают капилляр, шарик и угол наклона, подходящие для предполагаемого диапазона вязкости испытуемой жидкости, таким образом, чтобы время движения составляло не менее 20 секунд при перемещении на расстояние 100 мм или было пропорционально времени перемещения на другие расстояния. При отсутствии подключения вискозиметра к цифровому денситометру значение плотности испытуемой жидкости должно быть указано в программном обеспечении прибора. Чистый, сухой капилляр вискозиметра заполняют испытуемой жидкостью, избегая образования пузырьков. Начинают измерение незамедлительно после заполнения капилляра. Прибор автоматически рассчитывает динамическую вязкость ( \eta , мПа/с) и кинематическую вязкость (v, мм2/с).

201020055-2022

2.1.2.55 МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ С ИНДУКТИВНО-СВЯЗАННОЙ ПЛАЗМОЙ

Масс-спектрометрия с использованием индуктивно-связанной плазмы (МС-ИСП, ICP-MS - inductively coupled plasma-mass spectrometry) представляет собой метод, использующий индуктивно-связанную плазму (ИСП) в качестве ионизирующего источника. Основные принципы ИСП описаны в общей фармакопейной статье 2.1.2.41. Атомно-эмиссионная спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой (АЭС-ИСП).

В МС-ИСП используется способность ИСП генерировать заряженные ионы элементов, входящих в состав образца. Полученные ионы направляют в масс-спектрометр, который разделяет их в соответствии с отношением масса/заряд (m/z). Большинство масс-спектрометров имеют квадрупольные или магнитные анализаторы. Ионы переносятся из плазмы в ионную оптику через два конуса (конусы пробоотборника и сепаратора, образующие область интерфейса). Ионная оптика состоит из электростатических линз, которые переносят ионы из пространства с атмосферным давлением к масс-фильтру с давлением 10-8 Па или менее, поддерживаемым с помощью турбомолекулярного насоса. После фильтрации ионы с выбранным соотношением масса/заряд направляются на детектор (канальный электроумножитель, чашка Фарадея, диноды), где поток ионов конвертируется в электрические сигналы. Количественно элементы определяют по числу ионов, появляющихся и генерирующих электрические импульсы в единицу времени.

Система ввода образца и способы обработки данных аналогичны используемым в АЭС-ИСП.

ПРИБОР

Главными составляющими частями прибора являются:

• система ввода образца, состоящая из перистальтического насоса, подающего раствор с постоянной скоростью в распылитель;
• радиочастотный (РЧ) генератор;
• плазменная горелка;
• область интерфейса, включающая в себя конусы для переноса ионов в ионную оптику;
• масс-спектрометр;
• детектор;
• блок сбора данных.

ИНТЕРФЕРЕНЦИЯ

Наибольшей проблемой является массовая интерференция. Например, изобарические разновидности значительно перекрывают массовый сигнал искомых ионов, особенно в центральной части диапазона масс (например, 40 - 80 а.е.м.). Комбинация атомных ионов приводит к полиатомной или молекулярной интерференциям (то есть 40Ar16O с 56Fe или 40Ar40Ar с 80Se). Матрица, в случае с некоторыми определяемыми элементами, также может вызывать интерференцию. Некоторые образцы оказывают влияние на образование капель или на температуру ионизации в плазме. Эти явления могут приводить к подавлению аналитического сигнала определяемого элемента, оказывая влияние на достоверность результата. Обойти физическую интерференцию можно, используя метод внутреннего стандарта или метод стандартных добавок. Выбор элемента, используемого в качестве внутреннего стандарта, зависит от исследуемого элемента: например, в качестве внутренних стандартов могут быть использованы 59Co и 115In.

Основной характеристикой приборов МС-ИСП является разрешение, то есть эффективность разделения двух близких масс. С этой точки зрения приборы с квадрупольными анализаторами уступают приборам с магнитными анализаторами.

МЕТОД

ПРОБОПОДГОТОВКА И ВВОД ОБРАЗЦА

Пробоподготовка обычно включает в себя стадию разложения матрицы с помощью подходящего метода, например, в микроволновой печи. Кроме того, необходимо обеспечить попадание концентрации определяемого элемента разведением или концентрированием в рабочий диапазон прибора и получение раствора испытуемого образца, способного воспроизводимо распыляться.

Некоторые распылительные системы устойчивы к действию высоких концентраций кислот, но использование серной и фосфорной кислот может оказывать влияние на базовую линию ИСП-спектров. Более предпочтительным является использование азотной и хлороводородной кислот. Фтористоводородную кислоту можно использовать при наличии устойчивых к ней (например, из перфторалкоксиполимера) систем ввода образца и горелок. При выборе метода ввода образца учитывают требования по чувствительности, стабильности, скорости, размеру образца, устойчивости к коррозии и устойчивости к закупорке. В большинстве случаев подходит использование распылителя с поперечным потоком вместе с распылительной камерой и горелкой. Перистальтический насос подает испытуемый раствор и раствор сравнения со скоростью 20 - 1000 мкл/мин.

В случае использования органических растворителей необходимо обеспечить разделение кислорода и органических слоев.

ВЫБОР УСЛОВИЙ ПРОВЕДЕНИЯ АНАЛИЗА

При выборе условий проведения анализа следуют рекомендациям производителя прибора. Анализ водных растворов и органических растворителей обычно происходит при различных условиях. Надлежащим образом должны быть выбраны следующие аналитические параметры:

• подбор конусов (материал пробоотборника и сепаратора);
• скорости потоков газа-носителя (внешняя, промежуточная и внутренняя трубки горелки);
• мощность радиочастотного излучения;
• скорость насоса;
• должен быть осуществлен выбор одного или более изотопов измеряемого элемента (масса).

ВЫБОР ИЗОТОПОВ

Выбор изотопов осуществляют по нескольким критериям. Для получения максимальной чувствительности выбирают наиболее распространенный изотоп данного элемента. Кроме того, следует выбирать изотоп с минимальной интерференцией, вызываемой другими видами изотопов, присутствующими в матрице и в газе-носителе. В программном обеспечении производителей приборов МС-ИСП обычно присутствует информация об изобарической интерференции и интерференции, вызываемой полиатомными ионами, например, гидридными, оксидными, хлоридными и т.д.

КОНТРОЛЬ РАБОТОСПОСОБНОСТИ ПРИБОРА

Пригодность системы

Настройка прибора позволяет проверять и регулировать измерение перед введением образца. Точность определения масс прибором МС-ИСП проверяют с помощью раствора для настройки, содержащего несколько изотопов, охватывающих весь диапазон, например, 9Be, 59Co, 89Y, 115In, 140Ce и 209Bi.

Записывают чувствительность и кратковременную и долговременную стабильность. Параметры прибора (состояние плазмы, параметры ионных линз и квадруполей) настраивают на получение максимально возможного числа обнаружений ионов.

Для подтверждения наблюдения приемлемого отклика в широком диапазоне масс разрешение и ось масс настраивают с использованием раствора, содержащего Li, Y и Tl.

Для уменьшения интерференции необходимо оценить эффективность разложения плазмой некоторых оксидов. Хорошими индикаторами являются отношения Ce/CeO и (или) Ba/BaO, требуемый уровень при этом должен составлять менее 3%.

Подавление образования двухзарядных ионов осуществляют с использованием Ba и Ce. Отношение сигнала двухзарядных ионов к определяемому элементу должно быть менее 2%.

Долговременную стабильность проверяют, измеряя стандарт в начале и в конце испытания образца, при этом проверяется влияние отложения солей в конусах на уменьшение сигнала во время испытания.

ВАЛИДАЦИЯ МЕТОДИКИ

Методику, приведенную в частной фармакопейной статье или нормативном документе по качеству, верифицируют через определенное время для получения удовлетворительных результатов.

ЛИНЕЙНОСТЬ

Готовят и анализируют не менее четырех растворов сравнения, концентрация которых находится в пределах диапазона калибровки, и контрольный раствор. Проводят не менее пяти измерений.

Используя все полученные данные, рассчитывают линейное уравнение графика методом наименьших квадратов. Строят кривую регрессии, отмечая средние значения, измеренные значения и доверительный интервал калибровочного графика. Методика является пригодной при условии соблюдения следующих требований:

• коэффициент корреляции должен быть не менее 0,99;
• на калибровочном графике погрешности каждого калибровочного уровня должны быть распределены случайным образом.

Рассчитывают среднее значение и относительное стандартное отклонение для наименьшего и наибольшего калибровочного уровня.

В случае если отношение рассчитанного стандартного отклонения наименьшего и наибольшего калибровочного уровня менее 0,5 или более 2,0, то более точная оценка калибровочного графика может быть получена с использованием взвешенной линейной регрессии. Линейная и квадратичная весовая функции применяются к полученным данным для нахождения наиболее подходящей для использования весовой функции. Если средние значения при сравнении с калибровочным графиком проявляют отклонение от линейности, используют двухмерную линейную регрессию.

ПРАВИЛЬНОСТЬ

Предпочтительно верифицировать правильность с использованием сертифицированных стандартных образцов. Если это невозможно, проверяют открываемость.

Открываемость. В случае методик количественного определения открываемость должна быть от 90% до 110%. Для других определений, например для определения следовых количеств элемента, открываемость должна быть от 80% до 120% от теоретического значения. Открываемость может быть определена с использованием подходящего раствора сравнения (матричного раствора), содержащего известное количество определяемого элемента (средняя концентрация калибровочного графика).

ПОВТОРЯЕМОСТЬ

Повторяемость должна быть не более 3% для количественного определения и не более 5% для испытания на содержание примесей.

ПРЕДЕЛ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Удостоверяются, что предел количественного определения (например, определенный с использованием приближения 10\sigma ) ниже измеряемого значения.

201020056-2022

2.1.2.56 Анализ гликанов в гликопротеинах

1. ВВЕДЕНИЕ

Анализ гликанов - комплекс испытаний для исследования олигосахаридных цепей (гликанов) гликопротеинов. Он может включать в себя:

• анализ цельного гликопротеина;
• разделение и обнаружение гликоформ белка;
• анализ гликопептидов, полученных после ферментативной обработки гликопротеина;
• анализ отщепленных гликанов, полученных после химической или ферментативной обработки гликопротеина.

Анализ моносахаридов может служить дополнением к информации, полученной при анализе гликанов.

Гликозилирование может играть важную роль в проявлении лекарственным средством биологического происхождения его функциональных, фармакокинетических, фармакодинамических и иммуногенных свойств, а также его устойчивости. Гликозилирование, в отличие от транскрипции, является процессом ферментативной модификации, не имеющим матричного управления, результатом чего является гетерогенность гликанов. На гетерогенность также влияет процесс получения. Поэтому анализ гликанов гликопротеинов является важным испытанием для идентификации изменений в схеме гликозилирования гликопротеинов и (или) для наблюдения за стабильностью схемы гликозилирования при производстве.

Анализ гликанов может быть сравнительным методом, потому что полученная информация, при сравнении с аналогично анализируемым стандартным образцом, подтверждает соответствие испытуемого образца.

В данной общей фармакопейной статье представлены подходы, используемые для анализа гликанов, входящих в состав гликопротеинов и требования к использованию и валидации методов.

Анализ гликанов не является единым общим методом, а включает в себя применение определенных процедур и получение специфических профилей гликанов для каждого гликопротеина. Особые процедуры указываются в соответствующих частных фармакопейных статьях или нормативном документе по качеству.

1.1 ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЕ БЕЛКОВ

Существует 3 вида ферментативного гликозилирования белков:

• N-гликозилирование: присоединение олигосахаридов через атом азота терминальной амидной группы аспарагина;
• O-гликозилирование: присоединение олигосахаридов через гидроксильные группы серина, треонина и (или) гидроксипролина;
• C-гликозилирование: присоединение \alpha - \text{маннопиранозы} к C2-углероду индольного цикла триптофана.

Присоединение без участия ферментов, также известное как гликирование, может происходить при инкубировании белков с восстанавливающими сахарами.

1.2 ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ГЛИКОЗИЛИРОВАНИЯ БЕЛКОВ

При производстве гликопротеинов может проявляться различная степень гетерогенности гликанов. Неоднородность может появиться в результате изменчивости:

• по степени занятости (полная, частичная, свободная);
• по типу (N- или O-опосредованное);
• по структуре олигосахарида (протяженность, разветвленность, тип соединения).

Неоднородность гликозилирования приводит к наличию набора гликоформ у каждого отдельного гликопротеина. Эти разновидности возникают из-за того, что процесс гликозилирования, в отличие от транскрипционных или трансляционных процессов биосинтеза, не имеет матричного управления и представляет собой процесс посттрансляционного изменения молекулы.

Структура гликозилирования в выбранной части зависит от многих факторов, включая присутствие ферментов гликозилтрансфераз и экзогликозидаз (зависящее от специализации клетки и (или) от степени ее развития), обнаруживаемых в аппарате Гольджи и в эндоплазматической ретикулярной сети клетки.

Процесс гликозилирования зависит также от структуры белка, процесса получения, экспрессии системы "хозяин-векторная ДНК" и от режима культивирования клеток.

2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ГЛИКАНОВ

Гетерогенность в гликозилировании может быть оценена четырьмя отдельными и взаимодополняющими методами:

• анализ интактного гликопротеина;
• анализ гликопептидов;
• анализ отщепленных гликанов;
• анализ моносахаридов.

В настоящей статье представлены методы и общие требования, применяемые для анализа гликанов в гликопротеинах, содержащих N- и O-связанные гликаны.

Анализ гликанов обычно представляет собой многоступенчатый процесс. Существует большое количество методик анализа гликанов, обусловленное разнообразием и сложностью гликановых структур, числом доступных методик и систем детектирования, а также широким выбором подходов, в зависимости от уровня необходимой информации.

На рисунке 2.1.2.56.-1 представлена схема аналитических методик анализа гликанов, которая может быть использована для выбранного подхода (подходов). Вследствие разнообразия и сложности структуры и происхождения гликанов, доступны различные вариации одних и тех же методик и условий.

Рисунок 2.1.2.56.-1. - Общая схема методик анализа гликанов. Условные обозначения: КЭ - капиллярный электрофорез; АОХ - анионообменная хроматография при высоких значениях pH с импульсным амперометрическим детектированием; ИЭФ - изоэлектрическое фокусирование; ЖХ - жидкостная хроматография; МС - масс-спектрометрия; ПГХ-хроматография с использованием пористого графитированного углерода; ДСН-ПААГ электрофорез - электрофорез с натрия додецилсульфатом в полиакриламидном геле.

Выделение и очистка. Выделение и очистка могут быть необходимы для анализа фармацевтических субстанций или для анализа лекарственных форм, содержащих мешающие вспомогательные вещества, и описываются в частных фармакопейных статьях или нормативном документе по качеству.

2.1 АНАЛИЗ ИНТАКТНЫХ ГЛИКОПРОТЕИНОВ

Анализ интактного гликопротеина предоставляет информацию о гликозилировании гликопротеина в целом.

В том случае, если молекула крупная и имеет многочисленные положения гликозилирования, этот подход дает ограниченное количество информации.

Могут использоваться такие методы, как капиллярный электрофорез (2.1.2.37) и масс-спектрометрия (2.1.2.51). Методы, с основу которых положены свойства, связанные с размером молекулы, такие как эксклюзионная хроматография (2.1.2.29) и электрофорез с натрия додецилсульфатом в полиакриламидном геле (2.1.2.30), могут предоставлять информацию о состоянии гликозилирования белка. Если степень сиалирования значительно влияет на биологическую активность гликопротеина, то для ее мониторинга могут быть использованы ионообменная хроматография (2.1.2.36), изоэлектрическое фокусирование (2.1.2.38) или капиллярный электрофорез (2.1.2.37). Должна быть выбрана методика, обеспечивающая достоверную корреляцию между степенью сиалирования и биологической активностью продукта.

2.2 АНАЛИЗ ГЛИКОПЕПТИДОВ

Анализ гликопептидов обеспечивает получение информации о свойствах гликозилирования, характерных для данного участка молекулы, степени занятости и о структуре олигосахаридов. Он включает протеолитическое расщепление гликопротеинов. Подходы к расщеплению белкового остова в зависимости от местоположения представлены в общей фармакопейной статье 2.1.2.39. Пептидное картирование.

После протеолиза гликопротеина могут быть выбраны следующие подходы.

Прямой анализ методом масс-спектрометрии (2.1.2.51). Необходимо тщательно следить, чтобы сигнал гликопептида не подавлялся присутствием других пептидов, так как гликопептиды составляют малую долю в общей смеси пептидов и интенсивность сигнала у них меньше, чем у негликозилированных пептидов.

Разделение, предшествующее анализу методом масс-спектрометрии. Эта дополнительная стадия помогает преодолеть проблемы, упомянутые выше. Методы обогащения и фракционирования могут сочетаться с прямым анализом как параллельно, так и последовательно. Такие методы разделения как жидкостная хроматография (2.1.2.28) и капиллярный электрофорез (2.1.2.37) также пригодны. Эти методы могут быть совмещены с методом масс-спектрометрии, позволяя получать результаты в режиме реального времени (on-line).

Дегликозилирование гликопептидов. Сравнение пептидных карт, полученных после протеолитического расщепления интактного гликопротеина и дегликозилированного до или после протеолитического расщепления, дает возможность идентифицировать различные молекулы. Пептидная масса предоставляет информацию о гликозилированных участках и с помощью подсчета разницы масс между интактным и дегликозилированным гликопептидом можно получить информацию о составе и гетерогенности присоединенных гликанов. Способы дегликозилирования белкового остова представлены в разделе 2.3.1 данной общей фармакопейной статьи. Стадия разделения может быть проведена до или после дегликозилирования.

2.3 АНАЛИЗ ОТЩЕПЛЕННЫХ ГЛИКАНОВ

Проведение анализа отщепленных гликанов позволяет получать информацию о многообразных семействах гликанов, связанных с белком (профилирование по характеру ветвления: двойное, тройное или более высокого порядка). На этой стадии определяют также степень сиалирования. В зависимости от выбранного метода, для детектирования гликанов может быть необходима предварительная дериватизация/мечение.

Анализ отщепленных гликанов обычно включает в себя отщепление и выделение гликанов из реакционной смеси, сопровождающиеся с последующим маркированием и (или) дериватизацией гликанов (где это необходимо), после чего гликаны профилируют в соответствии со специфическими свойствами (фракционирование или разделение).

2.3.1 Отщепление гликанов

Выбор метода отщепления гликанов зависит от природы гликопротеина. Выбор реактива, применяемого для отщепления, зависит от выбора типа отщепления и от объема той информации, которая должна быть получена в результате испытания: может применяться ферментативное или химическое отщепление. В таблице 2.1.2.56.-1 представлен неполный перечень реактивов ферментативного отщепления и их субстратная специфичность.

Таблица 2.1.2.56.-1. - Перечень реактивов ферментативного отщепления и их субстратная специфичность

<*> Код фермента в соответствии с классификацией Международного союза по биохимии и молекулярной биологии (IUBMB).

<**> Данный фермент используется редко из-за своей высокой специфичности к субстрату.

Обычно эффективность расщепления зависит от доступности гликанов в гликопротеине. Следовательно, для увеличения доступности мест гликозилирования белок может быть денатурирован, за исключением случаев, когда необходимо профилировать гликаны по их положению в структуре молекулы (на поверхности или погружены в структуру молекулы протеина).

Для отщепления гликанов могут быть использованы химические реактивы, например, для отщепления по типу \beta - \text{элиминирования} используют гидразин или борогидриды щелочных металлов.

2.3.2 Анализ гликанов

Анализ отщепленных гликанов или их профилирование могут быть осуществлены с помощью методов хроматографии, электрофореза, масс-спектрометрии или комбинирования этих методов. Выбор метода производят в зависимости от природы гликанов и объема необходимой информации.

Анализ гликанов предоставляет информацию о различных видах гликанов, присутствующих в белке (с высоким содержанием маннозы, комплексных, гибридных). Информация об относительных количествах разветвленных структур может быть получена с помощью анализа десиалированных гликанов.

Если необходимо разделение в качестве обязательной стадии, то в качестве промежуточных методов используют методы жидкостной хроматографии (2.1.2.28) и капиллярного электрофореза (2.1.2.37). Жидкостная хроматография (2.1.2.28) может применяться как препаративная, со сбором отдельных фракций (обычно требуется мечение), или может быть совмещена непосредственно с масс-спектрометрией (2.1.2.51).

2.3.2.1 Анализ немеченых гликанов

Анализ нативных немеченых гликанов может осуществляться методами анионообменной хроматографии при высоких значениях pH с импульсным амперометрическим детектированием, хроматографии с использованием пористого графитированного углерода, или масс-спектрометрии (2.1.2.51).

Метод анионообменной хроматографии при высоких значениях pH с импульсным амперометрическим детектированием имеет высокую чувствительность, а также позволяет разделять изомеры, отличающиеся по месту связывания. Факторы отклика различных сигналов у олигосахаридов различной структуры неодинаковы. Абсолютное количественное определение гликана затруднительно, кроме случаев, когда доступна информация о библиотеке стандартных образцов олигосахаридов. Количественное определение возможно в сравнении с хорошо исследованным стандартным образцом испытуемого вещества или путем соотнесения площади пика каждого гликана с общей площадью пиков всех гликанов на профиле.

Хроматография с использованием пористого графитированного углерода может применяться для разделения гликанов в естественном состоянии, поскольку используемые при этом колонки по своей высокой селективности сравнимы с обычно используемыми обращенно-фазными колонками (неполярными). Сочетанное применение методов хроматографии с использованием пористого графитированного углерода и масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением может использоваться для прямого анализа гликана.

2.3.2.2 Анализ маркированных гликанов

Маркирование гликанов

Тип производимого химического изменения (дериватизации) зависит от метода, используемого для детектирования гликанов: УФ или флуоресцентный.

Дериватизация с флуоресцентными метками - наиболее используемый метод для маркирования гликанов по восстанавливающему концу молекулы путем восстановительного аминирования. Одна метка может быть присоединена к каждому одинарному моно- и олигосахариду, позволяя определить молярное количество. В таблице 2.1.2.56.-2 приведен неполный список обычно используемых флуоресцентных маркеров и подходящих аналитических методов.

Таблица 2.1.2.56.-2. - Примеры флуоресцентных меток и подходящих аналитических методов

Для детектирования с использованием только масс-спектрометрии (2.1.2.51) также может использоваться предельное метилирование гликанов. Оно основано на метилировании олигосахаридов.

Анализ маркированных гликанов

Маркированные гликаны могут быть проанализированы с помощью таких аналитических методов, как жидкостная хроматография (2.1.2.28), капиллярный электрофорез (2.1.2.37) и масс-спектрометрия (2.1.2.51).

В соответствии со свойствами разделяющихся гликанов, они могут быть профилированы и определены количественно с использованием подходящего маркера с помощью нескольких систем жидкостной хроматографии (2.1.2.28): обращенно-фазная (разделение по гидрофобности), нормально-фазная (разделение по размеру), и анионообменная (разделение по заряду) жидкостная хроматография.

2.4 АНАЛИЗ МОНОСАХАРИДОВ

Анализ моносахаридов дает информацию о моносахаридной структуре гликопротеина. Анализ может быть выполнен как колориметрическими, так и разделительными методами.

2.4.1 Колориметрические методы

Колориметрические методы, основанные на химическом окрашивании, дают информацию о количестве специфических классов сахаров, таких как сиаловые кислоты, нейтральные сахара и гексозамины.

2.4.2 Методы разделения

Методы разделения позволяют получать количественные данные об общем составе моносахаридов. Перед использованием методов требуется предварительный кислотный гидролиз олигосахаридных цепей интактных гликопротеинов или отщепленных гликанов. Для отщепления сиаловых кислот применяется умеренный кислотный гидролиз или ферментативная обработка. Стадия гидролиза - это значимый источник вариабельности, и она требует продукт-специфичной валидации.

Методы разделения и количественного определения моносахаридов включают:

• использование анионообменной хроматографии при высоких значениях pH с импульсным амперометрическим детектированием и хроматографии с использованием пористого графитированного углерода с масс-спектрометрическим детектированием, что позволяет определять мольные количества моносахаридов в естественном состоянии (сиаловые кислоты, нейтральные сахара и альдиты);
• флуорофорное мечение моносахаридов с последующим использованием методов разделения, таких как обращенно-фазная или ионообменная хроматография или капиллярный электрофорез.

3. ОЦЕНКА И АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ

Исследование и оценка результатов, полученных в ходе анализа гликанов, производится с 3 различными целями:

• подтверждение подлинности индивидуальных структур или групп структур;
• подтверждение соответствия испытуемого образца при качественном анализе;
• подтверждение соответствия испытуемого образца при количественном анализе.

Особые соображения касательно стандартных образцов и методов проведения каждой стадии анализа приведены в разделах 4 и 5 соответственно.

3.1 ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ПОДЛИННОСТИ ИНДИВИДУАЛЬНЫХ СТРУКТУР ИЛИ ГРУПП СТРУКТУР

Аналитической мишенью метода анализа гликанов может быть отдельный моносахарид (например, сиаловая кислота, фукоза), определенная олигосахаридная структура (например, тетра-сиалиловый, тетра-антеннальный гликан) или группа структур, имеющая общую аналитическую особенность (например, тетра-сиалиловые гликаны, три-антеннальные гликаны, гликопротеиновые изоформы с одинаковым зарядом). Подтверждение подлинности аналитической мишени - это важнейший шаг при анализе и оценке результатов, который может быть достигнут абсолютно путем подтверждения молекулярной структуры, или сравнительно - путем сравнения с соответствующим стандартным образцом.

3.1.1 Абсолютное подтверждение подлинности

Абсолютное подтверждение подлинности гликановых структур выполняется обычно во время разработки лекарственного средства, и оно не обязательно является целью рутинного анализа. Подлинность аналитической мишени устанавливают с помощью известного молекулярного свойства молекулы. Такая абсолютная идентификация индивидуальных структур требует многоступенчатых подходов, включающих в себя ферментативные и химические реакции, разделительные методики и on-line или off-line методы детектирования, и обычно использует в качестве основополагающего принципа для подтверждения структуры отношение заряда к массе молекулярного иона, которое определяется подходящим масс-спектрометрическим методом.

3.1.2 Сравнительное определение подлинности

При рутинном применении аналитического метода подлинность аналитической мишени может быть подтверждена путем сравнения со стандартными образцами процесса или пригодности системы. Они могут быть получены из известных хорошо изученных гликопротеинов, которые могут принадлежать тому же классу, что и испытуемый образец (например, фетуин для N-связанных гликопротеинов), или могут быть произведены из хорошо изученной серии испытуемого продукта, которая была определена как стандартный образец. Следующие утверждения применяются к сравнительному определению структурной подлинности:

• в случае подтвержденной высокой воспроизводимости времени удерживания, для корректной интерпретации может быть использовано абсолютное время удерживания;
• в качестве альтернативы, в начале и в конце испытания может быть введен гликановый маркер для проверки любых отклонений времени удерживания; на основе этих эталонных хроматограмм могут быть интерпретированы гликаны испытуемых образцов;
• в случаях, когда стандартный образец для определения всех пиков гликанов в испытуемом образце отсутствует, для контролирования и мечения неизвестных пиков гликанов может использоваться абсолютное или нормализованное время удерживания.

3.2 ПОДТВЕРЖДЕНИЕ СООТВЕТСТВИЯ ИСПЫТУЕМОГО ОБРАЗЦА ТРЕБОВАНИЯМ КАЧЕСТВА

На этом этапе определения, аналитические результаты, полученные для испытуемого образца, оцениваются на предмет соответствия спецификации. Обычно это достигается путем сравнения с данными, полученными при параллельном испытании соответствующего стандартного образца. При оценке данных необходимо:

• для проверки пригодности системы установить, что аналитический результат, полученный при использовании стандартного образца, соизмерим с ожидаемым результатом; например, при профилировании гликанов это будет достигнуто путем сравнения профиля стандартного образца с представленным профилем образца, полученным при создании этого стандартного образца и с помощью подтверждения всех критериев пригодности системы;
• доказать сходство профилей стандартного образца и испытуемого образца, используя любые специфические критерии пригодности, указанные в частной фармакопейной статье или нормативном документе по качеству.

3.3 ПОДТВЕРЖДЕНИЕ СООТВЕТСТВИЯ ИСПЫТУЕМОГО ОБРАЗЦА ТРЕБОВАНИЯМ КОЛИЧЕСТВЕННОГО АНАЛИЗА

3.3.1 Количественное определение содержания анализируемого вещества и представление результатов

В некоторых случаях, например, при определении сиаловой кислоты или других моносахаридов, данные предоставляют в виде молярного соотношения сиаловой кислоты к гликопротеину. Данные рассчитывают с учетом стандартного образца сиаловой кислоты и валидированного метода определения белка. Может быть использован как метод внутреннего стандарта, так и метод внешнего стандарта (2.1.2.36).

3.3.2 Способы количественного выражения профиля разделения

Профили или схемы распределения могут быть представлены в численной форме многими способами, включая методику нормализации; процент содержания каждой аналитической мишени, например, части гликана, рассчитывают путем определения отклика части гликана как процентную составляющую общего отклика всех частей, не учитывая отклики растворителей, других добавленных реактивов и сигналов ниже неучитываемого предела. Кроме того, могут использоваться такие численные выражения, как Z число, которые специфичны методу и продукту, и описаны в частных фармакопейных статьях.

4. СТАНДАРТНЫЕ ОБРАЗЦЫ

Стандартные образцы для анализа гликанов используют в двух целях: проверка пригодности системы и подтверждение соответствия испытуемого образца специфицированным требованиям.

Стандартными образцами, использующимися для проверки пригодности системы, могут быть:

• стандартный образец испытуемого вещества;
• олигосахаридная цепь, отщепленная от полностью изученного стандартного образца испытуемого вещества;
• хорошо изученные олигосахаридные цепи, отщепленные от гликопротеинов (например, фетуин, IgG);
• производные гликанов (меченые гликаны), для которых подтверждена подлинность и чистота (количественное содержание).

Стандартный образец, используемый для получения заключения о соответствии испытуемого гликопротеина, представляет собой препарат из испытуемых веществ. Методики анализа гликанов, описанные в частных фармакопейных статьях, предписывают использование стандартного образца для испытуемого вещества, для которого валидирована методика анализа.

5. ЭТАПЫ РАЗРАБОТКИ МЕТОДИК И ИХ ВАЛИДАЦИЯ

В данном разделе представлены способы оценки исполнения метода в целом, при его разработке. Степень разработки метода и аналитическая валидация выбирается на основе их пригодности для определенного продукта. В зависимости от выбранного метода, для анализа гликанов необходимы определенные действия, например как:

• выделение и очистка (или деминерализация) гликопротеина;
• ферментативная (или химическая) обработка гликопротеина с целью избирательного отщепления от "опорного" белка только N- или только O-связанных гликанов;
• выделение и очистка отщепленных гликанов;
• контроль отщепленной сиаловой кислоты и моносахаридных остатков;
• хромофорное мечение отщепленных гликанов;
• разделение гликанов, нативных или флуоресцентно-меченных;
• идентификация и количественное определение гликанов (например, вычисление Z числа);
• определение положений связывания на основании относительных количеств гликозилированных и негликозилированных пептидов.

Выделение и очистка белков. Для удаления мешающих веществ (например, вспомогательные вещества, соли) могут понадобиться выделение и очистка гликопротеинов из матрицы, что при необходимости, описывают в частной фармакопейной статье. Методики очистки должны быть валидированы на предмет воспроизводимости, чтобы гарантировать постоянство количественной открываемости белка.

Отщепление и выделение олигосахаридов. Подход, выбранный для отщепления гликанов, зависит от анализируемых белков и основан на типе гликозилирования, т.е. N- или O-связанное гликозилирование. Применение не указанных в фармакопее методов отщепления гликанов возможно только после оптимизации этих методов с целью подтверждения количественного профилирования всех гликановых частей молекулы. Оптимизированы должны быть все факторы, которые обладают существенным влиянием на эффективность отщепления, например: относительная концентрация фермент/белок, температура, течение реакции во времени, денатурирование белка до начала отщепления.

Следует отметить, что ферментативная/химическая реакция не должна изменять строение гликана, например, не должна разрушать остатки сиаловой кислоты. Там, где присутствует более одного положения гликозилирования, при ферментативной обработке должны пропорционально отщепляться все фрагменты олигосахаридов, присоединенные к белку, независимо от их структуры и своего конкретного места в белке. Должна быть подтверждена открываемость всех гликановых составляющих из реакционной смеси.

Дериватизация отщепленных гликанов. Дериватизацию обычно выполняют в соответствии с методиками, не описанными в фармакопее. По этой причине повторная дериватизация всех гликановых групп должна верифицироваться, что может быть достигнуть при оптимизации условий реакций, таких как количество реактивов дериватизации, температура и время реакции. Реакция дериватизации не должна изменять строение гликана, например не должна разрушать остаток сиаловой кислоты.

Разделение, идентификация и проверка пригодности системы. Методы, применяемые для анализа гликанов, должны быть способны детектировать и разделять различные гликановые части молекулы, обеспечивая надежную идентификацию и количественный анализ гликанов.

Критерии приемлемости для проверки пригодности системы, а также расщепления, открываемости и анализа гликанов, зависят от критических параметров испытания, которые влияют на конечный результат.

Сравнение гликановых профилей испытуемого образца и стандартного образца, полученных в одинаковых условиях, является параметром для оценки правильности выполнения аналитической методики. Для дальнейшего подтверждения полученных результатов, анализы могут быть повторно проведены с помощью независимого метода. Использование стандартного образца (например, стандартный образец испытуемого вещества, маркер гликана для проверки пригодности системы) является необходимым для установления параметров пригодности системы и валидации аналитической методики.

Воспроизводимость результатов количественного определения (например, расчет Z числа) гликана должна быть подтверждена.

Определение положений связывания, на основании относительных количеств гликозилированных и негликозилированных пептидов. В том случае, если степень гликозилирования оценивается путем сравнения содержания гликозилированных и негликозилированных пептидов после ферментативного расщепления, должна быть доказана воспроизводимость отщепления для обеих форм пептида.

6. СХЕМА ПРИНЯТИЯ РЕШЕНИЙ ПРИ АНАЛИЗЕ ГЛИКАНОВ

Эта система принятия решений приводится для информации и не является обязательной частью фармакопеи.

Выбор методик, используемых для анализа гликанов, производится в соответствии с тем объемом данных, который необходим для подтверждения качества гликопротеина и происходит на стадии разработки продукта.

Схема выбора методики для проведения анализа гликанов представлена на рисунке 2.1.2.56.-2.

Рисунок 2.1.2.56.-2. - Схема выбора методики для проведения анализа гликанов

201020057-2022

2.1.2.57 Вольтаметрическое титрование

Конечная точка титрования при вольтаметрическом титровании представляет собой величину изменения напряжения, измеренного между двумя электродами (одним индикаторным электродом и одним электродом сравнения, или двумя индикаторными электродами), погруженными в испытуемый раствор при поддержании постоянного тока, как функцию количества прибавленного титранта.

Прибор. Прибор состоит из регулируемого источника тока и вольтметра; система детектирования обычно включает индикаторный электрод (например, платиновый электрод, электрод с вращающимися дисками или угольный электрод) и второй электрод (например, платиновый электрод, электрод с вращающимися дисками или угольный электрод).

Методика. Настраивают ток на индикаторном электроде, как указано в частной фармакопейной статье или нормативном документе по качеству, и строят график зависимости начального напряжения и значений, полученных при титровании, от количества прибавленного титранта. Прибавляют титрант не менее чем тремя последовательными количествами, равными в сумме около 80% от теоретического значения объема титранта, соответствующего предполагаемой точке эквивалентности. Данные трех значений напряжения должны находиться на одной прямой. Продолжают титрование после достижения предполагаемой точки эквивалентности не менее чем тремя последовательными порциями. Полученные значения напряжения должны находиться на другой прямой. Точка пересечения двух прямых будет соответствовать конечной точке титрования.

При использовании системы вольтаметрического титрования с двумя индикаторными электродами записывают кривую титрования, по которой устанавливают конечную точку титрования.

201020058-2022

2.1.2.58 Автоматический элементный анализ

Метод автоматического элементного анализа основан на высокотемпературном (от 1100 °C до 1800 °C) окислительном разложении исследуемых веществ с последующим хроматографическим определением компонентов образовавшейся газовой смеси.

Для определения содержания элементов C, H, N и S в субстанциях для фармацевтического применения проводят высокотемпературное окислительное разложение в потоке гелия, либо его смеси с кислородом в присутствии катализатора окисления. Последующее восстановление, как правило, протекает в присутствии катализатора и определение образующихся продуктов: углерода в виде CO2, водорода в виде H2O, азота в виде N2, серы в виде SO2, кислорода в виде CO, соответствующих определяемым элементам, проводят методом газовой хроматографии.

Метод автоматического элементного анализа может быть использован для установления эмпирических формул вещества, в состав молекул которого входят: углерод (C), водород (H), азот (N), сера (S), а в ряде случаев и кислород (O) на основании данных элементного анализа на любой из этих элементов. Метод используется на этапе фармацевтической разработки с целью идентификации активной фармацевтической субстанции по молекулярной формуле вещества.

Метод автоматического элементного анализа может быть применен и для определения массовой доли углерода, водорода, азота, серы и кислорода в испытуемых образцах.

В качестве катализатора окисления обычно используют меди (II) оксид (CuO) с добавкой ванадия (V) оксида (V2O5) или посеребренного кобальта (II, III) оксида (Co3O4). В качестве катализатора восстановления используют электролитическую медь.

Для поглощения углерода и серы диоксидов (CO2 и SO2) используют ловушки со смесью натрия гидроксида и кальция гидроксида, воды - ловушки с магния перхлоратом или освобождаются от воды в соединительных трубках. Метод применим для анализа образцов как в твердом, так и жидком состоянии.

ОБОРУДОВАНИЕ

Определение проводят на приборе - элементном анализаторе, основными составными частями которого являются:

• электронные микровесы или ультрамикровесы;
• узел (блок) ввода пробы - автодозатор капсулированных (запечатанных в контейнеры из оловянной фольги) проб анализируемых образцов;
• окислительный и восстановительный реакторы, помещенные в электропечь;
• ловушки (поглотители);
• хроматографическая колонка;
• детектор по теплопроводности или пламенно-фотометрический, или изотопный масс-спектрометр;
• система для обработки данных и управления прибором.

МЕТОДИКА

При анализе испытуемых образцов твердом или жидком состоянии используют дозаторы для твердых или жидких проб.

В качестве стандартных образцов используют подходящие стандартные образцы для микроанализа с установленным содержанием элементов, например: ацетанилид, цистеин, метионин.

Точные навески стандартного образца для микроанализа или активной фармацевтической субстанции, взятые в соответствии с рекомендациями производителя прибора, помещают в предварительно взвешенные пустые оловянные контейнеры. Запечатывают контейнеры с помощью специального устройства, взвешивают капсулированные образцы и помещают в кассету автодозатора. При увеличении количества катализаторов окисления и восстановления навеска может быть увеличена в 5 - 10 раз, при этом точность взвешивания может составлять 0,01 мг.

Проводят контрольный опыт, для чего с помощью автодозатора в реактор помещают 3 пустых оловянных контейнера, регистрируют содержание определяемого элемента для каждого из них.

Затем последовательно сжигают по 3 - 4 навески капсулированных образцов (стандартного и испытуемого).

По полученным значениям площадей пиков стандартных образцов с учетом значения контрольного опыта автоматически строится калибровочный график и рассчитывается поправочный коэффициент K к площади пика определяемого элемента по формуле:

K = \frac{y \cdot a_{o}}{(S_{o} - S_{\text{к}}) \cdot 100} ,

где: y - содержание определяемого элемента в стандартном образце для микроанализа, в процентах;

So - площадь пика на хроматограмме стандартного образца для микроанализа;

Sк - площадь пика на хроматограмме контрольного образца;

ao - навеска стандартного образца для микроанализа, в миллиграммах.

Содержание определяемого элемента в испытуемом образце в процентах (Xэ) автоматически рассчитывается по формуле:

X_{\text{э}} = \frac{(S - S_{\text{к}}) \cdot K \cdot 100}{a} ,

где: S - площадь пика на хроматограмме испытуемого образца;

a - навеска испытуемого образца, в миллиграммах.

Соотношения: углерод/азот (C/N), углерод/водород (C/H), углерод/сера (C/S), углерод/кислород (C/O) рассчитываются автоматически.

Навеску испытуемого образца, по возможности, выбирают такой, чтобы количество определяемого элемента, образовавшееся в результате сжигания его навески, было близко к количеству, образующемуся при сжигании навески стандартного образца для микроанализа.

2.1.3 ИДЕНТИФИКАЦИЯ

201030003-2022

2.1.3.3 Идентификация фенотиазинов методом тонкослойной хроматографии

Определение проводят методом тонкослойной хроматографии (2.1.2.26).

Испытуемый раствор. 20 мг испытуемого образца растворяют в хлороформе P и доводят объем раствора тем же растворителем до 10 мл.

Раствор сравнения. 20 мг соответствующего СО ФЕАЭС растворяют в хлороформе P и доводят объем раствора тем же растворителем до 10 мл.

Условия хроматографирования:

• ТСХ пластинка: покрытая слоем кизельгура G P;
• подготовка ТСХ пластинки: пластинку пропитывают в закрытой камере смесью, содержащей 10% (об/об) феноксиэтанола P в растворе 50 г/л макрогола 300 P в ацетоне P, погружая ее нижний край в пропитывающую смесь примерно на 5 мм; когда фронт растворителей пройдет 17 см от нижнего края пластинки, ее вынимают из камеры и тотчас используют для хроматографии; хроматографирование проводят в том же направлении, что и пропитывание;
• подвижная фаза: смесь петролейного эфира P - диэтиламина P (50:1, об/об), насыщенная феноксиэтанолом P (т.е. от 3 мл до 4 мл феноксиэтанола P прибавляют к вышеуказанной смеси растворителей, взбалтывают до образования устойчивой мути, декантируют и используют верхний слой, который может быть мутным);
• объем наносимой пробы: 2 мкл;
• пробег фронта подвижной фазы: 15 см; хроматографирование проводят в темном месте;
• детектирование А: пластинку вынимают из камеры, помещают в ультрафиолетовый свет с длиной волны 365 нм и через несколько минут просматривают и оценивают хроматограммы.

Требование А: на хроматограмме испытуемого раствора должно обнаруживаться пятно на уровне пятна на хроматограмме раствора сравнения, соответствующее ему по размеру и флуоресценции.

• детектирование Б: пластинку опрыскивают 10% (об/об) раствором кислоты серной P в этаноле (96%) P.

Требование Б: на хроматограмме испытуемого раствора должно обнаруживаться пятно на уровне пятна на хроматограмме раствора сравнения, соответствующее ему по окраске и ее стабильности не менее 20 мин.

201030004-2022

2.1.3.4 Идентификация пептидов методом спектрометрии ядерного магнитного резонанса

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод спектрометрии ядерного магнитного резонанса (ЯМР) для идентификации пептидов.

Подтверждение подлинности пептидов методом ЯМР проводят в соответствии с общей фармакопейной статьей 2.1.2.45. Спектрометрия ядерного магнитного резонанса.

Общие принципы. Установление подлинности пептида осуществляют путем сравнения одномерных спектров испытуемого образца (как правило, 1H и 13C) со спектрами фармакопейного стандартного образца или со спектрами, приведенными в частной фармакопейной статье и (или) в нормативном документе по качеству При отсутствии фармакопейного стандартного образца можно использовать стандартный образец, идентичность которого подтверждают самостоятельной структурной интерпретацией одномерных спектров (применимо к олигопептидам до 20 аминокислотных остатков при естественном содержании изотопов 13C). Структурная интерпретация осуществляется с использованием двумерных методов корреляционной спектроскопии - COSY (Correlation Spectroscopy), TOCSY (Total Correlation Spectroscopy), HSQC (Heteronuclear Single-Quantum Correlation Spectroscopy), HMBC (Heteronuclear Multiple-Bond Correlation Spectroscopy). В основе данных методов лежит общий подход переноса намагниченности от одного спина ядра к другому посредством спин-спинового взаимодействия, химического обмена или кросс-релаксации.

Гомоядерная корреляционная спектроскопия (COSY) в различных модификациях используется для идентификации ядер атомов (чаще всего 1H), разделенных двумя или тремя химическими связями и участвующих в спин-спиновом взаимодействии друг с другом. Полная корреляционная спектроскопия (TOCSY) позволяет регистрировать наличие спин-спинового взаимодействия между однотипными ядрами атомов, которые связаны между собой непрерывной цепочкой взаимодействий. Гетероядерная одноквантовая корреляционная спектроскопия HSQC определяет корреляции между атомными ядрами двух разных типов, которые разделены одной связью (как правило, между протонами и ядрами углерода в определенном углеводородном фрагменте). Гетероядерная многосвязная корреляционная спектроскопия HMBC определяет корреляции между протонами и ядрами X (как правило, 13C), разделенными двумя или тремя связями (в редких случаях большим числом связей).

Прибор. Если не предписано иное, используют импульсный ЯМР спектрометр с рабочей частотой не менее 300 МГц.

Методика. При необходимости испытуемый образец подвергают предварительной лиофилизации. Испытуемый образец или его лиофилизат растворяют в дейтерированном растворителе, к которому может быть добавлен соответствующий эталон для калибровки химического сдвига (общая фармакопейная статья 2.1.2.45. Спектрометрия ядерного магнитного резонанса). В качестве дейтерированного растворителя, как правило, используют дейтерированную воду или буферный раствор в дейтерированной воде. Состав буферного раствора, его pH, концентрация пептида приводят в частной фармакопейной статье и (или) в нормативном документе по качеству.

После помещения в магнит образец термостатируют не менее 5 мин. Регистрацию спектров испытуемого и стандартного образцов проводят в идентичных условиях (одинаковые растворитель, концентрация, температура, параметры эксперимента - ширина спектра, время задержки между импульсными последовательностями, число накоплений сигнала спада свободной индукции, количество точек для Фурье-преобразования), которые приводят в частной фармакопейной статье и (или) в нормативном документе по качеству. Ширина спектра должна охватывать полный спектр пептида с пустой спектральной областью с обеих сторон. Обычно подходящей является ширина спектра 12 ppm или 16 ppm.

Регистрацию спектра при температуре, существенно отличающейся от комнатной, проводят в режиме температурной стабилизации. В противном случае проводят оценку влияния эффекта температурных изменений на внешний вид спектра.

Проверка идентичности

При установлении подлинности олигопептидов путем сравнения спектра испытуемого образца со спектром стандартного образца или с опубликованным стандартным спектром пики в 2 спектрах должны совпадать по положению, интегральной интенсивности и мультиплетности (общая фармакопейная статья 2.1.2.45. Спектрометрия ядерного магнитного резонанса). Характеристические сигналы, уникальные для каждой аминокислоты, должны быть охарактеризованы определенными химическими сдвигами с соответствующими доверительными интервалами, приведенными в частной фармакопейной статье.

При установлении подлинности полипептидов используют одномерные спектры 1H целиком, как "отпечатки пальца" объекта, без детализации значений химических сдвигов и мультиплетности отдельных сигналов. Рекомендуется проводить сравнение нормированных интегральных интенсивностей характеристичных областей спектров 1H испытуемого и стандартного образцов, содержащих сигналы определенных аминокислотных функциональных групп. Например, сигналы протонов метильных групп алифатических остатков находятся в интервале 0,9 - 1,5 ppm, области сигналов остальных протонов алифатических боковых цепей - 1,5 - 3,5 ppm, протонов \alpha - CH - 3,5 - 4,5 ppm, ароматических протонов, протонов пептидных групп - 6,7 - 9,0 ppm. Характеристическая область протона имидазола в гистидине 8,0 - 9,2 ppm, NH-индольного протона триптофана 9,0 - 11,0 ppm. Области спектра, содержащие сигналы остаточных органических растворителей, не учитывают при проведении нормированного интегрирования. Доверительные интервалы нормированных интегральных интенсивностей характеристичных областей спектров 1H приводят в частной фармакопейной статье.

Установление подлинности олигопептидов при отсутствии стандартных образцов включает в себя идентификацию аминокислот и определение аминокислотной последовательности в пептидной цепи. Идентификацию аминокислот проводят в 3 этапа:

I. Соотнесение сигналов спектров 1H и 13C к конкретным углеводородным фрагментам (метильным, метиленовым, метиновым, ароматическим группам) на основе данных спектра 1H - 13C HSQC;

II. Определение соседних углеводородных фрагментов, связанных ковалентной связью, и составление последовательности из углеводородных фрагментов на основе данных 1H - 1H COSY и при необходимости 1H - 1H TOCSY;

III. Объединение в молекулу углеводородных фрагментов (алифатических и ароматических) и амидных групп на основе данных спектра 1H - 13C HMBC.

Аминокислотную последовательность в олигопептиде устанавливают на основе данных спектра 1H - 13C HMBC по наличию кросс-пиков между сигналами \alpha - CH групп и C=O групп соседних аминокислот.

2.1.4 ИСПЫТАНИЯ НА ПРЕДЕЛЬНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ПРИМЕСЕЙ

201040023-2022

2.1.4.23 Определение примесей элементов

В данной общей фармакопейной статье описывается общий подход к определению примесей элементов в субстанциях для фармацевтического применения или лекарственных препаратах. Ввиду существенного различия химической структуры веществ и пределов содержания элемента(ов), указанных в спецификациях качества и (или) нормативных документах по качеству, описание всех подходящих методик пробоподготовки и способов измерения представляется нецелесообразным. В связи с этим для указанной цели может использоваться любой метод, соответствующий требованиям данной общей фармакопейной статьи.

Результаты анализа принимаются лишь в случае, если пригодность системы подтверждена с помощью подходящего испытания. Перед применением методики аналитик должен обеспечить ее пригодность для используемых образцов и приборов. Это достигается путем применения процедуры валидации к методикам, не описанным в частной фармакопейной статье, или путем проверки пригодности системы для методик, описанных в частной фармакопейной статье. Схемы принятия решения для выбора методик пробоподготовки и способов измерения представлены на рисунках 2.1.4.23.-1 и 2.1.4.23.-2.

Рисунок 2.1.4.23.-1. - Схема принятия решения для выбора методики пробоподготовки при определении примесей элементов

Рисунок 2.1.4.23.-2. - Схема принятия решения для выбора способа измерения при определении примесей элементов

МЕТОДИКИ

Поскольку стандартная методика не предоставляется для каждого элемента, матрицы и концентрации, выбор методики (включая пробоподготовку), способа детектирования и параметров прибора, должен проводиться самим аналитиком согласно схемам, изображенным на рисунках 2.1.4.23.-1 и 2.1.4.23.-2.

Для определения методики пробоподготовки используют схему на рисунке 2.1.4.23.-1, а для определения методики измерения - схему на рисунке 2.1.4.23.-2. Методика пробоподготовки должна обеспечивать получение количества образца, достаточного для определения каждого элемента в соответствии с пределами, указанными в частной или общей фармакопейных статьях.

Для определения примесей элементов могут применяться все подходящие методики пробоподготовки и способы измерения (например,

2.1.2.21 Атомно-эмиссионная спектрометрия (АЭС),

2.1.2.22 Атомно-абсорбционная спектрометрия (ААС),

2.1.2.48 Рентгенофлуоресцентная спектрометрия (РФС),

2.1.2.41 Атомно-эмиссионная спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой (АЭС-ИСП),

2.1.2.55 Масс-спектрометрия с индуктивно-связанной плазмой (МС-ИСП),

2.1.4.2 Мышьяк,

2.1.4.8 Тяжелые металлы,

2.1.4.9 Железо,

2.1.4.10 Свинец в сахарах,

2.1.4.15 Никель в полиолах,

2.1.8.22 Определение никеля в гидрогенизированных растительных маслах),

если перед использованием методики верифицированы путем проверки пригодности системы или проведения валидации в соответствии с данной общей фармакопейной статьей.

Если методика пробоподготовки и (или) способ измерения не описаны в частной фармакопейной статье, должна быть разработана и валидирована подходящая методика пробоподготовки и (или) способ измерения (рисунки 2.1.4.23.-1 и 2.1.4.23.-2).

ПРОБОПОДГОТОВКА

Пробоподготовка является критической стадией элементного анализа. Многие способы, не использующие прямое измерение, в значительной степени зависят от переноса пробы.

При использовании системы атомизации большинство общепринятых средств, с помощью которых проба вводится в систему атомизации, сводится к распылению растворов. В этом случае твердые образцы должны растворяться для введения в систему атомизации. Образцы могут растворяться в любом подходящем растворителе. Особенно рекомендуется для растворения применение воды или разбавленной азотной кислоты ввиду минимальных мешающих факторов в сравнении с другими растворителями. Для растворения образцов могут использоваться хлороводородная кислота, фтороводородная кислота, хлорная кислота, серная кислота и водорода пероксид различных концентраций. Вязкость серной кислоты выше, чем у других кислот, что должно учитываться ввиду ее повсеместного влияния на текучесть раствора.

Выбор растворителей также включает, но не ограничивается применением разбавленных оснований, неразбавленных или разбавленных органических растворителей, смесей кислот или оснований и смесей органических растворителей. Используемые кислоты, основания и водорода пероксид должны быть высокой чистоты, особенно при применении метода МС-ИСП. Для приготовления водных растворов применяют воду дистиллированную деионизированную P. Растворители для разведения (разбавители), если их используют в анализе, должны проверяться на отсутствие мешающих факторов. Поскольку не всегда возможно получение органических растворителей, не содержащих примесей элементов, должны применяться органические растворители наиболее высокой чистоты в отношении таких загрязнителей. При использовании методов особенно с ИСП, в которых образцы вводят в плазму путем распыления растворов, важно учитывать возможное влияние матрицы и мешающих факторов, исходящих от растворителя. При анализе методами АЭС-ИСП и МС-ИСП в случаях, когда правильность и прецизионность не достаточны, должен использоваться подходящий внутренний стандарт и (или) стандартная матрица, соответствующая образцам. В любом случае при подборе подходящего внутреннего стандарта следует учитывать определяемый элемент(ы), его энергию ионизации, длины волн или массу, а также природу матрицы образца.

Если установлено, что образец не растворяется ни в каком подходящем растворителе, могут применяться разнообразные способы высокотемпературного разложения и озоления. К ним относятся разложение на плитке, озоление и микроволновое разложение с использованием открытых и закрытых сосудов.

Решение относительно используемых способов разложения зависит от природы испытуемого образца и определяемого элемента(ов), а также диапазона определяемых концентраций элементов. При анализе летучих веществ, содержащих определяемый элемент(ы), не рекомендуется использование открытых сосудов для разложения. Пригодность способа разложения как в открытом, так и закрытом сосудах следует подтвердить в опытах по определению величины открываемости для проверки отсутствия в допустимых пределах потерь летучих веществ, содержащих определяемый элемент(ы), при пробоподготовке. Методику разложения считают пригодной, если полученный раствор является прозрачным.

Важно учитывать выбор типа, материала конструкции, предварительную обработку и очистку аналитического лабораторного оборудования, используемого в элементном анализе. Материал должен быть инертным и, в зависимости от конкретного применения, устойчивым к щелочам, кислотам и (или) органическим растворителям. Некоторые анализы, особенно в случае ультраследовых количеств, должны проводиться с осторожностью для предотвращения адсорбции примесей элементов на поверхности сосуда. Загрязнение растворов образца примесями элементов и ионами, извлекаемыми из материала сосуда, также может приводить к неправильным результатам.

Допускается применение мерной стеклянной посуды, не отвечающей требованиям класса А соответствующего международного стандарта Международной организации по стандартизации, если валидация методики, предусматривающей использование такой посуды, или испытание на пригодность системы экспериментально подтверждают пригодность методики для предполагаемой цели.

ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ. При использовании реакционных сосудов высокого давления и микроволнового лабораторного оборудования необходимо соблюдать требования инструкции по технике безопасности и эксплуатации производителя.

ИЗМЕРЕНИЕ

Методика. Выбор способов измерения зависит, в основном, от матрицы образца, характеристик и пределов содержания определяемого(ых) элемента(ов), указанных в спецификации качества и (или) нормативном документе по качеству Анализ проводят в соответствии с инструкциями производителя прибора в отношении программы и длины волны.

Пригодность системы. Для обеспечения приемлемости пробоподготовки и системы измерения испытание на пригодность системы должно проводиться в день выполнения анализа.

Критерии приемлемости для приготовления испытуемого раствора: полученный раствор должен быть прозрачным.

Критерии приемлемости для системы измерения: измеренная концентрация стандартного раствора элемента в диапазоне концентраций на используемой калибровочной кривой не должна отличаться от фактической концентрации более чем на 20%.

Расчет. Для расчета содержания используют значение, полученное для контрольного образца и учитывающее загрязнение используемых реактивов. После завершения анализа концентрацию данного элемента в образце вычисляют с помощью программного обеспечения прибора по концентрации элемента в испытуемом растворе. При отсутствии программного обеспечения или указаний для расчета в общей фармакопейной статье на соответствующий метод испытания концентрация данного элемента в образце может рассчитываться по концентрации элемента в растворе по следующему выражению:

C = A \cdot \frac{V_{1}}{m} \cdot \frac{V_{2}}{V_{3}} ,

где: C - концентрация элемента в анализируемом образце в микрограммах на грамм;

A - концентрация элемента в растворе, определенная по показаниям прибора, в микрограммах на миллилитр;

m - масса образца, используемого для приготовления исходного раствора, в граммах;

V1 - объем исходного раствора в миллилитрах;

V2 - общий объем раствора, приготовленного разведением исходного раствора, в миллилитрах;

V3 - объем исходного раствора, используемого для разведения, в миллилитрах.

ВАЛИДАЦИОННЫЕ ТРЕБОВАНИЯ

Некоторые валидационные требования, представленные ниже, могут отличаться от указанных в общих фармакопейных статьях (например, 2.1.2.21 (АЭС), 2.1.2.22 (ААС), 2.1.2.41 (АЭС-ИСП), 2.1.2.55 (МС-ИСП)).

Перед применением выбранной методики аналитик должен обеспечить пригодность методики пробоподготовки и способа измерения для элемента(ов), матрицы образца и используемого прибора. Это достигается путем проведения процедуры валидации перед первым применением и испытания на пригодность системы в день выполнения анализа.

Валидация испытания на предельное содержание примесей элементов должна включать определение специфичности и предела обнаружения.

Следующий ниже раздел определяет характеристики пригодности методики количественного определения. Экспериментально необходимо подтвердить, что такая методика соответствует валидационным требованиям, требованиям приемлемости испытания на пригодность системы с использованием образца, в который добавлен подходящий стандартный образец. Стандартный образец должен быть добавлен в испытуемые образцы до проведения любой из стадий пробоподготовки. Например, если испытуемый образец подвергается процедуре разложения, введение добавок должно быть выполнено в начале этой процедуры.

СПЕЦИФИЧНОСТЬ

Специфичность представляет собой способность аналитической методики (пробоподготовка и измерение) обеспечивать достоверное определение элемента(ов) в присутствии предполагаемых компонентов (например, газа-носителя, примесей, матрицы).

Критерии приемлемости: методика должна быть способна однозначно оценивать примеси элементов в присутствии предполагаемых компонентов, в том числе других примесей элементов, компонентов матрицы и других источников мешающих факторов; специфичность подтверждают соответствием требованию для правильности определения элемента(ов).

ДИАПАЗОН ПРИМЕНЕНИЯ

Критерии приемлемости: диапазон определяемых концентраций подтверждают соответствием требованию для величины открываемости.

ПРАВИЛЬНОСТЬ

Правильность подтверждают с помощью сертифицированного стандартного образца или путем выполнения испытания на открываемость. Допускается использование стандартных растворов для испытаний на предельное содержание элементов (2.2.1.2).

Открываемость может определяться на испытуемом образце субстанции, в который добавляют известное количество стандартного образца элемента (три значения концентрации в диапазоне от 50% до 150% от предела, указанного в спецификации, даже если истинная концентрация стандартного образца достигает указанного значения), в трех повторных опытах.

Критерии приемлемости: открываемость должна составлять от 70% до 150% для среднего из трех определений каждой концентрации.

ПОВТОРЯЕМОСТЬ

Испытуемые образцы. Готовят шесть отдельных образцов субстанции, в которые добавляют подходящий стандартный образец в указанной концентрации или в трех концентрациях для трех повторных опытов.

Критерии приемлемости: относительное стандартное отклонение в обоих случаях должно быть не более 20%.

ПРОМЕЖУТОЧНАЯ ПРЕЦИЗИОННОСТЬ

Должно быть установлено влияние случайных факторов (внутрилабораторное варьирование) на аналитическую прецизионность методики. Испытания для установления промежуточной прецизионности включают повторение анализа в разные дни, или на разных приборах, или разными аналитиками. Для подтверждения промежуточной прецизионности требуется только одно из трех испытаний.

Критерии приемлемости: относительное стандартное отклонение должно быть не более 25%.

ПРЕДЕЛ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

Используют результаты определения правильности. Определяют наименьшую концентрацию, соответствующую критериям приемлемости.

Критерии приемлемости: предел количественного определения должен быть ниже предела, указанного в спецификации.

ПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ

(только для испытаний на предельное содержание примесей)

Определяют наименьшую концентрацию, для которой аналитический сигнал четко отличается от аналитического сигнала контрольного раствора.

Критерии приемлемости: предел обнаружения должен быть не более 0,5 концентрации, соответствующей пределу, указанному в спецификации.

201040024-2022

2.1.4.24 Определение этиленоксида и диоксана

Испытание предназначено для определения содержания остаточных количеств этиленоксида и диоксана в субстанциях, растворимых в воде или диметилацетамиде. Для субстанций, нерастворимых или недостаточно растворимых в этих растворителях, приготовление раствора образца и условия определения методом парофазной газовой хроматографии указывают в частной фармакопейной статье.

Определение проводят методом парофазной газовой хроматографии (2.1.2.27).

A. Для образцов, растворимых или смешивающихся с водой, может быть использована следующая методика.

Испытуемый раствор. 1,00 г (m1) испытуемого образца взвешивают во флаконе вместимостью 10 мл (в зависимости от условий проведения испытания могут применяться флаконы другого объема) и прибавляют 1,0 мл воды P. Флакон закрывают, содержимое перемешивают до получения однородного раствора и выдерживают при температуре 70 °C в течение 45 мин.

Раствор сравнения (а). 1,00 г (m0) испытуемого раствора взвешивают в таком же флаконе вместимостью 10 мл, прибавляют 0,50 мл раствора диоксана P2 и 0,50 мл раствора этиленоксида P3. Флакон закрывают, содержимое перемешивают до получения однородного раствора и выдерживают при температуре 70 °C в течение 45 мин.

Раствор сравнения (б). 0,50 мл раствора этиленоксида P3 помещают во флакон вместимостью 10 мл, прибавляют 0,1 мл свежеприготовленного раствора 10 мг/л ацетальдегида P и 0,10 мл раствора диоксана P1. Флакон закрывают, содержимое перемешивают до получения однородного раствора и выдерживают при температуре 70 °C в течение 45 мин.

B. Для образцов, растворимых или смешивающихся с диметилацетамидом, может быть использована следующая методика.

Испытуемый раствор. 1,00 г (m1) испытуемого образца помещают во флакон вместимостью 10 мл (в зависимости от условий проведения испытания могут применяться флаконы другого объема), прибавляют 0,20 мл воды P и 1,0 мл диметилацетамида P. Флакон закрывают, содержимое перемешивают до получения однородного раствора и выдерживают при температуре 90 °C в течение 45 мин.

Раствор сравнения (а). 1.00 г (m0) испытуемого раствора помещают в такой же флакон вместимостью 10 мл, прибавляют 0,10 мл раствора диоксана P1, 0,10 мл раствора этиленоксида P2 и 1,0 мл диметилацетамида P. Флакон закрывают, содержимое перемешивают до получения однородного раствора и выдерживают при температуре 90 °C в течение 45 мин.

Раствор сравнения (б). 0,10 мл раствора этиленоксида P2 помещают во флакон вместимостью 10 мл, прибавляют 0,1 мл свежеприготовленного раствора 10 мг/л ацетальдегида P и 0,10 мл раствора диоксана P1. Флакон закрывают, содержимое перемешивают до получения однородного раствора и выдерживают при температуре 70 °C в течение 45 мин.

Условия хроматографирования:

• колонка: из стекла или термостойкого кварца длиной 30 м и внутренним диаметром 0,32 мм, покрытая слоем полидиметилсилоксана P толщиной 1,0 мкм;
• газ-носитель: гелий для хроматографии P или азот для хроматографии P;
• скорость потока: около 20 см/с;
• деление потока: 1:20;
• детектор: пламенно-ионизационный;
• вводимый объем пробы: подходящий объем, например, по 1,0 мл испытуемого раствора и растворов сравнения (а) и (б).

Статические условия ввода паровой фазы:

• температура уравновешивания: 70 °C (90 °C для растворов в диметилацетамиде);
• время уравновешивания: 45 мин;
• температура линии передачи: 75 °C (150 °C для растворов в диметилацетамиде);
• газ-носитель: гелий для хроматографии P;
• время увеличения давления: 1 мин;
• время ввода пробы: 12 с;
• температура:

Хроматографируют подходящий объем, например, по 1,0 мл газовой фазы испытуемого раствора и растворов сравнения (а) и (б), получая по три хроматограммы для каждой пробы.

Пригодность системы (раствор сравнения (б)):

• разрешение: не менее 2,0 между пиками ацетальдегида и этиленоксида;
• отношение сигнал/шум: не менее 5 для пиков этиленоксида и диоксана;
• относительное стандартное отклонение: не более 15% для трех значений площади пика этиленоксида;
• относительное стандартное отклонение: не более 15% для трех значений площади пика диоксана.

Проверка точности (испытуемый раствор и раствор сравнения (а)):

• рассчитывают разность площадей пиков этиленоксида и диоксана на хроматограмме испытуемого раствора и на хроматограмме раствора сравнения (а).

Пригодность хроматографической системы

Хроматографическая система считается пригодной, если выполняются следующие условия:

• относительное стандартное отклонение: не более 15%, рассчитанное для 3 полученных значений площади пика этиленоксида;
• относительное стандартное отклонение: не более 15%, рассчитанное для 3 полученных значений площади пика диоксана.

Если точные навески испытуемого образца, взятые для приготовления испытуемого раствора и раствора сравнения (а), отличались от 1,00 г более чем на 0,5%, необходимо внести соответствующие поправки.

Содержание этиленоксида в частях на миллион (ppm) рассчитывают по формуле:

\frac{S_{1} \cdot C}{(S_{0} \cdot m_{0}) - (S_{1} \cdot m_{0})} ,

где: S1 - площадь пика этиленоксида на хроматограмме испытуемого раствора;

S0 - площадь пика этиленоксида на хроматограмме раствора сравнения (а);

m1 - масса навески испытуемого образца для приготовления испытуемого раствора в граммах;

m0 - масса навески испытуемого образца для приготовления раствора сравнения (а) в граммах;

C - количество этиленоксида, прибавленное к раствору сравнения (а), в микрограммах.

Содержание диоксана в частях на миллион (ppm) рассчитывают по формуле:

\frac{S_{T1} \cdot C}{(S_{R0} \cdot m_{T1}) - (S_{T1} \cdot m_{R0})} ,

где: ST1 - площадь пика диоксана на хроматограмме испытуемого раствора;

SR0 - площадь пика диоксана на хроматограмме раствора сравнения (а);

mT1 - масса навески субстанции для приготовления испытуемого раствора, в граммах;

mR0 - масса навески субстанции для приготовления раствора сравнения (а), в граммах;

C - количество диоксана, прибавленного к раствору сравнения (а), в микрограммах.

201040025-2022

2.1.4.25 Определение этиленгликоля и диэтиленгликоля

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на определение примесей этиленгликоля и диэтиленгликоля, которые могут содержаться в этоксилированных субстанциях для фармацевтического применения при технологическом процессе производства. Испытание применяют для количественного определения примесей этиленгликоля и диэтиленгликоля, особенно в случае использования следующих поверхностно-активных веществ: макроголглицерола рицинолеата, макроголглицерола гидроксистеарата, макрогол 15 гидроксистеарата, ноноксинола 9 и макрогола цетостеарилового эфира.

Определение проводят методом газовой хроматографии (2.1.2.27).

Раствор внутреннего стандарта. 30,0 мг 1,2-пентандиола P растворяют в ацетоне P и доводят объем раствора тем же растворителем до 30,0 мл. 1,0 мл полученного раствора доводят ацетоном P до 20,0 мл.

Испытуемый раствор. 0,500 г испытуемого образца растворяют в растворе внутреннего стандарта и доводят объем раствора тем же растворителем до 10,0 мл.

Раствор сравнения (а). 30,0 мг этиленгликоля P смешивают с ацетоном P и доводят объем раствора тем же растворителем до 100,0 мл. 1,0 мл полученного раствора доводят раствором внутреннего стандарта до 10,0 мл.

Раствор сравнения (б). Готовят раствор диэтиленгликоля P с концентрацией, соответствующей указанному пределу и используя те же растворители, что и при приготовлении раствора сравнения (а).

Условия хроматографирования:

• колонка: из термостойкого кварца длиной 30 м и внутренним диаметром 0,53 мм, покрытая слоем макрогола 20 000 P толщиной 1 мкм;
• газ-носитель: гелий для хроматографии P;
• скорость газа-носителя: 10 мл/мин;
• деление потока: 1:3;
• режим изменения температуры:

• детектор: пламенно-ионизационный;
• объем вводимый пробы: по 2 мкл испытуемого раствора и растворов сравнения (а) и (б).

Относительное удерживание (время удерживание 1,2-пентандиола около 19 мин): для этиленгликоля - около 0,7; для диэтиленгликоля - около 1,3.

201040026-2022

2.1.4.26 Углерода диоксид в газах медицинских

Газы поглощают свет при определенных характерных длинах волн. Это свойство широко используется для проведения высокоселективного измерения их концентраций.

Концентрацию углерода диоксида в газах медицинских определяют с помощью спектроскопических устройств с инфракрасными датчиками (инфракрасный анализатор), использующих метод недисперсионного поглощения газами инфракрасного излучения.

Описание и принцип измерения. Основными компонентами инфракрасного анализатора являются: источник инфракрасного излучения, оптическое устройство, измерительные камеры (ячейки) и инфракрасный детектор. Камеры предназначены для испытуемого образца и образца сравнения, в некоторых приборах вместо камеры сравнения используется электронная система. Оптическое устройство состоит из одного или нескольких избирательных по длине волны оптических фильтров, через которые проходит инфракрасное излучение. В данном случае используют оптические фильтры для углерода диоксида. Инфракрасный луч направляется через камеры к детектору.

Если в камере с испытуемым образцом присутствует углерода диоксид, то происходит поглощение на определенных длинах волн инфракрасной области спектра, соответствующих углероду диоксиду, приводящее к изменению сигнала детектора в соответствии с законом Бугера-Ламберта-Бера. Путем сравнения данного сигнала с сигналом образца сравнения находят величину, зависящую от концентрации углерода диоксида. Выходной сигнал линеаризуют таким образом, чтобы получить концентрацию углерода диоксида. Для предотвращения попадания на датчики твердых частиц, приводящих к явлению светорассеяния, прибор снабжается подходящим фильтром.

Требования к техническим характеристикам. При использовании для определения предельных содержаний инфракрасный анализатор должен соответствовать следующим требованиям:

• предел обнаружения: (обычно определяемый по отношению сигнал/шум более 2) не более 20% от максимально допустимой концентрации;
• повторяемость: относительное стандартное отклонение для максимально допустимой концентрации не более 10%, определенное на 6 повторных определениях;
• линейность: не более 10% от максимально допустимой концентрации.

Требования к техническим характеристикам должны выполняться и в присутствии примесей других газов в испытуемом образце.

201040027-2022

2.1.4.27 Углерода монооксид в газах медицинских

Определение концентрации углерода монооксида в газах медицинских осуществляют титриметрическим методом после окисления углерода монооксида (Метод 1) и с помощью инфракрасного анализатора (Метод 2).

МЕТОД 1

Прибор. Прибор (рисунок 2.1.4.27.-1) состоит из следующих частей, соединенных последовательно:

• U-образная трубка (U1), содержащая безводный силикагель P, импрегнированный хрома (VI) оксидом P;
• промывочная емкость (F1), содержащая 100 мл раствора 400 г/л калия гидроксида P;
• U-образная трубка (U2), содержащая шарики калия гидроксида P;
• U-образная трубка (U3), содержащая фосфора (V) оксид P, распределенный на предварительно гранулированную плавленую пемзу;
• U-образная трубка (U4), содержащая 30 г йода (V) оксида перекристаллизованного P в гранулах, предварительно высушенного при температуре 200 °C и поддерживаемого при температуре 120 °C (T) во время испытания. Йода (V) оксид упакован в трубке в односантиметровые столбики, разделенные односантиметровыми столбиками стекловаты для достижения эффективной длины 5 см;
• реакционная пробирка (F2), содержащая 2,0 мл раствора калия йодида P и 0,15 мл раствора крахмала P.

Рисунок 2.1.4.27.-1. - Прибор для определения углерода монооксида. Размеры указаны в миллиметрах

Методика. 5,0 л аргона P пропускают через аппарат и при необходимости обесцвечивают голубой цвет йодного раствора, прибавляя минимально необходимое количество свежеприготовленного 0,002 M раствора натрия тиосульфата. Газ продолжают пропускать до тех пор, пока после прохождения 5,0 л аргона P для обесцвечивания йодного раствора будет требоваться не более 0,045 мл 0,002 M раствора натрия тиосульфата. Испытуемый газ из баллона пропускают через прибор, учитывая указанные в частной фармакопейной статье или нормативном документе по качеству объем и скорость потока. Остатки выделившегося йода переносят в реакционную пробирку, пропуская через прибор 1,0 л аргона P. Выделившийся йод титруют 0,002 M раствором натрия тиосульфата. Проводят контрольный опыт, используя одинаковый объем аргона P. Разница между объемами 0,002 M раствора натрия тиосульфата, израсходованными при титрованиях, не должна превышать указанное в частной фармакопейной статье или нормативном документе по качеству значение.

МЕТОД 2

Газы поглощают свет при определенных характерных длинах волн. Это свойство широко используется для проведения высокоселективного измерения их концентраций.

Концентрацию углерода монооксида в газах медицинских определяют с помощью спектроскопических устройств с инфракрасными датчиками (инфракрасный анализатор), использующих метод недисперсионного поглощения газами инфракрасного излучения.

Описание и принцип измерения. Основными компонентами инфракрасного анализатора являются: источник инфракрасного излучения, оптическое устройство, измерительные камеры (ячейки) и инфракрасный детектор. Камеры предназначены для испытуемого образца и образца сравнения, в некоторых приборах вместо камеры сравнения используется электронная система. Оптическое устройство состоит из одного или нескольких избирательных по длине волны оптических фильтров, через которые проходит инфракрасное излучение. В данном случае используют оптические фильтры для углерода монооксида. Инфракрасный луч направляется через камеры к детектору.

Если в камере с испытуемым образцом присутствует углерода монооксид, происходит поглощение на определенных длинах волн инфракрасной области спектра, соответствующих углерода монооксиду, приводящее к изменению сигнала детектора в соответствии с законом Бугера-Ламберта-Бера. Путем сравнения данного сигнала с сигналом образца сравнения находят величину, зависящую от концентрации углерода монооксида. Выходной сигнал линеаризуют таким образом, чтобы получить концентрацию углерода монооксида. Для предотвращения попадания на датчики твердых частиц, приводящих к явлению светорассеяния, прибор снабжается подходящим фильтром.

Требования к техническим характеристикам. При использовании для определения предельных содержаний инфракрасный анализатор должен соответствовать следующим требованиям:

• предел обнаружения: (обычно определяемый по отношению сигнал/шум более 2) не более 20% от максимально допустимой концентрации;
• повторяемость: относительное стандартное отклонение для максимально допустимой концентрации не более 10%, определенное на 6 повторных определениях;
• линейность: не более 10% от максимально допустимой концентрации.

Требования к техническим характеристикам должны выполняться и в присутствии примесей других газов в испытуемом образце.

201040028-2022

2.1.4.28 Азота (I) оксид в газах медицинских

Газы поглощают свет при определенных характерных длинах волн. Это свойство широко используется для проведения высокоселективного измерения их концентраций.

Описание и принцип измерения. Концентрацию азота (I) оксида в газах медицинских определяют с помощью инфракрасного анализатора.

Основными компонентами инфракрасного анализатора являются: источник инфракрасного излучения, оптическое устройство, измерительная камера (ячейка) и детектор. Необходимое для определения азота (I) оксида оптическое устройство может быть расположено до или после камеры для испытуемого образца и состоит из одного или нескольких оптических фильтров, через которые проходит широкополосное инфракрасное излучение. Излучение пропускают через камеру, предназначенную для испытуемого образца. В зависимости от конструкции прибора излучение также может быть направлено через камеру для образца сравнения, либо вместо этого может использоваться электронная система.

Если в камере с испытуемым образцом присутствует азота (I) оксид, то происходит поглощение на определенных длинах волн инфракрасной области спектра, соответствующих азота (I) оксиду, приводящее к изменению сигнала детектора в соответствии с законом Бугера-Ламберта-Бера. Путем сравнения данного сигнала с сигналом образца сравнения находят величину, зависящую от концентрации азота (I) оксида. Выходной сигнал линеаризуют таким образом, чтобы получить концентрацию азота (I) оксида. Для предотвращения попадания на датчики твердых частиц, приводящих к явлению светорассеяния, прибор снабжается подходящим фильтром.

201040029-2022

2.1.4.29 Азота монооксид и азота диоксид в газах медицинских

Азота монооксид и азота диоксид в газах медицинских определяют с помощью хемилюминесцентного анализатора (рисунок 2.1.4.29.-1).

Рисунок 2.1.4.29.-1. - Хемилюминесцентный анализатор

Конструкция аппарата включает в себя:

• устройство для фильтрования, проверки и контроля скорости потока испытуемого газа;
• преобразователь, восстанавливающий азота диоксид в азота монооксид для определения суммарного содержания азота монооксида и азота диоксида. Перед использованием необходимо проверить эффективность преобразователя;
• генератор озона с контролем скорости потока; озон производится высоковольтными электрическими разрядами между двумя электродами; в генератор озона подается чистый кислород или безводный воздух окружающей среды, а концентрация озона должна существенно превышать максимальное содержание всех определяемых оксидов азота;
• камеру, в которой протекает реакция азота монооксида с озоном;
• систему определения слабого излучения при длине волны 1,2 мкм, состоящую из селективного оптического фильтра и фотоумножительной трубки.

201040030-2022

2.1.4.30 Кислород в газах медицинских

Определение концентрации кислорода в газах медицинских проводят с помощью газового анализатора, использующего парамагнитный метод (парамагнитный анализатор).

Принцип метода основан на свойстве газообразного кислорода притягиваться к магниту. Парамагнитный анализатор измеряет степень вытеснения диамагнитного газа (азота) парамагнитным газом (кислородом) в сильном магнитном поле. Величина электрического тока, вызванного этим вытеснением прямо пропорциональна концентрации кислорода. Измерения концентрации кислорода зависят от давления и температуры, и, если в анализаторе отсутствует автоматическая регуляция температуры и давления, необходимо произвести калибровку прибора непосредственно перед использованием. Поскольку парамагнитный эффект кислорода имеет линейный характер, прибор должен позволять проводить измерения в подходящем диапазоне с точностью считывания показаний с дискретностью не более 0,1%.

Калибровка прибора. Калибровка производится следующим образом:

• устанавливают нулевой уровень, пропуская через прибор азот P1 до получения постоянных показателей;
• устанавливают шкалу на 100%, пропуская через прибор кислород P со скоростью потока, аналогичной используемой для азота P1, до получения постоянных показателей, так как любые минутные изменения объемной скорости газового потока будут фиксироваться как изменения в концентрации кислорода.

Количественное определение. Пропускают испытуемый образец через прибор с постоянной скоростью потока до получения стабильных показателей. Регистрируют концентрацию кислорода в испытуемом образце.

201040031-2022

2.1.4.31 Вода в газах медицинских

Содержание воды в газах определяют с помощью электролитического гигрометра, описанного ниже.

Измерительная камера состоит из тонкой пленки фосфора (V) оксида, расположенной между 2 платиновыми проводами в качестве электродов. Водный пар из испытуемого газа поглощается фосфора (V) оксидом, который преобразуется в фосфорную кислоту, являющуюся электрическим проводником. Постоянное напряжение на электродах вызывает электролиз воды и регенерацию фосфора (V) оксида. Затем измеряется результирующий электрический ток, который пропорционален содержанию воды в испытуемом газе. Данная система является самокалибрующейся, поскольку она соответствует закону Фарадея.

Отобранный испытуемый образец выдерживают для уравновешивания при температуре от 15 °C до 25 °C. Постоянно пропускают газ через камеру до получения стабильных показаний. Необходимо следить, чтобы в течение всего периода измерения температура приспособления для введения газа была постоянной.

При использовании электролитического гигрометра для точного определения содержания воды добиваются точного потока образца, обеспечивая стабильный объемный расход с помощью контроллера массового расхода. Калибровку контроллера массового расхода обычно выполняют с использованием азота. При использовании для калибровки других газов, необходимо обратиться к инструкциям производителя по вопросу соответствующих коэффициентов пересчета и удостовериться, что используется правильная камера для испытуемого типа газа.

201040032-2022

2.1.4.32 Серы диоксид

ПРИБОР

Прибор (рисунок 2.1.4.32.-1) состоит из следующих частей:

• круглодонная трехгорлая стеклянная колба вместимостью 500 мл (А);
• воронка вместимостью 100 мл (Б);
• обратный холодильник (В);
• пробирка (Г);
• переносящая трубка (Д);
• газовый порт (Е).

Рисунок 2.1.4.32.-1. - Прибор для определения серы диоксида

МЕТОДИКА

В колбу (А) помещают 150 мл воды P и уравновешивают систему, пропуская через нее углерода диоксид P в течение 15 мин со скоростью около 100 мл/мин.

К 10 мл раствора водорода пероксида разбавленного P прибавляют 0,15 мл раствора 1 г/л бромофенолового синего P в этаноле (20%, об/об) P. Затем прибавляют 0,1 M раствор натрия гидроксида P до появления фиолетово-синего оттенка, не достигая конечной точки титрования. Раствор помещают в пробирку (Г) и присоединяют ее к прибору как показано на рисунке 2.1.4.32.-1.

Не прерывая подачи углерода диоксида, снимают воронку (Б) и через освободившееся горло колбы вносят 25,0 г испытуемого образца (a) с помощью 100 мл воды P. Устанавливают воронку на место, закрывают кран и вливают в воронку 80 мл хлороводородной кислоты разбавленной P. Открывают кран воронки, чтобы хлороводородная кислота разбавленная P стекла в колбу. Для предотвращения улетучивания серы диоксида закрывают кран, оставляя несколько последних миллилитров хлороводородной кислоты разбавленной P. Кипятят в течение 1 ч. Открывают кран воронки и останавливают подачу углерода диоксида. Содержимое пробирки (Г) переносят в коническую колбу вместимостью 200 мл с помощью небольшого количества воды P. Колбу нагревают на водяной бане в течение 15 мин и выдерживают до охлаждения. Прибавляют 0,1 мл раствора 1 г/л бромфенолового синего P в этаноле (20%, об/об) P и титруют 0,1 M раствором натрия гидроксида до изменения окраски раствора с желтой на фиолетово-синюю (V1, мл).

Параллельно проводят контрольный опыт (V2, мл).

Содержание серы диоксида в частях на миллион рассчитывают по формуле:

32030 \cdot (V_{1} - V_{2}) \cdot \frac{C}{a} ,

где: V1 - объем титранта, израсходованного на титрование, в миллилитрах;

V2 - объем титранта, израсходованного на титрование в контрольном опыте, в миллилитрах;

C - молярная концентрация натрия гидроксида в растворе, используемом в качестве титранта, в молях на литр;

a - навеска испытуемого образца, в граммах.

201040033-2022

2.1.4.33 Окисляющие вещества

В коническую колбу с притертой пробкой вместимостью 125 мл помещают 4,0 г испытуемого образца и прибавляют 50,0 мл воды P. Закрывают пробкой и взбалтывают в течение 5 мин. Содержимое колбы переносят в центрифужную пробирку с притертой пробкой вместимостью 50 мл и центрифугируют. 30,0 мл прозрачной надосадочной жидкости переносят в коническую колбу с притертой пробкой вместимостью 125 мл, прибавляют 1 мл уксусной кислоты ледяной P и от 0,5 г до 1,0 г калия йодида P. Колбу закрывают пробкой, взбалтывают и выдерживают в темном месте в течение 25 - 30 мин. Прибавляют 1 мл раствора крахмала P и титруют 0,002 M раствором натрия тиосульфата до исчезновения окраски.

Параллельно проводят контрольный опыт.

На титрование испытуемого образца должно расходоваться не более 1,4 мл 0,002 M раствора натрия тиосульфата (0,002% в пересчете на H2O2).

1 мл 0,002 M раствора натрия тиосульфата соответствует 34 мкг окисляющих веществ в пересчете на водорода пероксид.

201040034-2022

2.1.4.34 Метил-, этил- и изопропилметансульфонат в метансульфоновой кислоте

Данная общая фармакопейная статья распространяется на метод определения метил-, этил- и изопропилметансульфонатов в диапазоне концентраций от 0,5 ppm до 100 ppm.

Если данный метод предполагается использовать для определения концентраций метил-, этил- и изопропилметансульфонатов, выходящих за указанные выше пределы (например, на ранних стадиях синтеза до их удаления), концентрация испытуемого раствора должна быть соответствующим образом скорректирована.

МЕТОДИКА

Испытания проводят методом газовой хроматографии (2.1.2.27) с масс-спектрометрией (2.1.2.51).

Раствор внутреннего стандарта. 7 мкл СО ФЕАЭС бутилметансульфоната (БМС) доводят метиленхлоридом P до объема 10,0 мл. 10 мкл полученного раствора доводят метиленхлоридом P до объема 100,0 мл.

Испытуемый раствор. К 0,74 г испытуемого образца прибавляют 10,0 мл воды P и проводят экстракцию в делительной воронке с использованием 10,0 мл раствора внутреннего стандарта. Выдерживают до расслоения фаз, переносят органический слой во флакон, содержащий натрия сульфат безводный P. Встряхивают и фильтруют.

Раствор сравнения (а). По 50 мг метилметансульфоната P (ММС), этилметансульфоната P (ЭМС) и изопропилметансульфоната P (ИМС) растворяют в растворе внутреннего стандарта и доводят объем раствора тем же раствором до 50,0 мл. 74 мкл полученного раствора доводят раствором внутреннего стандарта до объема 10,0 мл. 100 мкл полученного раствора доводят раствором внутреннего стандарта до объема 10,0 мл.

Раствор сравнения (б). 3,0 мл раствора сравнения (а) доводят раствором внутреннего стандарта до объема 10,0 мл.

Условия хроматографирования:

• колонка: из расплавленного кварца длиной 15 м и внутренним диаметром 0,25 мм, покрытая слоем поли(диметил)силоксана P толщиной 1 мкм;
• газ-носитель: гелий для хроматографии P;
• скорость газа-носителя: 1 мл/мин;
• импульсный ввод без деления потока: 250 кПа, 0,25 мин;
• температура:

• детектор: масс-спектрометрический, описанный ниже; корректируют настройку детектора для соответствия критериям пригодности системы:
• квадрупольный масс-спектрометр, снабженный системой ионизации электронным ударом (70 эВ);
• для режима фрагментометрии (одноионный мониторинг) параметры масс-спектрометра устанавливают следующим образом:

• объем вводимой пробы: 2 мкл.

Относительное удерживание (время удерживания БМС около 7,6 мин): ММС - около 0,3; ЭМС - около 0,5; ИМС - около 0,6.

Пригодность хроматографической системы:

• разрешение: не менее 3,0 между пиками ЭМС и ИМС на хроматограмме раствора сравнения (а);
• отношение сигнал/шум: не менее 10 для пиков ММС, ЭМС и ИМС на хроматограмме раствора сравнения (б).

Содержание ММС, ЭМС или ИМС в частях на миллион (ppm) рассчитывают по формуле:

\frac{S_{2} \cdot S_{1}' \cdot a_{0} \cdot Q \cdot 0,148}{S_{1} \cdot S_{2}' \cdot a} ,

где: S1 - площадь пика ММС, ЭМС или ИМС на хроматограмме раствора сравнения (а);

S2 - площадь пика ММС, ЭМС или ИМС на хроматограмме испытуемого раствора;

Q - содержание основного вещества в навеске ММС, ЭМС или ИМС, в процентах;

S_{1}' - площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме раствора сравнения (а);

S_{2}' - площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме испытуемого раствора;

a0 - навеска ММС, ЭМС или ИМС, взятая для приготовления раствора сравнения (а), в миллиграммах;

a - навеска испытуемого образца, взятая для приготовления испытуемого раствора, в миллиграммах;

0,148 - коэффициент разведения.

201040035-2022

2.1.4.35 Метил-, этил- и изопропилметансульфонат в активных фармацевтических субстанциях

Данная общая фармакопейная статья распространяется на метод определения концентраций метил-, этил- и изопропилметансульфонатов (в диапазоне концентраций от 0,2 ppm до 5 ppm) в бетагистина мезилате.

Если данный метод предполагается использовать для определения метил-, этил- и изопропилметансульфонатов в других активных фармацевтических субстанциях, содержащих отличающиеся концентрации метил-, этил- и изопропилметансульфонатов, концентрация испытуемого раствора и раствора сравнения должна быть соответствующим образом скорректирована и проведена подходящая валидация.

МЕТОДИКА

Испытания проводят методом газовой хроматографии (2.1.2.27) с масс-спектрометрией (2.1.2.51).

Испытуемый раствор и раствор сравнения готовят непосредственно перед использованием.

Важно использовать ацетонитрил соответствующей чистоты.

Смесь растворителей. Вода P - ацетонитрил P (20:80, об/об).

Раствор А. 30 мг натрия тиосульфата безводного P и 60,0 г натрия йодида P растворяют в воде P и доводят объем раствора тем же растворителем до 50,0 мл.

Раствор внутреннего стандарта. 10 мкл СО ФЕАЭС бутилметансульфоната (БМС) доводят смесью растворителей до объема 10,0 мл. 20 мкл полученного раствора доводят смесью растворителей до объема 100,0 мл.

Контрольный раствор. 0,50 мл раствора A и 0,50 мл раствора внутреннего стандарта помещают во флакон для парофазного пробоотборника, немедленно закрывают флакон силиконовой мембраной с политетрафторэтиленовым покрытием и обкатывают алюминиевым колпачком.

Испытуемый раствор. 25,0 мг испытуемого образца помещают во флакон для парофазного пробоотборника вместимостью 20 мл, прибавляют 0,50 мл раствора A и 0,50 мл раствора внутреннего стандарта, немедленно закрывают флакон силиконовой мембраной с политетрафторэтиленовым покрытием и обкатывают алюминиевым колпачком.

В ходе реакции дериватизации может образоваться осадок, который не влияет на достоверность количественного определения.

Раствор сравнения (а). По 25,0 мг метилметансульфоната P (ММС), этилметансульфоната P (ЭМС) и изопропилметансульфоната P (ИМС) растворяют в толуоле P и доводят объем раствора тем же растворителем до 5,0 мл. 50 мкл полученного раствора доводят раствором внутреннего стандарта до объема 25,0 мл.

Раствор сравнения (б). 20 мкл раствора сравнения (а) доводят раствором внутреннего стандарта до объема 20,0 мл. 0,50 мл полученного раствора и 0,50 мл раствора A помещают во флакон для парофазного пробоотборника вместимостью 20 мл, немедленно закрывают флакон силиконовой мембраной с политетрафторэтиленовым покрытием и обкатывают алюминиевым колпачком.

Раствор сравнения (в). 500 мкл раствора сравнения (а) доводят раствором внутреннего стандарта до объема 20,0 мл. 0,50 мл полученного раствора и 0,50 мл раствора A помещают во флакон для парофазного пробоотборника вместимостью 20 мл, немедленно закрывают флакон силиконовой мембраной с политетрафторэтиленовым покрытием и обкатывают алюминиевым колпачком.

Условия хроматографирования:

• колонка: из расплавленного кварца длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм, покрытая слоем макрогола (полиэтиленгликоля) полярно дезактивированного толщиной 1 мкм;
• газ-носитель: гелий для хроматографии P;

В устройстве для ввода испытуемого образца используют инертный лайнер без стекловолокна, что уменьшает эффект переноса между вводами.

• скорость газа-носителя: 0,5 мл/мин;
• деление потока: 1:20;
• допускается использование условий статической парофазной хроматографии:
• температура уравновешивания: 60 °C;
• время уравновешивания: 30 мин;
• температура автоматической линии: 120 °C;
• температура:

<*> В конце анализа поднимают температуру колонки до 240 °C и поддерживают ее в течение 7 мин.

• детектор: масс-спектрометрический, описанный ниже; корректируют настройку детектора для соответствия критериям пригодности системы; альтернативно может быть использован подходящий детектор с электронной ловушкой:
• квадрупольный масс-спектрометр, снабженный системой ионизации электронным ударом (70 эВ);
• для режима фрагментометрии (одноионный мониторинг) параметры масс-спектрометра устанавливают следующим образом:

<**> Получены из БМС, ММС, ЭМС и ИМС в результате реакции дериватизации.

• объем вводимой пробы: по 1 мл равновесной газовой фазы испытуемого образца, раствора сравнения (б), раствора сравнения (в) и контрольного раствора.

Относительное удерживание (время удерживания бутилйодида около 8,5 мин): метилйодид - около 0,51; этилйодид - около 0,63; изопропилйодид - около 0,68.

Пригодность хроматографической системы:

• разрешение: не менее 1,5 между пиками этилйодида и изопропилйодида на хроматограмме раствора сравнения (в);
• отношение сигнал/шум: не менее 10 для пиков каждого алкилйодида на хроматограмме раствора сравнения (б).

Содержание каждого алкилметансульфоната в частях на миллион (ppm) рассчитывают по формуле:

\frac{S_{2} \cdot S_{1}' \cdot a_{1} \cdot Q \cdot 0,05}{S_{1} \cdot S_{2}' \cdot a_{2}} ,

где: S1 - площадь пика каждого алкилйодида на хроматограмме раствора сравнения (в);

S2 - площадь пика каждого алкилйодида на хроматограмме испытуемого раствора;

Q - содержание основного вещества в каждом эфире, в процентах;

S_{1}' - площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме раствора сравнения (в);

S_{2}' - площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме испытуемого раствора;

a1 - навеска каждого эфира, взятая для приготовления раствора сравнения (а), в миллиграммах;

a2 - навеска испытуемого образца, взятая для приготовления испытуемого раствора, в миллиграммах;

0,05 - коэффициент разведения.

201040036-2022

2.1.4.36 Метансульфонилхлорид в метансульфоновой кислоте

Данная общая фармакопейная статья распространяется на метод определения метансульфонилхлорида в метансульфоновой кислоте в диапазоне концентраций от 0,05 ppm до 50 ppm.

Испытания проводят методом газовой хроматографии (2.1.2.27) с масс-спектрометрией (2.1.2.51).

Раствор внутреннего стандарта. 7 мкл СО ФЕАЭС бутилметансульфоната (БМС) растворяют в метиленхлориде P и доводят объем раствора тем же растворителем до 10,0 мл. 5,0 мл полученного раствора доводят метиленхлоридом P до объема 50,0 мл.

Испытуемый раствор. К 5 мл воды P добавляют 7,4 г испытуемого образца и медленно перемешивают. После охлаждения прибавляют 5,0 мл метиленхлорида P, 100 мкл раствора внутреннего стандарта и встряхивают. Выдерживают до расслоения фаз, переносят органический слой во флакон, содержащий 1 г натрия сульфата безводного P. Экстракцию повторяют дважды, каждый раз используя 5,0 мл метиленхлорида P. Органические слои смешивают и фильтруют.

Раствор сравнения (а). 50,0 мг метансульфонилхлорида P растворяют в метиленхлориде P и доводят объем раствора тем же растворителем до 10,0 мл. 1,0 мл полученного раствора доводят метиленхлоридом P до объема 10,0 мл. 300 мкл полученного раствора доводят метиленхлоридом P до объема 10,0 мл.

Раствор сравнения (б). 500 мкл раствора сравнения (а) и 100 мкл раствора внутреннего стандарта доводят метиленхлоридом P до объема 15,0 мл.

Раствор сравнения (в). 25 мкл раствора сравнения (а) и 100 мкл раствора внутреннего стандарта доводят метиленхлоридом P до объема 15,0 мл.

Условия хроматографирования:

• колонка: из расплавленного кварца длиной 15 м и внутренним диаметром 0,25 мм, покрытая слоем поли(диметил)силоксана P толщиной 1 мкм;
• газ-носителъ: гелий для хроматографии P;
• скорость газа-носителя: 1 мл/мин;
• импульсный ввод без деления потока: 60 кПа, 0,1 мин;
• температура:

<*> В конце анализа поднимают температуру колонки до 270 °C и поддерживают ее в течение 8 мин.

• детектор: масс-спектрометрический, описанный ниже; корректируют настройку детектора для соответствия критериям пригодности системы:
• квадрупольный масс-спектрометр, снабженный системой ионизации электронным ударом (70 эВ);
• для режима фрагментометрии (одноионный мониторинг) параметры масс-спектрометра устанавливают следующим образом:

• объем вводимой пробы: 5 мкл.

Относительное удерживание (время удерживания внутреннего стандарта (БМС) около 7,2 мин): метансульфонилхлорид - около 0,68.

Пригодность хроматографической системы:

• на хроматограмме раствора внутреннего стандарта не должен обнаруживаться пик со временем удерживания, идентичным метансульфонилхлориду;
• разрешение: не менее 5,0 между пиками метансульфонилхлорида и БМС на хроматограмме раствора сравнения (б);
• отношение сигнал/шум: не менее 10 для пика метансульфонилхлорида на хроматограмме раствора сравнения (в).

Содержание метансульфонилхлорида в частях на миллион (ppm) рассчитывают по формуле:

\frac{S_{2} \cdot S_{1}' \cdot a_{1} \cdot Q \cdot 1,5}{S_{1} \cdot S_{2}' \cdot a_{2}} ,

где: S1 - площадь пика метансульфонилхлорида на хроматограмме раствора сравнения (б);

S2 - площадь пика метансульфонилхлорида на хроматограмме испытуемого раствора;

Q - содержание основного вещества в метансульфонилхлориде, в процентах;

S_{1}' - площадь пика внутреннего стандарта (БМС) на хроматограмме раствора сравнения (б);

S_{2}' - площадь пика внутреннего стандарта (БМС) на хроматограмме испытуемого раствора;

a1 - навеска метансульфонилхлорида, взятая для приготовления раствора сравнения (а), в миллиграммах;

a2 - навеска испытуемого образца, взятая для приготовления испытуемого раствора, в миллиграммах;

1,5 - коэффициент разведения.

2.1.5 МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ

201050016-2022

2.1.5.16 Определение фтора

Содержание фтора, входящего в состав молекулы лекарственного средства, может быть определено одним из трех методов: титриметрическим, спектрофотометрическим или ионометрическим. При выполнении анализа используется пластиковая посуда.

1. ТИТРИМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД

Точную навеску лекарственного средства, указанную в фармакопейной статье (с содержанием фтора около 3,8 мг), сжигают в колбе с кислородом, поглощая продукты сжигания 15 мл воды P. Пробку, держатель образца и стенки колбы промывают 40 мл воды P (2.1.5.10. Метод сжигания в колбе с кислородом), прибавляют 0,6 мл раствора ализарина S P и по каплям 0,1 M раствор натрия гидроксида до красного окрашивания, затем 2 - 3 капли 1,5% раствора азотной кислоты P до перехода в желтое окрашивание, 3,5 мл буферного раствора с pH 3,0 и титруют 0,005 M раствором тория (IV) нитрата до розовой окраски.

1 мл 0,005 M раствора тория (IV) нитрата соответствует 0,380 мг фтора.

Примечания.

Приготовление буферного раствора с pH 3,0. 24,0 г натрия дигидрофосфата безводного P растворяют в воде P. Корректируют pH до значения 3,0 потенциометрически фосфорной кислотой разбавленной P и доводят объем раствора водой P до 1000,0 мл.

0,005 M тория (IV) нитрата раствор. 2,761 г тория (IV) нитрата P Th(NO3)4 · 4H2O растворяют в воде P, доводят объем раствора тем же растворителем до 1000,0 мл и перемешивают.

Установка титра. 0,05 г натрия фторида PO, предварительно высушенного при температуре 150 °C до постоянной массы, растворяют в воде P, доводят объем раствора тем же растворителем 250,0 мл и перемешивают К 20,0 мл полученного раствора прибавляют 0,6 мл раствора ализарина S P и по каплям 0,1 M раствор натрия гидроксида до перехода розовой окраски в желтую. Затем прибавляют 5,0 мл буферного раствора с pH 3,0 и титруют 0,005 M раствором тория (IV) нитрата до перехода желтой окраски в розовую.

1 мл 0,005 M раствора тория (IV) нитрата соответствует 0,380 мг фтора.

2. СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД

Точную навеску лекарственного средства, указанную в фармакопейной статье (с содержанием фтора 50,0 - 70,0 мг), сжигают в колбе с кислородом, поглощая продукты сжигания 15 мл воды P. Пробку, держатель образца и стенки колбы промывают 40 мл воды P (2.1.5.10. Метод сжигания в колбе с кислородом), раствор количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, прибавляют по 25,0 мл 0,01% раствора арсеназо I и 0,005 M раствора тория (IV) нитрата, доводят объем раствора водой P до метки и перемешивают. Через 30 мин измеряют оптическую плотность испытуемого раствора при длине волны 580 нм относительно компенсационного раствора, содержащего те же количества реактивов, но без лекарственного средства. Содержание фтора определяют по калибровочному графику.

Приготовление растворов сравнения.

4,0; 5,0; 6,0; 7,0; и 8,0 мл стандартного раствора фторид-ионов (10 ppm F-) (2.2.1.2. Стандартные растворы для испытаний на предельное содержание примесей) разбавляют до 100,0 мл и далее поступают, как указано выше, начиная со слов "... прибавляют по 25,0 мл 0,01% раствора арсеназо I".

Примечание.

Приготовление 0,01% раствор арсеназо I. 0,01 г арсеназо I P растворяют в воде P, доводят объем раствора водой P до 100,0 мл и перемешивают.

3. ИОНОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД

К точной навеске лекарственного средства, указанной в частной фармакопейной статье (с содержанием фтора около 20,0 мг), прибавляют 400 мл воды P и выдерживают в течение 20 мин на водяной бане при температуре около 80 °C, периодически перемешивая. Охлаждают до комнатной температуры, доводят объем раствора до 500,0 мл и фильтруют.

К объему полученного раствора, указанному в частной фармакопейной статье, прибавляют равный объем буферного раствора с pH 5,25 и перемешивают.

Определение содержания фторид-ионов проводят как описано в 2.1.2.47. Потенциометрическое определение концентрации ионов с использованием ионоселективных электродов. В качестве измерительного электрода используют фторидселективный электрод, в качестве электрода сравнения - хлорсеребряный или каломельный электроды.

Готовят не менее 3 стандартных растворов фторид-ионов подходящих концентраций, путем разбавления основного стандартного раствора фторид-ионов 2000 мкг/мл.

Строят калибровочный график зависимости разности потенциалов от логарифма концентрации фторид-ионов. По графику находят значение логарифма концентрации (lgC) для испытуемого раствора.

Концентрацию фторид-ионов (C) в испытуемом растворе, в микрограммах на миллилитр, вычисляют по формуле:

C = 10px,

где x = lgC.

Буферный раствор с pH от 5,2 до 5,3. 57,0 мл уксусной кислоты ледяной P, 58,0 г натрия хлорида P и 4 г циклогексилендинитрилтетрауксусной кислоты P растворяют в воде P и доводят объем раствора тем же растворителем до 500,0 мл. Корректируют значение pH от 5,2 до 5,3 раствором натрия гидроксида P и доводят объем раствора водой P до 1000,0 мл. Раствор выдерживают в течение 24 ч.

Указанные количества компонентов могут быть изменены в зависимости от испытания и состава испытуемого образца.

Основной стандартный раствор фторид-ионов (2000 ppm F-). 4,42 г натрия фторида P, предварительно высушенного при температуре 300 °C в течение 12 ч, растворяют в воде P и доводят объем раствора тем же растворителем до 1000,0 мл (2000 мкг/мл).

Раствор хранят в полиэтиленовой или полипропиленовой емкости при комнатной температуре.

Срок хранения (срок годности) - не более 3 мес.

201050017-2022

2.1.5.17 Определение кислотонейтрализующей способности

Показатель Кислотонейтрализующая способность характеризует основные свойства лекарственных средств-антацидов - способность связывать хлороводородную кислоту. Кислотонейтрализующая способность выражается количеством миллиграмм-эквивалентов хлороводородной кислоты, связываемой 1 г или минимальной дозой лекарственного средства.

ПРИГОТОВЛЕНИЕ ИСПЫТУЕМОГО РАСТВОРА

Все испытания должны проводиться при температуре (37 +/- 3) °C.

При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье, испытуемый раствор готовят следующим образом:

Субстанции для фармацевтического применения, твердые лекарственные формы. Точно взвешенное количество (указанное в частной фармакопейной статье) субстанции для фармацевтического применения или препарата, эквивалентное минимальной дозе, помещают в стакан вместимостью 250 мл. Прибавляют 70 мл воды P и перемешивают на магнитной мешалке в течение 1 мин. При необходимости испытуемый образец увлажняют, прибавляя не более 5 мл этанола (96%) P (доведенного до величины pH 3,5, потенциометрически) и перемешивают до полного смачивания образца.

В случае шипучих таблеток к навеске сначала прибавляют 10 мл воды P и осторожно вращают стакан, пока реакция не прекратится. Добавляют еще 10 мл воды P и осторожно перемешивают. Обмывают стенки стакана 50 мл воды P и перемешивают на магнитной мешалке в течение 1 мин.

Суспензии и другие жидкости. Встряхивают контейнер, пока содержимое не станет однородным, определяют плотность в соответствии с общей фармакопейной статьей 2.1.2.5. Относительная плотность. Переносят точно взвешенное количество однородной смеси, эквивалентное минимальной дозе, в стакан вместимостью 250 мл, добавляют воду P до объема приблизительно 70 мл и перемешивают на магнитной мешалке в течение 1 мин.

МЕТОДИКА

К испытуемому раствору при перемешивании на магнитной мешалке прибавляют 30,0 мл 1 M хлороводородной кислоты. Перемешивают в течение 15 мин после добавления кислоты и немедленно начинают титровать избыток хлороводородной кислоты 0,5 M раствором натрия гидроксида в течение времени, не превышающего 5 мин, до достижения устойчивого в течение от 10 до 15 с значения pH 3,5 (потенциометрически).

Вычисляют количество миллиграмм-эквивалентов (мг-экв) поглощенной кислоты по формуле:

Xмг-экв = (30 · MHCl) - (VNaOH · MNaOH), (1)

где MHCl и MNaOH - молярная концентрация хлороводородной кислоты и натрия гидроксида соответственно;

VNaOH - объем 0,5 M раствора натрия гидроксида, израсходованный на титрование.

Если кислотонейтрализующая способность испытуемого образца больше 25 мг-экв, добавляют 60,0 мл 1 M хлороводородной кислоты и делают соответствующее изменение при вычислении.

Выражают результат в миллиграмм-эквивалентах (мг-экв) кислоты, поглощенной 1 г испытуемой субстанции для фармацевтического применения или испытуемого препарата (X1) или минимальной дозой (X2):

Для субстанций для фармацевтического применения или твердых лекарственных форм:

X_{1} = \frac{\text{мг} - \text{экв}}{a} (2)

X_{2} = \frac{\text{мг} - \text{экв} \cdot b}{a} (3)

где a - навеска субстанции для фармацевтического применения или испытуемого препарата, г;

b - средняя масса таблетки или содержимого капсулы, соответствующая минимальной дозе, г.

Для жидкостей:

X_{2} = \frac{\text{мг} - \text{экв} \cdot V_{\text{дозы}} \cdot \rho}{a} (4)

где Vдозы - объем минимальной дозы, мл;

\rho - плотность жидкости, г/мл;

a - навеска испытуемого препарата, г.

201050018-2022

2.1.5.18 Цинк в инсулине

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на определение цинка в лекарственных препаратах и активных фармацевтических субстанциях инсулина. Определение цинка проводят методом атомно-абсорбционной спектрометрии (общая фармакопейная статья 2.1.2.22. Атомно-абсорбционная спектрометрия, метод I).

Испытуемый раствор:

• для лекарственных препаратов для парентерального применения в лекарственной форме растворили суспензия

В случае если испытуемый лекарственный препарат представляет собой суспензию, в упаковку предварительно добавляют 2 мкл 6 M хлороводородной кислоты P (при активности инсулина 40 МЕ/мл) или 4 мкл (при активности инсулина 100 МЕ/мл) на 1 мл лекарственного препарата и тщательно перемешивают.

Объединяют содержимое не менее 3 упаковок и перемешивают. Объем полученного образца, эквивалентный 100 МЕ, доводят 0,01 M хлороводородной кислотой P до 25,0 мл и перемешивают. При необходимости выполняют дополнительное разведение до получения концентрации цинка в пределах 0,4 - 1,6 мкг/мл.

• для надосадочной жидкости в лекарственных препаратах для парентерального применения в лекарственной форме суспензия

Тщательно перемешивают содержимое каждой упаковки до гомогенного состояния, объединяют содержимое не менее 3 упаковок, отбирают 5 - 10 мл гомогенной суспензии, переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют. Используя надосадочную жидкость готовят раствор с концентрацией цинка в пределах 0,4 - 1,6 мкг/мл, используя 0,01 M хлороводородную кислоту P в качестве разбавителя.

• для активной фармацевтической субстанции

50,0 мг инсулина растворяют, избегая пенообразования, в 0,01 M хлороводородной кислоте P, доводят объем раствора тем же растворителем до 25,0 мл и перемешивают. Полученный раствор разводят 0,01 M хлороводородной кислоты P до концентрации цинка в пределах 0,4 - 1,6 мкг/мл и перемешивают.

Калибровочные растворы. С помощью стандартного раствора цинка ионов (5 мг/мл Zn2+) P готовят не менее 5 калибровочных растворов в диапазоне концентраций, зависящем от содержания цинка в лекарственном средстве и от рабочего диапазона применяемого оборудования, используя 0,01 M хлороводородную кислоту P в качестве разбавителя.

Условия испытания

Измеряют поглощение испытуемого, контрольного и калибровочных растворов.

Строят калибровочный график зависимости атомного поглощения от концентрации цинка (мкг/мл).

Пригодность системы

Относительное стандартное отклонение атомного поглощения для калибровочного раствора с концентрацией цинка 0,8 мкг/мл должно быть не более 1,4% (6 измерений).

Коэффициент корреляции калибровочного графика должен составлять не менее 0,99.

Концентрацию цинка (C, мкг/мл) в испытуемом растворе определяют по калибровочному графику.

Содержание цинка в лекарственном препарате в микрограммах на миллилитр (X1) вычисляют по формуле:

X1 = C · N,

где: C - концентрация цинка в испытуемом растворе, определенная по калибровочному графику, в микрограммах на миллилитр;

N - разведение испытуемого раствора.

Содержание цинка в активной фармацевтической субстанции в пересчете на сухое вещество в процентах (X2) вычисляют по формуле:

X_{2} = \frac{C \cdot N \cdot 250}{a \cdot (100 - W)} ,

где: C - концентрация цинка в испытуемом растворе, определенная по калибровочному графику, в микрограммах на миллилитр;

a - навеска инсулина, в миллиграммах;

N - дополнительное разведение испытуемого раствора;

W - потеря в массе при высушивании, в процентах.

201050019-2022

2.1.5.19 Метод формольного титрования

Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на метод формольного титрования, предназначенный для определения аминного азота свободных (концевых) аминогрупп в препаратах аминокислот, пептидов, белков и других с содержанием азота 1,5 - 5,0 мг в 1 мл испытуемого раствора. Метод формольного титрования (метод Серенсена) основан на защите формальдегидом свободных аминогрупп с образованием оснований Шиффа и алкалиметрическом титровании эквивалентного количества карбоксильных групп.

Метод не применим в случае присутствия ионов аммония, так как при этом высок риск получения завышенных результатов определения.

К точной навеске или точному объему испытуемого образца, указанного в частной фармакопейной статье, прибавляют воду P до объема 20 мл. При необходимости раствор нейтрализуют потенциометрически до pH 7,0, путем прибавления 0,1 M раствора натрия гидроксида или 0,1 M хлороводородной кислоты. По окончании нейтрализации прибавляют от 2 до 10 мл (конкретные величины указывают в частной фармакопейной статье) формальдегида раствор P, нейтрализованного в день анализа натрия гидроксида раствором 10% до pH 7,0, перемешивают и титруют 0,1 M раствором натрия гидроксида до значения pH 9,1 или до появления слабо-розового окрашивания (индикатор - фенолфталеина раствор P1), не изменяющихся при перемешивании в течение 2 мин.

Параллельно проводят контрольный опыт.

В зависимости от количества функциональных групп в определяемом соединении титр будет разным и должен быть установлен для каждого конкретного случая.

В частности, при определении аминного азота 1 мл 0,1 M раствора натрия гидроксида соответствует 1,4 мг аминного азота.

2.1.8 МЕТОДЫ ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКИХ ИСПЫТАНИЙ

201080018-2022

2.1.8.18 Определение коэффициента водопоглощения и расходного коэффициента для лекарственного растительного сырья

Настоящая общая фармакопейная статья предназначена для учета вклада коэффициента водопоглощения при получении требуемых количеств водных извлечений из лекарственного растительного сырья, содержащего полисахариды (например: мать-и-мачехи листья и др.) и расходного коэффициента - при получении требуемых количеств водных извлечений из лекарственного растительного сырья, содержащего слизь (например: алтея корни).

КОЭФФИЦИЕНТ ВОДОПОГЛОЩЕНИЯ

Коэффициент водопоглощения - показатель, определяемый количеством воды в миллилитрах, удерживаемой 1,0 г лекарственного растительного сырья после его отжатия в перфорированном стакане инфундирного аппарата. Коэффициент водопоглощения используется для расчетов при получении водных извлечений из лекарственного растительного сырья.

Для определения коэффициента водопоглощения навеску цельного или измельченного лекарственного растительного сырья массой 10,0 г заливают водой P и готовят водное извлечение в соответствии с общей фармакопейной статьей 2.5.1.15. Настои и отвары. Полученное водное извлечение процеживают, оставшееся в перфорированном стакане инфундирного аппарата сырье отжимают и измеряют объем извлечения.

Коэффициент водопоглощения (Квп) рассчитывают по следующей формуле:

\text{К}_{\text{вп}} = \frac{V_{1} - V_{2}}{m} ,

где: V1 - требуемый объем водного извлечения, в миллилитрах;

V2 - полученный объем водного извлечения после отжатия сырья, в миллилитрах;

m - масса лекарственного растительного сырья, в граммах.

Коэффициент водопоглощения рассчитывают как среднее арифметическое результатов трех параллельных определений.

Значения коэффициента водопоглощения заимствуют из таблицы 1 или используют его условные значения.

В таблице 2.1.8.18.-1 приведены значения коэффициентов водопоглощения для отдельных видов лекарственного растительного сырья.

Таблица 2.1.8.18.-1. - Коэффициенты водопоглощения отдельных видов лекарственного растительного сырья

При отсутствии коэффициента водопоглощения для лекарственного растительного сырья отдельных морфологических групп используют следующие условные значения:

• для корней и корневищ - 1,5 мл/г;
• для коры, почек, травы и цветков - 2,0 мл/г;
• для семян - 3,0 мл/г.

Объем воды (Vквп), необходимый для получения водного извлечения с учетом коэффициента водопоглощения (Квп), рассчитывают по следующей формуле:

Vквп = V + m · Квп,

где: V - требуемый объем водного извлечения, в миллилитрах;

m - масса лекарственного растительного сырья, необходимая для получения водного извлечения, в граммах;

Квп - коэффициент водопоглощения лекарственного растительного сырья.

РАСХОДНЫЙ КОЭФФИЦИЕНТ

При получении водных извлечений из лекарственного растительного сырья, содержащего слизь, в частности - алтея корней, используют расходный коэффициент (Кр). Расходный коэффициент показывает во сколько раз следует увеличить массу сырья и объем воды P для получения требуемого объема (мл) водного извлечения.

Расходные коэффициенты для получения водного извлечения из алтея корней при различных соотношениях растительного сырья и воды P приведены в таблице 2.1.8.18.-2.

Таблица 2.1.8.18.-2. - Расходные коэффициенты для получения водного извлечения алтея корней при различных соотношениях сырья и воды P

Для водного извлечения из алтея корней с концентрацией более 5% (1:20) расходный коэффициент (Кр) рассчитывают по формуле:

\text{К}_{\text{р}} = \frac{100}{100 - (m \cdot 4,6)} ,

где: m - масса алтея корня в граммах, необходимая для получения 100 мл водного извлечения необходимой концентрации;

4,6 - постоянная величина, показывающая, что 1,0 г алтея корня удерживает 4,6 мл воды P.

201080019-2022

2.1.8.19 Идентификация жирных масел методом тонкослойной хроматографии

Испытания проводят методом тонкослойной хроматографии (2.1.2.26).

МЕТОДИКА 1

Испытуемый раствор. Около 20 мг (1 каплю) жирного масла растворяют в 3 мл метиленхлорида P, при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье.

Раствор сравнения. Около 20 мг (1 каплю) кукурузного масла P растворяют в 3 мл метиленхлорида P.

Условия хроматографирования:

• ТСХ пластинка со слоем силикагеля октадецилсилильного P [2 - 10 мкм];
• подвижная фаза А: эфир P;
• подвижная фаза Б: метиленхлорид P - уксусная кислота ледяная P - ацетон P (20:40:50, об/об/об);
• объем наносимой пробы: 1 мкл;
• пробег фронта подвижной фазы: дважды с подвижной фазой А не менее 0,5 см от линии старта, затем дважды с подвижной фазой Б не менее 8 см от линии старта;
• высушивание: на воздухе;
• детектирование: опрыскивают раствором 100 г/л фосфорномолибденовой кислоты P в этаноле (96%) P, нагревают при температуре 120 °C в течение около 3 мин и просматривают при дневном свете.

Типичная хроматограмма для идентификации жирных масел приведена на рисунке 2.1.8.19.-1.

Рисунок 2.1.8.19.-1. - Хроматограмма для идентификации жирных масел (методика 1). 1 - арахисовое масло; 2 - кунжутное масло; 3 - кукурузное масло; 4 - рапсовое масло; 5 - соевое масло; 6 - рапсовое масло (не содержащее эруковой кислоты); 7 - льняное масло; 8 - оливковое масло; 9 - подсолнечное масло; 10 - миндальное масло; 11 - масло зародышей пшеницы; 12 - масло бурачника лекарственного; 13 - энотеровое масло; 14 - сафлоровое масло (тип I); 15 - сафлоровое масло (тип II); 16 - гидрогенизированное арахисовое масло

МЕТОДИКА 2

Испытуемый раствор. Около 20 мг (1 каплю) жирного масла растворяют в 3 мл метиленхлорида P, при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье.

Раствор сравнения. Около 20 мг (1 каплю) кукурузного масла P растворяют в 3 мл метиленхлорида P.

Условия хроматографирования:

• ТСХ пластинка со слоем силикагеля октадецилсилильного P [2 - 10 мкм];
• подвижная фаза: метиленхлорид P - уксусная кислота ледяная P - ацетон P (20:40:50, об/об/об);
• объем наносимой пробы: 1 мкл в виде полос длиной 8 мм (может быть использован подходящий автоматизированный прибор);
• пробег фронта подвижной фазы: не менее 7 см от линии старта;
• высушивание: на воздухе;
• детектирование: обрабатывают раствором 100 г/л фосфорномолибденовой кислоты P в этаноле (96%) P, нагревают при температуре 120 °C в течение 3 мин и просматривают при дневном свете.

Типичная хроматограмма для идентификации жирных масел приведена на рисунке 2.1.8.19.-2.

Рисунок 2.1.8.19.-2. - Хроматограмма для идентификации жирных масел (методика 2). 1 - арахисовое масло; 2 - кунжутное масло; 3 - кукурузное масло; 4 - рапсовое масло; 5 - соевое масло; 6 - рапсовое масло (не содержащее эруковой кислоты); 7 - льняное масло; 8 - оливковое масло; 9 - подсолнечное масло; 10 - миндальное масло; 11 - масло зародышей пшеницы; 12 - масло бурачника лекарственного; 13 - энотеровое масло; 14 - сафлоровое масло (тип I); 15 - сафлоровое масло (тип II); 16 - гидрогенизированное арахисовое масло

201080020-2022

2.1.8.20 Определение щелочных примесей в жирных маслах

В пробирку помещают 10 мл свежеперегнанного ацетона P и 0,3 мл воды P, прибавляют 0,05 мл раствора 0,4 г/л бромфенолового синего P в этаноле (96%) P; при необходимости раствор нейтрализуют 0,01 M хлороводородной кислотой или 0,01 M раствором натрия гидроксида, затем прибавляют 10 мл испытуемого масла, встряхивают и оставляют до разделения слоев.

Для изменения окраски верхнего слоя в желтую должно быть израсходовано не более 0,1 мл 0,01 M хлороводородной кислоты.

201080021-2022

2.1.8.21 Определение посторонних масел в жирных маслах методом тонкослойной хроматографии

Испытание проводят методом тонкослойной хроматографии в соответствии с общей фармацевтической статьей 2.1.2.26. Тонкослойная хроматография с использованием в качестве тонкого слоя кизельгура G P.

Пластинку пропитывают, поместив в камеру, содержащую смесь парафин жидкий P - петролейный эфир P (10:90, об/об) в таком количестве, чтобы нижний край пластинки был погружен в жидкость на 5 мм. Когда смесь для пропитывания поднимется не менее чем на 12 см от нижнего края пластинки, ее вынимают из камеры и дают растворителю испариться в течение 5 мин. Последующее хроматографирование проводят в том же направлении, что и подготовка пластинки к испытанию.

Приготовление смеси жирных кислот. К 2 г масла прибавляют 30 мл 0,5 M раствора калия гидроксида спиртового и нагревают с обратным холодильником в течение 45 мин. Добавляют 50 мл воды P, охлаждают, переносят в делительную воронку и экстрагируют тремя порциями эфира P по 50 мл. Эфирные слои отбрасывают, водный слой подкисляют хлороводородной кислотой P и вновь встряхивают с тремя порциями эфира P по 50 мл. Эфирные экстракты объединяют и встряхивают с тремя порциями воды P по 10 мл, отбрасывая промывные воды. Объединенные эфирные экстракты сушат над натрия сульфатом безводным P и фильтруют. Затем эфир выпаривают на водяной бане, а из полученного остатка готовят испытуемый раствор. Жирные кислоты также можно извлечь из щелочного раствора, полученного при определении неомыляемых веществ.

Испытуемый раствор. 40 мг смеси жирных кислот, полученной из испытуемого образца масла, растворяют в 4 мл хлороформа P.

Раствор сравнения. 40 мг смеси жирных кислот, полученной из смеси 19 объемов кукурузного масла P и 1 объема рапсового масла P, растворяют в 4 мл хлороформа P.

На линию старта хроматографической пластинки наносят по 3 мкл испытуемого раствора и раствора сравнения. Помещают пластинку в камеру с системой растворителей: вода P - кислота уксусная ледяная P (10:90 об/об). Когда фронт растворителей пройдет 8 см от линии старта, пластинку вынимают из камеры, сушат при температуре 110 °C в течение 10 мин и оставляют до охлаждения. Затем, при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье, пластинку помещают в закрытую с плотно подогнанной крышкой хроматографическую камеру, предварительно насыщенную парами йода (на дно камеры в выпарительной чашке помещают йод P). Через некоторое время проявляются коричневые или желтовато-коричневые пятна. Пластинку вынимают из камеры и оставляют на несколько минут до исчезновения коричневого фона и опрыскивают раствором крахмала P. Появляются синие пятна (зона адсорбции), которые могут приобретать коричневую окраску при высушивании и вновь становятся синими после опрыскивания водой P.

На хроматограмме испытуемого раствора всегда должны обнаруживаться пятна с RF около 0,5 (олеиновая кислота) и пятно с RF около 0,65 (линолевая кислота), соответствующие пятнам на хроматограмме раствора сравнения. На хроматограмме испытуемого раствора некоторых масел может обнаруживаться пятно с RF около 0,75 (линоленовая кислота). При сравнении пятен на хроматограммах испытуемого раствора и раствора сравнения на хроматограмме испытуемого раствора не должно обнаруживаться пятно с RF около 0,25 (эруковая кислота).

201080022-2022

2.1.8.22 Определение никеля в гидрогенизированных растительных маслах

Определение проводят методом атомно-абсорбционной спектрометрии (2.1.2.22, метод I).

Перед использованием реактивы магния нитрат P и аммония дигидрофосфат P должны быть проверены на наличие никеля. При расчете содержания никеля в испытуемом образце учитывают его фактическое содержание в реактивах.

Испытуемый раствор. 0,250 г (m) испытуемого образца помещают в подходящий реакционный сосуд, устойчивый к высокому давлению (например, из фторполимера или кварцевого стекла), прибавляют 6,0 мл азотной кислоты, свободной от никеля, P и 2,0 мл раствора водорода пероксида концентрированного P. Аналогичным образом готовят контрольный раствор. Закрытые сосуды помещают в лабораторную микроволновую печь и обрабатывают их содержимое в соответствии с подходящей программой, например, при мощности 1000 Вт в течение 40 мин. Прежде чем открыть, реакционные сосуды охлаждают, затем прибавляют по 2,0 мл раствора водорода пероксида концентрированного P и повторяют стадию обработки. По окончании цикла сосуды охлаждают. Содержимое сосудов количественно переносят в мерные колбы вместимостью 25 мл, прибавляют в каждую колбу по 0,5 мл раствора 10 г/л магния нитрата P и раствора 100 г/л аммония дигидрофосфата P, доводят объем растворов водой для хроматографии P до 25,0 мл и перемешивают.

Растворы сравнения. В четыре мерные колбы вместимостью 25 мл помещают 25 мкл, 50 мкл, 75 мкл, 100 мкл стандартного раствора никеля ионов (5 ppm Ni2+) P. В каждую колбу прибавляют 0,5 мл раствора 10 г/л магния нитрата P, 0,5 мл раствора 100 г/л аммония дигидрофосфата P, 6,0 мл азотной кислоты, свободной от никеля, P, доводят водой для хроматографии P до объема 25,0 мл и перемешивают. Концентрация никеля в полученных растворах сравнения составляет 5 нг/мл, 10 нг/мл, 15 нг/мл и 20 нг/мл (ppb), соответственно.

Контрольный раствор. 1,0 мл раствора 10 г/л магния нитрата P, 1,0 мл раствора 100 г/л аммония дигидрофосфата P и 12,0 мл азотной кислоты, свободной от никеля, P доводят водой для хроматографии P до объема 50,0 мл и перемешивают.

Испытание.

Для испытания используют метод атомно-абсорбционной спектрометрии (2.1.2.22, метод I).

Условия определения:

• источник: никелевая лампа с полым катодом;
• длина волны: 232,0 нм;
• атомизатор: электротермический (графитовая трубчатая печь), оснащенный системой коррекции фона, трубкой с пиролитическим покрытием;
• температурный режим: нагрев до температуры высушивания (120 °C) проводят в течение 5 с и выдерживают при этой температуре в течение 35 с, нагрев до температуры озоления (1100 °C) проводят в течение 30 с и выдерживают при этой температуре в течение 10 с, охлаждение до температуры 800 °C проводят в течение 5 с и выдерживают при этой температуре 5 с, атомизацию проводят при температуре 2600 °C в течение 7 с.

Оптимальная температурная программа может отличаться для каждого прибора, поэтому допускается использование программы в соответствии с инструкцией завода-производителя.

Содержание никеля в испытуемом растворе определяют по полученной калибровочной кривой на основании соответствующей величины поглощения для испытуемого раствора. При необходимости, для получения значений поглощения в диапазоне калибровки, испытуемый раствор разводят контрольным раствором. Содержание никеля в микрограммах на грамм (ppm) рассчитывают по следующей формуле:

X = \frac{c \cdot f}{m \cdot 40} ,

где: c - измеренная концентрация никеля в нанограммах на миллилитр;

f - коэффициент разбавления испытуемого раствора;

m - масса навески испытуемого образца в граммах.

201080023-2022

2.1.8.23 Общий холестерин в маслах с полиненасыщенными жирными омега-3 кислотами

Испытание может быть использовано для количественного определения общего содержания свободного и этерифицированного холестерина в лекарственных средствах животного происхождения с различной концентрацией омега-3 кислот. Холестерин в маслах с полиненасыщенными жирными омега-3 кислоты присутствует в продуктах из рыбьего жира, жира печени рыб.

Для количественного определения свободного и этерифицированного холестерина применяют метод газовой хроматографии с пламенно-ионизационной детекцией (2.1.2.27).

Основной раствор внутреннего стандарта. 0,15 г (5\alpha) - \text{холестана} P растворяют в гептане P и доводят объем тем же растворителем до 50,0 мл. Допускается хранение раствора внутреннего стандарта в морозильной камере до 6 месяцев.

Рабочий раствор внутреннего стандарта. Готовят непосредственно перед использованием. 1,0 мл основного раствора внутреннего стандарта доводят гептаном P до объема 10,0 мл.

Основной раствор холестерина. 50,0 мг холестерола P растворяют в гептане P и доводят объем раствора до 100,0 мл тем же растворителем. Основной раствор может храниться в морозильной камере до 6 месяцев.

Рабочий раствор холестерина. Готовят непосредственно перед использованием. 1,0 мл основного раствора холестерина растворяют в гептане P и доводят объем раствора до 10,0 мл тем же растворителем.

Основной раствор холестерина и \alpha - \text{токоферола} . 50,0 мг холестерина P и 50,0 мг \alpha - \text{токоферола} P растворяют в гептане P и доводят объем раствора до 100,0 мл тем же растворителем. Раствор можно хранить при комнатной температуре до 3 месяцев.

Раствор сравнения. Готовят раствор в день использования. 1,0 мл основного раствора холестерина и \alpha - \text{токоферола} растворяют в гептане P и доводят объем раствора до 100,0 мл тем же растворителем.

Калибровочные растворы. Готовят растворы в день использования. Навеску для каждого калибровочного раствора, согласно данным таблицы 2.1.8.23.-1, доводят 10% (об/об) раствором этилацетата P в гептане P до объема 20,0 мл.

Таблица 2.1.8.23.-1. - Подготовка калибровочных растворов

<*> Из расчета навески в 0,100 г испытуемого образца.

При высоком содержании холестерина (от 3,0 до 20,0 мг/г) используют все 5 калибровочных растворов.

При низком содержании холестерина (от 0,2 до 3,0 мг/г) используют калибровочные растворы: 0,2 мг/г, 1,0 мг/г и 3,0 мг/г.

Испытуемый раствор. 0,100 г испытуемого образца субстанции помещают в термостойкую кварцевую пробирку на 15 мл (если образец имеет неоднородную консистенцию, то перед взвешиванием его энергично встряхивают в подходящей емкости, отстаивают от 10 мин до 15 мин, удерживая емкость в вертикальном положении, для взвешивания отбирают часть из среднего слоя).

В пробирку с навеской испытуемого образца добавляют 1,0 мл рабочего раствора внутреннего стандарта. Содержимое пробирки упаривают досуха при температуре 50 °C и пропускании через раствор слабого потока азота P. Добавляют 0,5 мл 50% раствора (м/м) калия гидроксида P и 3,0 мл этанола (96%) P. Наполняют пробирку азотам P, закрывают пробкой и гомогенизируют при 100 °C в течение 1 ч. Охлаждают в течение 10 минут, добавляют 6,0 мл воды дистиллированной P и гомогенизируют, получая гомогенную смесь с омыленным веществом.

Кондиционируют колонку для твердофазной экстракции (ТФЭ) (приводят сорбент в активное состояние).

Колонка объемом 20 мл, содержит 1 г силикагеля октадецилсилильного эндкепированного для хроматографии P (частицы диаметром 55 мкм и размером пор 7 нм) и 5 мл 50% (об/об) раствора этанола (96%) P в воде дистиллированной P.

Вносят 5,0 мл гомогенной смеси в колонку ТФЭ, следя за тем, чтобы колонка была постоянно влажной. Промывают колонку 5,0 мл 50% (об/об) этанола (96%) P в воде дистиллированной P. Элюирование проводят, используя 20,0 мл 10% (об/об) раствора этилацетата P в гептане P. Полученный элюат используют в качестве испытуемого раствора.

Условия хроматографирования:

• колонка: капиллярная из термостойкого кварца длиной 15 м и внутренним диаметром 0,25 мм, покрытая фенил(5)метил(95)полисилоксаном P толщиной 0,25 мкм;
• газ-носитель: гелий для хроматографии P;
• давление: 48 кПа (соответствует скорости газа-носителя примерно 0,6 мл/мин при 200 °C и примерно 0,4 мл/мин при 330 °C);
• деление потока: 1:5;
• режим изменения температуры:

До начала испытания колонку прогревают до 340 °C не менее 30 мин при указанном давлении;

• детектор: пламенно-ионизационный;
• объем вводимой пробы: 1 мкл;
• время удержания: (5\alpha) - \text{холестана} около 7,5 мин, холестерина около 9 мин;
• калибровочная кривая: строят калибровочную кривую, отмечая по оси абсцисс (ось x) номинальную концентрацию холестерина в каждом из калибровочных растворов в миллиграммах на грамм, по оси ординат (ось y) отмечаем отношение площади пика холестерина (A1) к площади пика (5\alpha) - \text{холестана} (A2) на хроматограмме, полученной от каждого из калибровочных растворов. Рассчитывают наклон (S) и пересечение с осью ординат (ось y).

Пригодность хроматографической системы:

• разрешение: не менее 1,5, между пиками холестерина и \alpha - \text{токоферола} на хроматограмме раствора сравнения;
• коэффициент детерминации (R2) калибровочной кривой составляет не менее 0,995.

Содержание общего холестерина в испытуемом веществе (в миллиграммах на грамм) рассчитывают по формуле:

\frac{\frac{A_{1}}{A_{2}} - Y}{(m_{1} \cdot S)} \cdot 0,100 ,

где: A1 - площадь пика холестерина на хроматограмме испытуемого раствора;

A2 - площадь пика (5\alpha) - \text{холестана} на хроматограмме испытуемого раствора;

m1 - навеска субстанции в испытуемом растворе в граммах;

y - пересечение калибровочной кривой с осью ординат (ось y);

S - наклон калибровочной кривой, в граммах на миллиграмм.

201080024-2022

2.1.8.24 Определение жирнокислотного состава масел методом газовой хроматографии

Определение жирнокислотного состава масел проводят методом газовой хроматографии (2.1.2.27) после перевода жирных кислот в метиловые эфиры.

МЕТОД 1

Метод неприменим для масел, содержащих глицериды жирных кислот с эпокси-, гидроэпокси-, гидроперокси-, циклопропиловыми или циклопропениловыми группами, или для масел, в составе которых большая часть жирных кислот имеет длину цепи менее 8 атомов углерода, или для масел с кислотным числом более 2,0.

Испытуемый раствор. Перед метилированием масло подвергают сушке при наличии указаний в частной фармакопейной статье. 1,0 г масла помещают в круглодонную колбу вместимостью 25 мл со шлифом, снабженную обратным холодильником и газоотводной трубкой. В колбу прибавляют 10 мл метанола безводного P и 0,2 мл раствора 60 г/л калия гидроксида P в метаноле P, присоединяют обратный холодильник, пропускают азот P через смесь со скоростью 50 мл/мин, встряхивают и нагревают до кипения. Когда раствор станет прозрачным (обычно через 10 мин), продолжают нагревание в течение 5 мин. Затем колбу охлаждают под проточной водой и содержимое переносят в делительную воронку. Колбу промывают 5 мл гептана P, переносят промывной раствор в ту же делительную воронку и встряхивают. Прибавляют 10 мл раствора 200 г/л натрия хлорида P, энергично встряхивают и оставляют смесь до расслоения. Затем переносят органический слой в колбу с натрия сульфатом безводным P, выдерживают некоторое время и фильтруют.

Допускается применение других методик перевода жирных кислот в метиловые эфиры, при указании в частной фармакопейной статье.

Раствор сравнения (а). Готовят 0,50 г смеси веществ (калибровочную смесь), применяемых для калибровки состава, приведенных в одной из таблиц 2.1.8.24, согласно указаниям в частной фармакопейной статье. В случае, если раствор с определенным составом не указан в частной фармакопейной статье, используют состав, приведенный в таблице 2.1.8.24.-1. Смесь растворяют в гептане P и доводят тем же растворителем до объема 50,0 мл.

Таблица 2.1.8.24.-1. - Смесь веществ, применяемых для калибровки (для газовой хроматографии с капиллярной колонкой и с делением потока)

Раствор сравнения (б). 1,0 мл раствора сравнения (а) доводят гептаном P до объема 10,0 мл.

Раствор сравнения (в). Готовят 0,50 г смеси метиловых эфиров жирных кислот, соответствующих по составу смеси жирных кислот, указанной в частной фармакопейной статье на испытуемое масло. Смесь растворяют в гептане P и доводят тем же растворителем до объема 50,0 мл. Могут быть использованы коммерчески доступные смеси метиловых эфиров жирных кислот.

Условия хроматографирования:

• колонка: капиллярная, из термостойкого кварца длиной от 10 м до 30 м и внутренним диаметром от 0,2 мм до 0,8 мм, покрытая слоем макрогола 20 000 P толщиной от 0,1 мкм до 0,5 мкм или с другой подходящей неподвижной фазой;
• газ-носитель: гелий для хроматографии P или водород для хроматографии P;
• скорость газа-носителя: 1,3 мл/мин (для колонки с внутренним диаметром 0,32 мм);
• деление потока: 1:100 или менее, в зависимости от внутреннего диаметра применяемой колонки (например, в случае использования колонки с внутренним диаметром 0,32 мм деление потока должно составлять 1:50);
• детектор: пламенно-ионизационный;
• объем вводимой пробы: по 1 мкл испытуемого раствора и растворов сравнения (а), (б) и (в);

Температура:

• колонка:

в изотермических условиях (160 - 200) °C, в зависимости от длины и типа колонки (например, для колонки длиной 30 м, покрытой слоем макрогола 20 000 P, температура должна составлять 200 °C);

• в случае линейного градиента температуры, температуру колонки увеличивают от 170 °C до 230 °C со скоростью 3 °C/мин;
• блок для ввода проб: 250 °C;
• детектор: 250 °C.

Пригодность хроматографической системы

При использовании смеси калибрующих веществ, приведенных в таблице 2.1.8.24.-1 или таблице 2.1.8.24.-3:

• разрешение: не менее 1,8, между пиками соответствующими метилолеату и метилстеарату на хроматограмме раствора сравнения (а);
• отношение сигнал/шум: не менее 5, для пика метилмирастата на хроматограмме раствора сравнения (б);
• число теоретических тарелок: не менее 30 000, рассчитанных по пику метилстеарата на хроматограмме раствора сравнения (а).

При использовании смеси калибровочных веществ, приведенных в таблице 2.1.8.24.-2:

• разрешение: не менее 4,0 между пиками, соответствующими метилкаприлату и метилдеканоату, на хроматограмме раствора сравнения (а);
• отношение сигнал/шум: не менее 5 для пика метилкапроата на хроматограмме раствора сравнения (б);
• число теоретических тарелок: не менее 15 000, рассчитанных по пику метилдеканоата на хроматограмме раствора сравнения (а).

Таблица 2.1.8.24.-2. - Смесь веществ, применяемых для калибровки (для газовой хроматографии с капиллярной колонкой и с делением потока)

Таблица 2.1.8.24.-3. - Смесь веществ, применяемых для калибровки (для газовой хроматографии с капиллярной колонкой и с делением потока)

Примечание: при выполнении качественного определения с использованием калибровочных кривых в калибровочную смесь рекомендуется добавлять компонент испытуемого раствора с максимальным числом атомов углерода в цепи.

ОЦЕНКА ХРОМАТОГРАММ

Следует избегать условий хроматографирования, которые могут дать неразделенные пики (наличие компонентов с небольшим различием между временами удерживания, например, линолевая и арахиновая кислоты).

Качественное определение. Идентифицируют пики на хроматограмме раствора сравнения (в) (изотермические условия хроматографирования или линейный градиент температуры). При использовании изотермических условий хроматографирования пики могут быть также идентифицированы построением калибровочных кривых с использованием хроматограммы раствора сравнения (а) и данных таблиц 2.1.8.24.-1, 2.1.8.24.-2 или 2.1.8.24.-3.

На хроматограмме раствора сравнения (а) измеряют приведенное время удерживания (t'_{R}) каждого пика. Приведенное время удерживания t'_{R} представляет собой разность между временем удерживания пика вещества и временем удерживания несорбирующегося (в условиях определения) вещества.

Строят график линейной зависимости:

lg(t'_{R}) = f ,

где f - эквивалент числа атомов углерода в цепи.

Логарифмы t'_{R} ненасыщенных жирных кислот расположены на этой линии в точках, соответствующих нецелым значениям "эквивалента числа атомов углерода в цепи". Эквивалент числа атомов углерода в цепи представляет собой длину теоретической цепи насыщенной жирной кислоты, которая должна была иметь такое же значение t'_{R} , что и идентифицируемая жирная кислота. Например, у линолевой кислоты такое же t'_{R} , как и у теоретической насыщенной жирной кислоты, имеющей 18,8 атомов углерода.

Идентификацию пиков на хроматограмме испытуемого раствора проводят по прямой линии и приведенным временам удерживания. Значения эквивалентных длин цепи приведены в таблице 2.1.8.24.-4.

Таблица 2.4.8.24.-4. - Значения эквивалентных длин цепи

Примечание: значения, вычисленные с использованием калибровочных кривых, приведены в качестве примера для колонки с макроголом 20 000.

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ

Используют метод внутренней нормализации; при этом сумму площадей всех пиков на хроматограмме, кроме пиков, относящихся к растворителю, принимают за 100%. Содержание каждого компонента вычисляют как отношение площади соответствующего пика к сумме площадей всех пиков. Пики, площадь которых составляет менее 0,05% от суммы площадей всех пиков, не учитывают.

В определенных случаях, например, при наличии жирных кислот с 12 или менее атомами углерода, в частной фармакопейной статье должен быть указаны соответствующие поправочные коэффициенты для преобразования площадей пиков в проценты (м/м).

МЕТОД 2

Метод неприменим для масел, содержащих глицериды жирных кислот с эпокси-, гидроэпокси-, гидроперокси-, циклопропиловыми и циклопропениловыми группами или для масел с кислотным числом более 2,0.

Испытуемый раствор. 0,100 г испытуемого масла помещают в центрифужную пробирку вместимостью 10 мл с завинчивающейся крышкой, прибавляют 1 мл гептана P и 1 мл диметилкарбоната P и энергично встряхивают при умеренном нагревании (50 - 60) °C. К неостывшему раствору прибавляют 1 мл раствора 12 г/л натрия P в метаноле безводном P и энергично перемешивают в течение 5 мин. Затем прибавляют 3 мл воды дистиллированной P и энергично перемешивают в течение 30 с. Смесь центрифугируют в течение 15 мин со скоростью 1500 об/мин. Хроматографируют 1 мкл органического слоя.

Растворы сравнения и оценка хроматограмм. При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье, поступают в соответствии с указаниями, приведенными в методе 1.

Условия хроматографирования:

• колонка из термостойкого кварца длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм, покрытая слоем макрогола 20 000 P толщиной 0,25 мкм;
• газ-носитель: гелий для хроматографии P;
• скорость газа-носителя: 0,9 мл/мин;
• деление потока: 1:100;
• режим изменения температуры:

• детектор: пламенно-ионизационный.
• объем вводимой пробы: 1 мкл.

МЕТОД 3

Метод неприменим для масел, содержащих глицериды жирных кислот с эпокси-, гидроэпокси-, гидроперокси-, альдегидными, кетоновыми, циклопропиловыми и циклопропениловыми группами и сопряженными полиненасыщенными и ацетиленовыми компонентами из-за частичного или полного разрушения этих групп.

Испытуемый раствор. 0,1 г испытуемого масла помещают в коническую колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 2 мл раствора 20 г/л натрия гидроксида P в метаноле безводном P и кипятят с обратным холодильником в течение 30 мин. Затем через холодильник прибавляют 2,0 мл раствора бора трифторида в метаноле P и кипятят в течение 30 мин, после чего прибавляют через холодильник 4,0 мл гептана P и кипятят в течение 5 мин. Смесь охлаждают, прибавляют 10,0 мл натрия хлорида насыщенного раствора P, встряхивают в течение 15 с и прибавляют такой объем натрия хлорида насыщенного раствора P, чтобы верхний слой поднялся к горлу колбы. Отбирают 2,0 мл верхнего слоя, помещают в делительную воронку, промывают тремя порциями воды P, по 2 мл каждая, и высушивают над натрия сульфатом безводным P.

Растворы сравнения и оценка хроматограмм. При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье, следуют указаниям, приведенным в методе 1.

201080025-2022

2.1.8.25 Полиненасыщенные жирные кислоты в маслах, содержащих омега-3 кислоты

Испытание может быть использовано для количественного определения эйкозапентаеновой кислоты (ЭПК), докозагексаеновой кислоты (ДГК) и общего содержания омега-3-полиненасыщенных жирных кислот в лекарственных средствах с различной концентрацией омега-3 кислот в форме триглицеридов и сложных эфиров. В форме триглицеридов омега-3 кислоты содержатся в продуктах из рыбьего жира, жира печени рыб, маслах водорослей и концентратах омега-3 кислот. Результаты испытания выражают как содержание триглицеридов или этиловых эфиров.

Для количественного определения омега-3-полиненасыщенных жирных кислот применяют метод газовой хроматографии с пламенно-ионизационной детекцией (2.1.2.27).

Испытания необходимо выполнять как можно быстрее, не допуская воздействия актиничного света, окислителей, катализаторов окисления (например, меди и железа) и воздуха.

Испытание проводят с этиловыми эфирами (all-Z)-эйкоза-5,8,11,14,17-пентаеновой кислоты (ЭПК; C20:5 n-3) и (all-Z)-докоза-4,7,10,13,16,19-гексаеновой кислоты (ДГК; C22:6 n-3) или метиловыми эфирами (после дериватизации триглицеридов - стадия 2) в испытуемых образцах.

Внутренний стандарт: метилтрикозаноат P.

Все испытуемые растворы готовят в двух повторностях.

СТАДИЯ 1.

Испытуемый раствор (а). Навеску испытуемого образца в соответствии с таблицей 2.1.8.25.-1 и 70,0 мг внутреннего стандарта растворяют в растворе 50 мг/л бутилгидрокситолуола P в триметилпентане P и доводят объем тем же раствором до 10,0 мл. Для растворения внутреннего стандарта допускается слабое нагревание до 60 °C. Полученный испытуемый раствор (а) используют для проведения испытаний на этиловые эфиры. Для определения триглицеридов испытание продолжить согласно стадии 2.

Таблица 2.1.8.25.-1.

Испытуемый раствор (б). Навеску испытуемого образца в соответствии с таблицей 2.1.8.25.-1 растворяют в растворе 50 мг/мл бутилгидрокситолуола P в триметилпентане P и доводят объем тем же раствором до 10,0 мл. Полученный раствор (б) используют для проведения испытаний на этиловые эфиры. Для определения триглицеридов испытание продолжить согласно стадии 2.

СТАДИЯ 2.

Затем в отдельные кварцевые пробирки вводят по 2,0 мл испытуемых растворов (а) и (б), полученных на этапе 1. Для испарения растворителя через растворы пропускают слабый поток азота P. Добавляют 1,5 мл натрия гидроксида раствор P (20 г/л) в метаноле P, создают над раствором прослойку азота P, плотно закрывают пробкой ламинированною политетрафторэтиленом, тщательно перемешивают и нагревают на водяной бане в течение 7 мин. Оставляют для охлаждения.

В остывшие пробирки добавляют 2 мл раствора бора трихлорида в метаноле P, вновь создают прослойку азота P, плотно закрывают пробкой, тщательно перемешивают и нагревают на водяной бане в течение 30 мин. Охлаждают до 40 - 50 °C. Добавляют 1 мл триметилпентана P, покрывают слоем азота P, закрывают пробкой и энергично перемешивают не менее 30 с. Немедленно добавляют 5 мл натрия хлорида насыщенный раствор P, покрывают азотом P, закрывают пробкой и тщательно перемешивают не менее 15 с. Переносят количественно верхний слой в отдельную пробирку. В оставшийся раствор добавляют 1 мл триметилпентана P, перемешивают и повторяют перенос. Объединенные экстракты триметилпентана промывают двумя порциями воды P по 1 мл и высушивают над натрия сульфат безводный P. Для высушивания на дно эксикатора помещают натрия сульфат безводный P, сверху устанавливают решетку, на которой размещают открытые пробирки, плотно закрывают эксикатор и выдерживают до появления сухого остатка.

Растворы сравнения: растворы сравнения (а1) и (а2) готовят в двух повторностях; раствор сравнения (в) готовят только для триглицеридов в том случае, если на хроматограмме испытуемого раствора (а) явно не обнаруживается пик метилового эфира тетракоз-15-еновой кислоты.

• раствор сравнения (аф Растворяют 70,0 мг внутреннего стандарта и 90,0 мг СО ФЕАЭС этилового эфира эйкозапентаеновой кислоты в растворе 50 мг/л бутилгидрокситолуола P в триметилпентане P и доводят объем тем же раствором до 10,0 мл. Для растворения внутреннего стандарта допускается слабое нагревание до 60 °C.
• раствор сравнения (а2). 60,0 мг СО ФЕАЭС этилового эфира докозагексаеновой кислоты и 70,0 мг внутреннего стандарта растворяют в растворе 50 мг/л бутилгидрокситолуола P в триметилпентане P и доводят объем тем же раствором до 10,0 мл. Для растворения внутреннего стандарта допускается слабое нагревание до 60 °C. Для определения этиловых эфиров растворы сравнения (а1) и (а2) готовы. Для определения триглицеридов, продолжить стадию 2 таким же образом, как для испытуемых образцов (а) и (б).
• раствор сравнения (б). 0,300 г метиларахидата P, 0,300 г метилбегената P, 0,300 г метилпальмитата P и 0,300 г метилстерата P растворяют в растворе 50 мг/л бутилгидрокситолуола P в триметилпентане P и доводят объем тем же раствором до 10,0 мл;
• раствор сравнения (в). Навеску, содержащую 55,0 мг метилового эфира докозагексаеновой кислоты P и 5,0 мг метилового эфира тетракоз-15-еновой кислоты P растворяют в растворе 50 мг/л бутилгидрокситолуола P в триметилпентане P и доводят объем тем же раствором до 10,0 мл.

Условия хроматографирования:

• колонка: капиллярная, из термостойкого кварца длиной не менее 25 м и внутренним диаметром 0,25 мм покрытая макроголом 20 000 P толщиной 0,2 мкм;
• газ-носитель: водород для хроматографии P или гелий для хроматографии P;
• скорость газа-носителя: 1 мл/мин;
• детектор: пламенно-ионизационный;
• объем вводимой пробы: 1 мл;
• деление потока: 1:200, в качестве альтернативы - введение без деления потоков с контролем температуры (в этом случае необходимо перед введением испытуемые растворы развести 1/200 раствором 50 мг/л бутилгидрокситолуола P в триметилпентане P).

При необходимости корректируют скорость потока и (или) разведение образца таким образом, чтобы достигнуть коэффициента симметрии 0,8 - 1,5 для пиков метиловых или этиловых эфиров эйкозапентаеновой кислоты и докозагексаеновой кислоты, при этом на хроматограмме испытуемого раствора (б) должны отчетливо обнаруживаться пики, относящиеся к соответствующим эфирам (линоленовой кислоты (C18:3 n-3), стеаридоновой кислоты (C18:4 n-3), эйкозатетраеновой кислоты (C20:4 n-3), геникозапентаеновой кислоты (C21:5 n-3) и докозапентаеновой кислоты (C22:5 n-3)). В случае невыполнения требований, приоритет имеют четкие обнаружения соответствующих сложных эфиров, представленных выше для испытуемого раствора (б).

При необходимости, для получения коэффициента симметрии 0,8 - 1,5 для пиков, обусловленных компонентами раствора сравнения (б), корректируют скорость потока и (или) разбавление образца.

• режим изменения температуры:

<*> 90 °C при введении непосредственно в начало колонки.

Пригодность хроматографической системы:

• на хроматограмме раствора сравнения (б) площади пиков компонентов метилпальмитата, метилстеарата, метиларахидата и метилбегената изменяются в соответствии с коэффициентами чувствительности, представленными в таблице 2.1.8.25.-2 (площадь пика умножается на коэффициент чувствительности); после применения метода нормализации, откорректированные площади пиков метиловых эфиров жирных кислот принимают за 100 процентов; нормализированное процентное содержание площади каждого метилового эфира жирной кислоты должны быть в пределах (+/- 1) процента от соответствующего массового процента;

Таблица 2.1.8.25.-2.

• разрешение:
• этиловые эфиры: не менее 1,2 между пиками метилтрикозаноата и этилового эфира геникозапентаеновой кислоты на хроматограмме раствора сравнения (а);
• триглицериды: не менее 1,2 между пиками метилового эфира докозагексаеновой кислоты и метилового эфира тетракоз-15-еновой кислоты на хроматограмме испытуемого раствора (а) или раствора сравнения (в);
• на хроматограмме, полученной с помощью испытуемого раствора (а), пики метилтрикозаноата и метилового эфира геникозапентаеновой кислоты при сравнении с хроматограммой, полученной с помощью испытуемого раствора (б) должны быть полностью разделены.

Содержание эйкозапентаеновой кислоты и докозагексаеновой кислоты в процентах с учетом их содержания в стандартных образцах рассчитывают по формуле:

(\frac{A_{x} \cdot m_{1}}{A_{1} \cdot m_{2}}) \cdot R_{f} \cdot K \cdot 100 ,

где: Rf - коэффициент чувствительности для эйкозапентаеновой кислоты и докозагексаеновой кислоты, рассчитанный по формуле:

\frac{A_{x,3} \cdot m_{x,r}}{A_{x,r} \cdot m_{x,3}} ,

где: m1 - масса внутреннего стандарта в испытуемом растворе (а) в миллиграммах;

m2 - масса испытуемого образца в испытуемом растворе (а) в миллиграммах;

mx,3 - масса внутреннего стандарта в растворе сравнения (а) (для определения эйкозапентаеновой кислоты) или в растворе сравнения (а2) (для определения докозагексаеновой кислоты), в миллиграммах;

mx,r - масса СО ФЕАЭС этилового эфира эйкозапентаеновой кислоты в растворе сравнения (а1) или СО ФЕАЭС этилового эфира докозагексаеновой кислоты в растворе сравнения (а2), в миллиграммах;

Ax - площадь пика этилового эфира эйкозапентаеновой кислоты или этилового эфира докозагексаеновой кислоты на хроматограмме испытуемого раствора (а);

Ax,r - площадь пика этилового эфира эйкозапентаеновой кислоты на хроматограмме раствора сравнения (а1) или этилового эфира докозагексаеновой кислоты на хроматограмме раствора сравнения (а2);

A1 - площадь пика внутреннего стандарта на хроматограмме испытуемого раствора (а);

Ax,3 - площадь пика внутреннего стандарта на хроматограммах раствора сравнения (а1) (для определения эйкозапентаеновой кислоты) или раствора сравнения (а2) (для определения докозагексаеновой кислоты);

К - коэффициент пересчета между этиловыми эфирами и триглицеридами:

Этиловые эфиры К - 1,00;

Триглицериды К - 0,954 для эйкозапентаеновой кислоты;

К - 0,957 для докозагексаеновой кислоты.

ОБЩЕЕ СОДЕРЖАНИЕ ОМЕГА-3-КИСЛОТ

На основании полученных результатов количественного определения эйкозапентаеновой кислоты и докозагексаеновой кислоты рассчитывают общее содержание омега-3-кислот в процентах по формуле:

\text{ЭПК } + \text{ДГК } + \frac{A_{n - 3}(\text{ЭПК } + \text{ДГК})}{A_{\text{эпк}} + A_{\text{дгк}}} ,

где: ЭПК - содержание эйкозапентаеновой кислоты, в процентах;

ДГК - содержание докозагексаеновой кислоты, в процентах;

An_3 - сумма площадей пиков, соответствующих эфирам линоленовой кислоты (C18:3 n-3), стеаридоновой кислоты (C18:4 n-3), эйкозатетраеновой кислоты (C20:4 n-3), геникозапентаеновой кислоты (C21:5 n-3) и докозапентаеновой кислоты (C22:5 n-3) на хроматограмме испытуемого раствора (б);

AЭПК - площадь пика этилового эфира ЭПК на хроматограмме испытуемого раствора (б);

AДГК - площадь пика этилового эфира ДГК на хроматограмме испытуемого раствора (б).

201080026-2022

2.1.8.26 Определение стеринов в жирных маслах

При отсутствии в частной фармакопейной статье ссылки на метод определения применяют метод 1. Любое изменение от метода 1 к методу 2 должно быть валидировано.

МЕТОД 1

Отделение стериновой фракции (ТСХ)

Получают неомыляемые вещества жирного масла и затем отделяют стериновую фракцию методом тонкослойной хроматографии (2.1.2.26), используя ТСХ пластинку со слоем силикагеля P толщиной от 0,2 мм до 0,5 мм.

Испытуемый раствор (а). В колбу вместимостью 150 мл, снабженную обратным холодильником, помещают объем 2 г/л раствора бетулина P в метиленхлориде P, соответствующего около 10% бетулина от содержания стерина в образце, взятом для определения (например, в случае оливкового масла прибавляют 500 мкл, в случае других растительных масел - 1500 мкл раствора бетулина). При наличии в частной фармакопейной статье указания на определение процентного содержания стеринов в стериновой фракции, то раствор бетулина допускается не прибавлять. Упаривают досуха в токе азота P, прибавляют 5,00 г (m) испытуемого образца, добавляют 50 мл 2 M калия гидроксида спиртового раствора P и нагревают на водяной бане в течение 1 ч, часто перемешивая содержимое колбы круговыми движениями. Охлаждают до температуры ниже 25 °C и с помощью 100 мл воды P количественно переносят содержимое колбы в делительную воронку. Осторожно встряхивают с тремя порциями эфира, свободного от пероксидов, P по 100 мл. Объединенные эфирные слои помещают в другую делительную воронку, содержащую 40 мл воды P, осторожно встряхивают в течение нескольких минут, выдерживают до расслоения и отбрасывают водный слой. Эфирный слой промывают несколькими порциями воды P по 40 мл до тех пор, пока водный слой не перестанет давать щелочную реакцию по фенолфталеину. Эфирный слой переносят в предварительно взвешенную колбу, промывая делительную воронку эфиром, свободным от пероксидов, P. Эфир отгоняют с необходимыми предосторожностями и прибавляют к остатку 6 мл ацетона P. Осторожно удаляют растворитель в токе азота P, остаток сушат до постоянной массы при температуре от 100 °C до 105 °C, охлаждают в эксикаторе и взвешивают. Остаток переносят в небольшую пробирку с помощью метиленхлорида P. Упаривают в токе азота до объема около 1 мл. В зависимости от неомыляемого содержимого масла концентрацию раствора доводят до (25 - 50) мг/мл.

Испытуемый раствор (б). 5,00 г рапсового масла P обрабатывают в соответствии с указаниями для испытуемого образца, начиная со слов "добавляют 50 мл 2 M калия гидроксида раствора спиртового P".

Испытуемый раствор (в). 5,00 г подсолнечного масла P обрабатывают в соответствии с указаниями для испытуемого образца, начиная со слов "добавляют 50 мл 2 M калия гидроксида раствора спиртового P".

Раствор сравнения. 25 мг холестерина P и 10 мг бетулина P растворяют в 1 мл метиленхлорида P.

Для каждого испытуемого образца используют отдельную пластинку.

Условия хроматографирования:

• ТСХ пластинка со слоем силикагеля G P;
• подвижная фаза: эфир P - гексан P (35:65, об/об);
• объем наносимый пробы: 10 мкл раствора сравнения (на расстоянии 20 мм от основания и 10 мм от левого края в виде полоски размером 10 мм);
• по 0,5 мл испытуемых растворов (а), (б), или (в) (на расстоянии 20 мм от основания в виде полоски размером 150 мм);
• пробег фронта подвижной фазы: 17 см от линии старта;
• высушивание: в токе азота P;
• детектирование: в ультрафиолетовом свете при длине волны 254 нм после опрыскивания раствором 2 г/л дихлорфлуоресцеина P в этаноле безводном P.

На хроматограмме раствора сравнения обнаруживаются полосы, соответствующие холестерину и бетулину. На хроматограммах испытуемых образцов обнаруживаются полосы со значениями RF, соответствующим стеринам.

С хроматограммы каждого испытуемого раствора снимают слой силикагеля с полосами стеринов, а также дополнительно силикагель на (2 - 3) мм выше и ниже видимых зон, соответствующих раствору сравнения, и помещают раздельно в три колбы вместимостью по 50 мл. В каждую колбу прибавляют по 15 мл метиленхлорида P и нагревают в течение 15 мин с обратным холодильником при перемешивании. Каждый раствор пропускают через стеклянный фильтр (40) (2.1.1.2) или подходящую фильтровальную бумагу и промывают каждый фильтр тремя порциями метиленхлорида P по 15 мл. Каждый из трех объединенных фильтратов и смывов помещают в три колбы, упаривают в токе азота P до объема от 5 мл до 10 мл. Переносят содержимое каждой колбы в небольшие пробирки и упаривают в токе азота P досуха.

Требование:

• на хроматограмме раствора сравнения обнаруживаются полосы, соответствующие холестерину и бетулину;
• на хроматограммах испытуемых растворов обнаруживаются полосы со значениями RF, соответствующим стеринам.

Определение стеринов (ГХ)

Определение проводят методом газовой хроматографии (2.1.2.27). Все операции проводят, защищая от влаги; растворы готовят непосредственно перед применением.

Испытуемый раствор. К стеринам, выделенным из испытуемого образца методом тонкослойной хроматографии, прибавляют свежеприготовленную смесь 0,04 мл хлортриметилсилана P, 0,1 мл гексаметилдисилазана P и 0,5 мл пиридина безводного P и выдерживают не менее 5 мин; используют жидкую фазу.

Раствор сравнения (а). К 9 частям стеринов, выделенных из рапсового масла P методом тонкослойной хроматографии, прибавляют 1 часть холестерина P. К полученной смеси добавляют свежеприготовленную смесь 0,04 мл хлортриметилсилана P, 0,1 мл гексаметилдисилазана P и 0,5 мл пиридина безводного P и выдерживают не менее 5 мин; используют жидкую фазу.

Раствор сравнения (б). К стеринам, выделенным из подсолнечного масла P методом тонкослойной хроматографии, прибавляют свежеприготовленную смесь 0,04 мл хлортриметилсилана P, 0,1 мл гексаметилдисилазана P и 0,5 мл пиридина безводного P и выдерживают не менее 5 мин; используют жидкую фазу.

Условия хроматографирования:

• колонка: из термостойкого кварца капиллярная, длиной от 10 м до 30 м и внутренним диаметром от 0,25 мм до 0,32 мм, заполненная поли[метил(95)фенил(5)]силоксаном P или поли(цианопропил)(7)(фенил)(7)(метил)(86)силоксаном P толщиной 0,25 мкм;
• газ-носитель: водород для хроматографии P или гелий для хроматографии P;
• линейная скорость газа-носителя: (30 - 50) см/с (водород) или (20 - 35) см/с (гелий);
• деление потока: 1:50 (водород) или 1:100 (гелий);
• температура колонки: 260 °C;
• температура блока для ввода проб: 280 °C;
• температура детектора: 290 °C;
• детектор: пламенно-ионизационный;
• объем вводимой пробы: по 1 мкл испытуемого раствора, растворов сравнения (а) и (б).

Идентификация пиков: на хроматограмме раствора сравнения (а) обнаруживаются четыре основных пика, соответствующие холестерину, брассикастерину, кампестерину и \beta - \text{ситостерину} ; на хроматограмме раствора сравнения (б) обнаруживаются 4 основных пика, соответствующие кампестерину, стигмастерину, \beta - \text{ситостерину} и \Delta 7 - \text{стигмастенолу} . Относительные времена удерживания пиков стеринов по отношению к пику \beta - \text{ситостерина} приведены в таблице 2.1.8.26.-1.

Таблица 2.1.8.26.-1. - Относительные времена удерживания пиков стеринов по отношению к пику \beta - \text{ситостерина} для двух различных колонок

<*> В литературе данный стерин может быть также называться \Delta 7 - \text{стигмастерином} .

Пик внутреннего стандарта (бетулин) должен быть четко отделен от пиков определяемых стеринов.

Идентифицируют пики, обнаруженные на хроматограмме испытуемого раствора.

Содержание каждого стерина в стериновой фракции испытуемого раствора рассчитывают в процентах по формуле:

\frac{S_{i}}{\Sigma S_{i}} \cdot 100 ,

где: Si - площадь пика стерина на хроматограмме испытуемого раствора;

\Sigma S_{i} - сумма площадей всех пиков стеринов, указанных в таблице 2.1.8.26.-1, кроме пика бетулина.

При наличии указаний в частной фармакопейной статье содержание каждого стерина в стериновой фракции испытуемого образца в процентах рассчитывают по формуле:

\frac{S \cdot m_{S} \cdot 100}{S_{0} \cdot m} ,

где S - площадь пика определяемого стерина на хроматограмме испытуемого раствора;

S0 - площадь пика бетулина на хроматограмме раствора сравнения;

m - масса навески испытуемого образца в граммах;

mS - масса навески добавленного бетулина P в миллиграммах.

МЕТОД 2

Приготовление неомыляемых веществ

Неомыляемые вещества готовят методом, описанным в испытании на неомыляемые вещества в частной фармакопейной статье на субстанцию. При отсутствии данного метода, неомыляемые вещества готовят методом, представленным в общей фармакопейной статье 2.1.5.7. Неомыляемые вещества. После стадии нейтрализации этанол (96%) P упаривают, затем прибавляют 6 мл ацетона P и упаривают растворитель. Остаток сушат при температуре от 100 °C до 105 °C. Не требуется высушивание его до постоянной массы.

Параллельно в таких же условиях готовят неомыляемые вещества подсолнечного масла P, используемые, в частности, для идентификации стериновой фракции, которую следует собрать.

Отделение стериновой фракции (ЖХ)

Отделение стериновой фракции проводят методом жидкостной хроматографии. (2.1.2.28).

Испытуемый раствор. Высушенный остаток неомыляемых веществ переносят тремя порциями по 4 мл растворителя, используемого при получении неомыляемых веществ (обычно эфир P или петролейный эфир P), в пробирку вместимостью 15 мл, упаривают досуха в токе азота P. Остаток растворяют в объеме подвижной фазы, достаточном для получения концентрации около 40 мг/мл, прибавляют несколько капель 2-пропанола P1 для улучшения растворимости (обычно достаточно трех капель для обеспечения полного растворения). Полученный раствор пропускают через мембранный фильтр с размером пор 0,45 мкм.

Раствор сравнения. Готовят из неомыляемых веществ, полученных из подсолнечного масла P в соответствии с указаниями для испытуемого раствора.

Условия хроматографирования:

• предколонка: из нержавеющей стали длиной 0.005 м и внутренним диаметром 4,6 мм, покрытая слоем силикагеля для хроматографии P сферическим размером частиц 5 мкм и размером пор 6 нм;
• колонка: из нержавеющей стали длиной 0.25 м и внутренним диаметром 4,6 мм, покрытая слоем силикагеля для хроматографии P сферическим с размером частиц 5 мкм и размером пор 6 нм;
• подвижная фаза: 2-пропанол P1 - гексан P (1:99, об/об);
• скорость подвижной фазы: 1,0 мл/мин;
• детектор: ультрафиолетовой, длина волны 210 нм;
• объем вводимой пробы: по 50 мкл испытуемого раствора и раствора сравнения.

Идентификация пиков стеринов (раствор сравнения): обнаруживаются два основных пика, элюирующимися примерно между 23 мин и 32 мин. Пики фракции стеринов элюируются в конце хроматограммы.

Фракцию собирают на выходе детектора в пробирку с винтовой крышкой вместимостью 15 мл. Растворитель упаривают в токе азота P.

Определение стеринов (ГХ)

Определение стеринов проводят методом газовой хроматографии (2.1.2.27)

Испытуемый раствор. Растворяют фракцию стеринов, выделенную из испытуемого раствора методом тонкослойной хроматографии на предыдущем этапе, в смеси 0,2 мл пиридина безводного P и 0,2 мл смеси хлортриметисилан P - N,O-бис(триметилсилил)трифторацетамид P (1:99, об/об), пробирку плотно закрывают пробкой и нагревают при температуре 80 °C в течение 20 мин. Затем охлаждают и используют жидкую фазу.

Раствор сравнения. Растворяют фракцию стеринов, выделенную из раствора сравнения методом тонкослойной хроматографии на предыдущем этапе, в смеси 0,2 мл пиридина безводного P и 0,2 мл смеси хлортриметисилана P - N,O-бис(триметилсилил)трифторацетамида P (1:99, об/об), пробирку плотно закрывают пробкой и нагревают при температуре 80 °C в течение 20 мин. Затем охлаждают и используют жидкую фазу.

Также может быть использован СО ФЕАЭС холестерина отдельно или в смеси со стериновой фракцией подсолнечного масла. Дериватизацию проводят в соответствии с указаниями для испытуемого раствора.

Условия хроматографирования:

• колонка: капиллярная колонка из термостойкого кварца, длиной 30 м и внутренним диаметром 0,25 мм, покрытая слоем поли[метил(95)фенил(5)]силоксаном P толщиной 0,25 мкм;
• газ-носитель: гелий для хроматографии P;
• скорость газа-носителя: 2,6 мл/мин;
• деление потока: 1:25;
• объем вводимой пробы: 1 - 3 мкл (в зависимости от ожидаемого количества стеринов в испытуемом растворе);
• режим изменения температуры:

Идентификация пиков (раствор сравнения): пики кампестерина, стигмастерина, \beta - \text{ситостерина} и \Delta 7 - \text{стигмастенола} , стеринов и относительные удерживания пиков по отношению к пику \beta - \text{ситостерину} , которые приведены в таблице 2.1.8.26.-1.

Пригодность системы (раствор сравнения):

• разрешение: не более 4,0 между пиками кампестерина и стигмастерина.

Содержание каждого стерина в стериновой фракции испытуемого образца в процентах рассчитывают по формуле:

\frac{S_{i}}{\Sigma S_{i}} \cdot 100 ,

где: Si - площадь пика определяемого стерина на хроматограмме испытуемого образца;

\Sigma S_{i} - сумма площадей всех пиков стеринов, указанных в таблице 2.1.8.26.-1, кроме пика бетулина.

2.1.9 ФАРМАЦЕВТИКО-ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ ИСПЫТАНИЯ

201090018-2022

2.1.9.18 Определение выхода содержимого упаковки для недозированных аэрозолей, пен и спреев

Данное испытание предназначено для недозированных лекарственных форм, представляющих собой аэрозоли, пены или спреи, с целью определения процента выхода содержимого упаковки при их применении.

При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству испытание проводят не менее чем на трех образцах, отобранных в соответствии с общей фармакопейной статьей 2.1.7.1. Отбор проб.

Методика. Определяют массу каждой из трех упаковок, взвешенных вместе с распылителем или насадкой с точностью до 0,01 г (m1). Нажатием на распылитель или насадку из упаковки удаляют все содержимое и снова взвешивают пустую упаковку вместе с распылителем или насадкой с точностью до 0,01 г (m2).

Выход содержимого упаковки (X) в процентах вычисляют по формуле:

X = \frac{m_{1} - m_{2}}{m_{3}} \cdot 100 ,

где: m1 - масса упаковки с распылителем или насадкой, г;

m2 - масса пустой упаковки с распылителем или насадкой, г;

m3 - масса содержимого лекарственного препарата, указанная на этикетке, г (или полученная путем умножения номинального объема на плотность лекарственного препарата).

При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству лекарственный препарат считают выдержавшим испытание, если выход содержимого (X) каждой из трех упаковок составляет не менее 90% от массы содержимого лекарственного препарата, указанной на этикетке.

201090019-2022

2.1.9.19 Определение герметичности упаковки

Настоящая общая фармакопейная статья устанавливает общие требования к определению герметичности упаковки лекарственных средств.

Требования настоящей общей фармакопейной статьи не распространяются на определение герметичности упаковки без лекарственного средства, то есть упаковки без содержимого.

Под герметичностью упаковки, предназначенной для лекарственных средств, понимают ее способность совместно с укупорочными средствами и другими элементами системы упаковки препятствовать проникновению в содержимое упаковки и выходу из упаковки газов, паров и (или) жидкостей, при обычных условиях хранения, транспортирования и реализации.

Испытание на герметичность упаковки позволяет определить наличие разрыва, неплотного прилегания элементов упаковки. Утечка - это непреднамеренное проникновение или выход вещества (твердого, жидкого или газообразного) через отверстие в упаковке или через зазор между элементами упаковки в отличие от понятия "проницаемость упаковки", которое подразумевает прохождение газа, жидкости через непористую стенку упаковки или в упаковку, когда небольшая часть молекул способна пройти через барьер.

Определение герметичности упаковки лекарственных средств может быть проведено:

• при технологическом процессе производства лекарственных средств после заполнения и укупоривания;
• в ходе испытания готового лекарственного препарата и подтверждения его соответствия требованиям частной фармакопейной статьи и (или) нормативного документа по качеству.

Выбор метода испытания герметичности упаковки лекарственных средств, а также применяемые критерии приемлемости при оценке герметичности, зависят от типа, вида и других характеристик первичной упаковки, от лекарственной формы лекарственного препарата, для которого предназначена упаковка, и других факторов.

Определение герметичности проводят с использованием валидированных методов, соответствующего оборудования, позволяющих оценивать герметичность упаковки, в том числе в автоматическом режиме.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕРМЕТИЧНОСТИ УПАКОВКИ МЕТОДОМ ВНУТРЕННЕГО ДАВЛЕНИЯ (ВАКУУМИРОВАНИЯ)

Метод применяют для определения герметичности упаковки лекарственных препаратов, как правило, представляющих собой жидкие лекарственные формы в запаянных ампулах, в герметично закрытых флаконах, бутылках, банках, при технологическом процессе производства лекарственных средств после заполнения и укупоривания или запаивания упаковки.

Метод основан на создании избыточного давления внутри испытуемого образца герметично закрытой или герметично запаянной упаковки и последующему определению герметичности упаковки визуальным контролем или с помощью соответствующего оборудования.

Определение герметичности ампул (определение качества запайки ампул). Лекарственные препараты в запаянных ампулах размещают в кассетах капиллярами ампул вниз, кассеты помещают в вакуумную камеру, эксикатор или соответствующую емкость используемого оборудования. В вакуумной камере создают необходимое разрежение, откачивая воздух, при этом внутри ампул создается избыточное давление. Если происходит частичное или полное истечение жидкости из ампул, упаковка ампул считается негерметичной.

Определение герметичности флаконов, бутылок, банок. Испытуемые образцы, представляющие собой герметично укупоренные упаковки с лекарственными препаратами в виде жидких лекарственных форм, помещают в вакуумную камеру, эксикатор или соответствующую емкость используемого оборудования горлышком вниз. С помощью вакуумного насоса достигают заданного разрежения в вакуумной камере, после чего останавливают вакуумный насос и сбрасывают вакуум до атмосферного давления.

Испытуемые образцы достают из вакуумной камеры и оценивают визуально и (или) с помощью впитывающей салфетки. При обнаружении в месте укупорки протечки, выявляемой по наличию капель и (или) следов лекарственного средства на салфетке, такие образцы упаковки, представляющие собой флаконы, бутылки или банки, считаются негерметичными.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕРМЕТИЧНОСТИ УПАКОВКИ С ПОМОЩЬЮ ИНДИКАТОРНОГО (КРАСЯЩЕГО) РАСТВОРА

В данном методе герметичность упаковки определяют по отсутствию красителя внутри упаковки, подвергшейся действию избыточного, по сравнению с атмосферным, давления или действию вакуума.

Определение герметичности ампул и флаконов, герметизированных после заполнения их при атмосферном давлении. Лекарственные препараты в ампулах и (или) флаконах помещают в кассеты, которые погружают в емкость, заполненную водой, подкрашенной любым водорастворимым красителем, например, заполненную 0,0005% (м/об) раствором метиленового синего P. Кассеты погружают таким образом, чтобы ампулы и (или) флаконы полностью находились в воде. Емкость герметично закрывают и создают в ней избыточное, по сравнению с атмосферным, давление (100 +/- 20) кПа, которое выдерживают в течение 20 - 25 мин, после чего устанавливают в емкости давление, равное атмосферному. После снятия давления кассету с ампулами и (или) флаконами вынимают и просматривают на наличие красителя, прошедшего через дефекты упаковки внутрь ампул и (или) флаконов. Ампулы и (или) флаконы, содержащие краситель, считаются негерметичными.

Определение герметичности упаковок безъячейковых (стрипов), упаковок ячейковых (блистеров), пакетов, пакетиков (саше). Образцы лекарственных препаратов в герметично укупоренных упаковках, представляющих собой упаковки безъячейковые (стрипы), упаковки ячейковые (блистеры), пакеты или пакетики (саше) погружают в эксикатор (или соответствующую емкость используемого оборудования), заполненный водой, подкрашенной любым водорастворимым красителем, например, заполненный 0,0005% (м/об) раствором метиленового синего P. Упаковки должны быть полностью погружены в воду, при необходимости их накрывают сверху удерживающей пластиной с отверстиями. В испытательной камере (эксикаторе) создают давление 40 - 60 кПа, после чего останавливают вакуумный насос и сбрасывают давление до атмосферного. Выдерживают при атмосферном давлении в течение 30 мин.

Образцы достают из эксикатора, обмывают водой и оценивают визуально. При обнаружении красителя внутри образца, упаковка считается негерметичной.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕРМЕТИЧНОСТИ УПАКОВКИ МЕТОДОМ СВЕЧЕНИЯ

Метод основан на способности газовой среды упаковки лекарственных средств светиться под действием высокочастотного электрического тока при большом напряжении. В зависимости от величины давления газовой среды упаковки (уровня вакуума) цвет свечения будет различным.

Применяют для лекарственных препаратов в ампулах и флаконах, герметизированных и соответственно укупоренных при пониженном давлении ("под вакуумом"). Определение герметичности упаковки в этом случае заключается в проверке ее способности сохранять уровень вакуума, необходимый для обеспечения надлежащего качества содержащегося лекарственного препарата.

Для проведения испытаний используют соответствующее оборудование, обеспечивающее определение уровня вакуума в необходимом диапазоне.

Испытуемые ампулы и (или) флаконы при комнатной температуре устанавливают в штативе, к ним на расстоянии 1 см подводят электрод, не прикасаясь высокочастотным электродом к месту запайки ампул. Экспозиция искрового заряда у каждой ампулы и (или) флакона не должна быть более 1 с во избежание пробоя стенки ампул и (или) флаконов. Свечение внутри ампулы и (или) флакона и характерное потрескивание при подведении к ним электрода указывает на наличие в упаковках вакуума. В зависимости от величины остаточного давления внутри ампулы и (или) флакона (уровня вакуума) цвет свечения будет различным (таблица 2.1.9.19.-1).

Таблица 2.1.9.19.-1. - Зависимость цвета свечения от величины давления для иммунобиологических лекарственных препаратов

Контроль точности определения следует проводить по свечению образцов ампул и флаконов, герметизированных в строго контролируемых условиях при точно известных значениях давления.

Например, при определении герметичности ампул и флаконов, содержащих иммунобиологические лекарственные препараты, методом свечения, при отсутствии других указаний, величину давления определяют по цвету свечения в соответствии с данными таблицы 2.1.9.19.-1. Упаковка считается негерметичной, если остаточное давление внутри ампулы или флакона будет более 1,0 кПа.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕРМЕТИЧНОСТИ ТУБ С МЯГКИМИ ЛЕКАРСТВЕННЫМИ ФОРМАМИ

Испытание проводят для упаковки, представляющей собой тубы, содержащие мягкие лекарственные формы, в рамках контроля технологического процесса производства мягких лекарственных форм.

Первоначально отбирают 10 туб и тщательно вытирают наружные поверхности туб фильтровальной бумагой. Тубы помещают в горизонтальном положении на лист фильтровальной бумаги и выдерживают при температуре (60 +/- 3) °C в течение 8 ч.

Не должно быть подтеков на фильтровальной бумаге ни из одной тубы.

Если из одной из 10 первоначально отобранных туб наблюдаются подтеки, проводят дополнительное испытание еще с 20 тубами. Не должно быть подтеков ни в одной из 20 дополнительно отобранных туб.

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ГЕРМЕТИЧНОСТИ АЭРОЗОЛЬНЫХ УПАКОВОК

Испытание проводят для упаковок, представляющих собой аэрозольные баллоны, укупоренные с помощью клапанно-распылительной системы (аэрозольные упаковки), содержащие лекарственные формы (например, аэрозоли, пены), находящиеся в этих упаковках под давлением пропеллента.

Визуальный метод определения герметичности. При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству испытание проводят не менее чем на трех образцах упаковки. Аэрозольный баллон без колпачка и распылителя или насадки полностью погружают в водяную баню при температуре (45 +/- 5) °C не менее чем на 15 мин и не более чем на 30 мин для стеклянного аэрозольного баллона и не менее чем на 10 мин и не более чем на 20 мин для металлического аэрозольного баллона. Толщина слоя воды над штоком клапана должна быть не менее 1 см. Упаковка считается герметичной, если не наблюдается выделение пузырьков газа.

Скорость утечки. Отбирают 12 ранее не использовавшихся аэрозольных баллонов, удаляют с них все этикетки. Каждый аэрозольный баллон без колпачка и распылителя или насадки взвешивают с точностью до 0,001 г (m0), записывают дату и время с точностью до получаса, и оставляют в вертикальном положении при температуре (25 +/- 2) °C в течение не менее 3 сут. После данного испытания каждый аэрозольный баллон повторно взвешивают с точностью до 0,001 г (m1), записывая дату и время с точностью до получаса. Отмечают время (T) в часах, в течение которого аэрозольные баллоны подвергались испытанию.

Освобождают каждый аэрозольный баллон от содержимого в соответствии со способом, указанным в частной фармакопейной статье или нормативном документе по качеству. Взвешивают каждый пустой аэрозольный баллон с точностью до 0,001 г (m2) и рассчитывают массу содержимого каждого аэрозольного баллона (m3) по формуле:

m3 = m0 - m2.

Среднюю массу содержимого испытуемых аэрозольных баллонов с точностью до 0,001 г (m3i) рассчитывают по формуле:

m_{3}i = \frac{(m_{0}i - m_{2}i)}{n} ,

где: m0i - сумма масс аэрозольных баллонов, подвергшихся испытанию, с содержимым, в граммах;

m2i - сумма масс аэрозольных баллонов, подвергшихся испытанию, без содержимого, в граммах;

n - количество аэрозольных баллонов, подвергшихся испытанию.

Скорость утечки в год (Vm) в миллиграммах содержимого каждого аэрозольного баллона, подвергшегося испытанию, рассчитывают по формуле:

Vm = \frac{365 \cdot 24 \cdot (m_{0} - m_{1}) \cdot 1000}{T} ,

где: m0 - масса аэрозольного баллона с содержимым, в граммах;

m1 - масса аэрозольного баллона по окончании испытания, в граммах;

T - время, в часах;

1000 - пересчет граммов в миллиграммы.

Среднюю скорость утечки в год (Vmi) в миллиграммах содержимого аэрозольных баллонов, подвергшихся испытанию, рассчитывают по формуле:

Vmi = \frac{365 \cdot 24 \cdot (m_{0}i - m_{1}i) \cdot 1000}{T \cdot n} ,

где: m0i - сумма масс аэрозольных баллонов, подвергшихся испытанию, с содержимым, в граммах;

m1i - сумма масс аэрозольных баллонов, подвергшихся испытанию, по окончании испытания, в граммах;

n - количество аэрозольных баллонов, подвергшихся испытанию;

T - время, в часах;

1000 - пересчет граммов в миллиграммы.

Скорость утечки в год в процентах (V%) содержимого каждого аэрозольного баллона, подвергшегося испытанию, рассчитывают по формуле:

V_{\%} = \frac{Vm \cdot 100}{m_{3} \cdot 1000} = \frac{Vm}{m_{3} \cdot 10} .

Среднюю скорость утечки в год в процентах (Vi%) содержимого аэрозольных баллонов, подвергшихся испытанию, рассчитывают по формуле:

Vi_{\%} = \frac{Vmi \cdot 100}{m_{3}i \cdot 1000} = \frac{Vmi}{m_{3}i \cdot 10} .

Если масса содержимого аэрозольного баллона составляет 15 г и более, при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье или нормативном документе по качеству, средняя скорость утечки в год для 12 аэрозольных баллонов не должна превышать 3,5% от средней массы содержимого аэрозольного баллона и ни для одного из них не должна превышать 5,0%.

Если, хотя бы для одного аэрозольного баллона, средняя скорость утечки в год превышает 5,0%, но ни для одного из аэрозольных баллонов не превышает 7,0%, испытание на скорость утечки проводят еще на 24 аэрозольных баллонах. Не более 2 аэрозольных баллонов из 36 могут иметь среднюю скорость утечки в год больше 5,0% и ни для одного из них средняя скорость утечки в год не должна превышать 7,0%.

Если масса содержимого аэрозольного баллона составляет менее 15 г, то средняя скорость утечки в год для 12 аэрозольных баллонов не должна превышать 525 мг и ни для одного из них не должна превышать 750 мг. Если хотя бы для одного аэрозольного баллона скорость утечки в год превышает 750 мг, но не более 1,1 г, то испытание на скорость утечки проводят еще на 24 аэрозольных баллонах. Не более 2 аэрозольных баллонов из 36 могут иметь скорость утечки в год более 750 мг и ни для одного аэрозольного баллона из 36 скорость утечки в год не должна превышать 1,1 г.

201090020-2022

2.1.9.20 Определение давления в герметичной упаковке

Данное испытание предназначено для лекарственных форм, находящихся под давлением в герметичной упаковке, представляющих собой аэрозоли и пены, в которых пропеллентами являются сжатые газы, с целью определения давления внутри упаковки.

При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству испытание проводят не менее чем на 3 образцах. Упаковка аэрозолей или пен, находящихся под давлением, представляет собой, как правило, аэрозольные баллоны.

Методика. При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству, отобранные для испытания аэрозольные баллоны выдерживают при температуре (20 +/- 5) °C в течение 1 ч. Затем аэрозольные баллоны встряхивают и устанавливают в вертикальное положение. С помощью специального адаптера (переходника) к отверстию клапана аэрозольного баллона присоединяют манометр, откалиброванный на измерение давления в нормируемом интервале величин, имеющий допустимую погрешность измерения не более 2,5% от его диапазона измерений. Измеряют давление внутри каждого аэрозольного баллона.

Давление внутри каждой упаковки должно соответствовать требованиям, указанным в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству. При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству, давление в каждой из испытуемых упаковок не должно превышать 0,8 МПа.

201090021-2022

2.1.9.21 Время растворения или диспергирования для получения восстановленных лекарственных форм

Настоящая общая фармакопейная статья предназначена для определения времени получения восстановленных лекарственных форм лекарственных препаратов из исходных лекарственных форм, требующих перед применением дополнительного преобразования путем растворения или диспергирования в соответствующем растворителе.

Данное испытание относится к гранулам, лиофилизатам, порошкам (далее - твердым лекарственным формам), предназначенным для получения жидких лекарственных форм, а также к порошкам шипучим.

Под понятием "время растворения или диспергирования" подразумевают время, в течение которого исходная лекарственная форма полностью растворилась или диспергировалась в соответствующем растворителе; в случае порошков шипучих - прекратилось выделение пузырьков углерода диоксида.

МЕТОДИКА ДЛЯ ТВЕРДЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫХ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЖИДКИХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ

Процесс растворения или диспергирования твердых лекарственных форм для получения восстановленных лекарственных форм лекарственных препаратов должен проходить в условиях, обеспечивающих полное смачивание всех компонентов лекарственного препарата в твердой лекарственной форме и переход твердых компонентов в раствор в течение достаточного времени при определенной интенсивности взбалтывания. При необходимости должны быть указаны особые требования к растворению лекарственного препарата (например, температурный режим и др.).

Определение проводят визуально на 6 образцах, отсчет времени осуществляют с помощью секундомера.

Под образцом принимают лекарственный препарат в однодозовой упаковке.

При отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству, твердая лекарственная форма выдерживает испытание по показателю Время растворения или Время диспергирования для получения восстановленных лекарственных форм лекарственных препаратов, если каждый из 6 образцов растворяется или диспергируется в течение не более 5 мин.

Различают два способа подготовки образцов для определения показателя Время растворения или Время диспергирования для получения восстановленных лекарственных форм лекарственных препаратов.

В случае, если объем растворителя не превышает номинальный объем упаковки, представляющей собой, как правило, флакон, определение проводят следующим образом. Во флакон с лекарственным препаратом, представляющим собой твердую лекарственную форму, вводят указанное в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству количество растворителя и аккуратно перемешивают либо встряхивают до полного растворения или диспергирования твердой лекарственной формы. В установленных случаях растворитель вводят, прокалывая резиновую пробку, которой укупорен флакон с лекарственным препаратом, с помощью шприца, предварительно заполненного соответствующим растворителем.

Время растворения или диспергирования лекарственного препарата измеряют с момента внесения растворителя в упаковку с лекарственным препаратом.

Если объем растворителя превышает номинальный объем упаковки или упаковка не предназначена для внесения в нее растворителя, определение проводят следующим образом. Одну дозу лекарственного препарата в твердой лекарственной форме помещают в стакан, содержащий отмеренное количество растворителя, указанное в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству, аккуратно перемешивают или встряхивают до полного растворения или диспергирования твердой лекарственной формы.

Время растворения или диспергирования для получения восстановленной лекарственной формы лекарственного препарата измеряют с момента внесения лекарственной формы в растворитель.

МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЛЯ ПОРОШКОВ ШИПУЧИХ

Определение проводят визуально на 6 образцах, отсчет времени осуществляют с помощью секундомера.

Под образцом принимают лекарственный препарат в однодозовой упаковке.

Если нет других указаний в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству, порошок шипучий выдерживает испытание по показателю Время растворения или Время диспергирования для получения восстановленной лекарственной формы лекарственного препарата, если каждый из 6 исследуемых образцов лекарственного препарата растворяется или диспергируется в течение не более 5 мин.

Одну дозу лекарственного препарата в виде порошка шипучего, помещают в стакан, содержащий 200 мл воды при температуре от 15 °C до 25 °C, при этом начинают выделяться пузырьки газа. Лекарственная форма считается восстановленной, если после прекращения выделения пузырьков газа она полностью растворилась или диспергировалась.

201090022-2022

2.1.9.22 Истираемость гранул и сфероидов

В данной общей фармакопейной статье описываются два метода определения истираемости гранул и сфероидов, которые могут использоваться при фармацевтической разработке. Допускается применение других, в равной степени пригодных, методов.

Испытание предназначено для определения в установленных условиях истираемости гранул и сфероидов. Истираемость определяют как уменьшение массы гранул или сфероидов или образование их фрагментов, наблюдаемое при механическом воздействии на гранулы или сфероиды в процессе обработки (встряхивание, вибрация, воздействие псевдоожиженного слоя и т.д.). Царапины, изломы или деформации гранул или сфероидов относят к изменениям.

МЕТОД 1

Прибор (прибор для создания псевдоожиженного слоя). Прибор (рисунок 2.1.9.22.-1) состоит из стеклянного цилиндра (А) с конусовидной нижней частью. Цилиндр снабжен решетчатой крышкой (Б), имеющей отверстия с размером 500 мкм, или любым другим подходящим ситом. Конусовидный конец прикреплен к U-образной стеклянной трубке (В), которая может отсоединяться от цилиндра для удаления гранул или сфероидов. U-образная трубка прикреплена к T-образной муфте (Г). Один конец T-образной муфты соединен при помощи силиконовой трубки с манометром, регулирующим поток сжатого воздуха (используют сжатый воздух), другой конец соединен через силиконовую трубку с измерителем скорости потока (Д) (0,10 - 1,00 м3 · ч-1).

Рисунок 2.1.9.22.-1. - Прибор для создания псевдоожиженного слоя

Обычно используют следующую методику.

Методика. Удаляют мелкие частицы путем просеивания через сито, имеющее размер отверстий 710 мкм или любое другое подходящее сито. Около 8,0 г (m1) гранул или сфероидов помещают в цилиндр (А). Прибор закрывают решетчатой крышкой (Б). Устанавливают скорость потока сжатого воздуха на уровне 0,45 м3 · ч-1. Через 15 мин удаляют гранулы или сфероиды из прибора путем отсоединения U-образной трубки и снова взвешивают (m2). Испытание проводят на трех образцах и рассчитывают среднее значение. Для снятия электростатического электричества рекомендуют опрыскивать внутреннюю поверхность прибора антистатическим реактивом после каждых трех определений.

Для определения потери в массе при высушивании образцы сушат в сушильном шкафу при температуре 105 °C, при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье. В качестве альтернативных допускается использование других условий высушивания, описанных в общей фармакопейной статье 2.1.2.31. Потеря в массе при высушивании.

Истираемость (F) рассчитывают по следующей формуле:

F = \frac{m_{1}(100 - T_{1}) - m_{2}(100 - T_{2})}{m_{1}} \cdot 100 ,

где: T1 - потеря в массе при высушивании перед испытанием в процентах (среднее значение из двух определений);

T2 - потеря в массе при высушивании после испытания в процентах (среднее значение из двух определений);

m1 - масса гранул или сфероидов перед испытанием в граммах;

m2 - масса гранул или сфероидов после испытания в граммах.

МЕТОД 2

Прибор (вибрационный прибор). Прибор (рисунок 2.1.9.22.-2) состоит из стеклянного сосуда, содержащего испытуемые гранулы или сфероиды, которые подвергают горизонтальным вибрациям. Частота и продолжительность вибраций может постоянно изменяться. Частоту можно регулировать с помощью шкалы до значения в пределах от 0 до 400 вибраций/мин. Продолжительность можно устанавливать в диапазоне от 0 до 9999 с.

Рисунок 2.1.9.22.-2. - Вибрационный прибор

Обычно используют следующую методику.

Методика. Удаляют мелкие частицы путем просеивания через сито, имеющее размер отверстий 355 мкм или любое другое подходящее сито. В стеклянном сосуде взвешивают около 10,00 г (m1) гранул или сфероидов. Сосуд устанавливают в прибор. Встряхивают в течение 240 с при наибольшей частоте для твердых гранул или сфероидов или в течение 120 с при наименьшей частоте (например, 140 вибраций/мин) для мягких гранул или сфероидов. Просеивают через сито 355 мкм или ранее использованное сито и снова взвешивают гранулы или сфероиды (m2). Испытание проводят на трех образцах и рассчитывают среднее значение.

Для определения потери в массе при высушивании образцы сушат в сушильном шкафу при температуре 105 °C, при отсутствии других указаний в частной фармакопейной статье. В качестве альтернативных допускается использование других условий высушивания, описанных в общей фармакопейной статье 2.1.2.31. Потеря в массе при высушивании.

Истираемость (F) рассчитывают по следующей формуле:

F = \frac{m_{1}(100 - T_{1}) - m_{2}(100 - T_{2})}{m_{1}} \cdot 100 ,

где: T1 - потеря в массе при высушивании перед испытанием, в процентах (среднее значение из двух определений);

T2 - потеря в массе при высушивании после испытания, в процентах (среднее значение из двух определений);

m1 - масса гранул или сфероидов перед испытанием, в граммах;

m2 - масса гранул или сфероидов после испытания, в граммах.

201090023-2022

2.1.9.23 Испытание на растворение для резинок жевательных лекарственных

Испытание предназначено для определения количества действующего вещества, которое за определенный промежуток времени должно высвободиться в среду растворения из жевательной резинки в условиях, указанных в настоящей общей фармакопейной статье, а также в частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству.

Определение проводят путем механического разминания кусочка жевательной резинки, помещенного в небольшую камеру, имитирующую процесс жевания.

ОБОРУДОВАНИЕ

ПРИБОР А

Прибор А для имитации жевания (рисунок 2.1.9.23.-1) состоит из следующих частей:

• камеры, имитирующей процесс жевания;
• вертикального поршня;
• двух горизонтальных поршней с уплотнительными O-образными кольцами и прокладками.

Рисунок 2.1.9.23.-1. - Прибор А для имитации жевания. Жевательная камера и поршни. Размеры указаны в миллиметрах. А - горизонтальный поршень; Б - направляющий элемент; В - камера для имитации жевания; Г - воронка; Д - вертикальный поршень. Размеры указаны в миллиметрах

Камера для имитации жевания состоит из четырех отдельных частей:

• центральной камеры;
• воронки (рисунок 2.1.9.23.-2);
• двух направляющих элементов с втулками (рисунок 2.1.9.23.-3).

Рисунок 2.1.9.23.-2. - Прибор А. Воронка. Размеры указаны в миллиметрах

Рисунок 2.1.9.23.-3. - Прибор А (секция Е-Е). Направляющий элемент. Размеры указаны в миллиметрах

Воронку и направляющие элементы монтируют в центральную камеру. Уплотнительные O-образные кольца вставляют в выточку поршня, вокруг которой помещена прокладка, обеспечивающая герметичность камеры.

Горизонтальные поршни размещаются в камере по направляющим для имитации процесса жевания.

Жевательную резинку подвергают воздействию при помощи горизонтальных поршней; вертикальный поршень обеспечивает правильное местоположение жевательной резинки в процессе имитации жевания.

Для обеспечения постоянства рабочего цикла скорость прибора контролируется. Один цикл жевания определяется следующим образом: горизонтальные поршни начинают свое движение из крайних внешних положений, движутся к самому дальнему внутреннему положению и обратно в крайнее внешнее положение. В течение одного цикла вертикальный поршень движется из самого нижнего положения к самому верхнему и обратно в самое нижнее положение.

Величина хода каждого горизонтального поршня составляет 25,0 мм. Максимальное расстояние между двумя горизонтальными поршнями составляет 50 мм. Минимальное расстояние между двумя горизонтальными поршнями составляет от 0,1 мм до 1,0 мм. Величина хода вертикально поршня составляет 22,0 мм.

Движение горизонтальных поршней контролируется таким образом, чтобы оба поршня находились в самом дальнем внутреннем положении одновременно. Движение вертикального поршня должно согласовываться с движением горизонтальных поршней.

При необходимости прибор может быть сконструирован таким образом, чтобы к концу цикла горизонтальные поршни вращались вокруг собственных осей в противоположном направлении друг к другу для достижения максимального эффекта жевания.

Все части прибора, которые могут находиться в контакте с препаратом или средой растворения, должны быть химически инертными и не должны адсорбировать, реагировать или иным образом взаимодействовать с образцом.

ПРИБОР Б

Прибор Б для имитации жевания (рисунок 2.1.9.23.-4) состоит из:

• ячейки для испытания (рисунок 2.1.9.23.-5 или рисунок 2.1.9.23.-6);
• вертикального вала с верхней жевательной поверхностью (рисунки 2.1.9.23.-7 и 2.1.9.23.-8);
• камеры-основания с нижней жевательной поверхностью (рисунки 2.1.9.23.-9 и 2.1.9.23.10);
• устройства для выполнения жевательных движений;
• устройства, вращающего вертикальный вал.

Рисунок 2.1.9.23.-4. - Прибор Б. А - устройство, вращающее верхнюю жевательную поверхность; Б - корпус; В - ячейка для испытаний; Г - вал; Д - верхняя жевательная поверхность; Е - нижняя жевательная поверхность; Ж - камера-основание; И - устройство для имитации жевательных движений вверх - вниз.

Рисунок 2.1.9.23.-5. - Прибор Б. Ячейка для испытания. Размеры указаны в миллиметрах

Рисунок 2.1.9.23.-6. - Прибор Б. Ячейка для испытания (прямая). Размеры указаны в миллиметрах

Рисунок 2.1.9.23.-7. - Прибор Б. Вал. Размеры указаны в миллиметрах

Рисунок 2.1.9.23.-8. - Прибор Б. Верхняя жевательная поверхность. Размеры указаны в миллиметрах

Рисунок 2.1.9.23.-9. - Прибор Б. Камера-основание. Размеры указаны в миллиметрах

Рисунок 2.1.9.23.-10. - Прибор Б. Нижняя жевательная поверхность. Размеры указаны в миллиметрах

Обычно резинку вставляют между двумя вращающимися пластиковыми сетками для предотвращения ее распадения.

Допускается использование сеток, изготовленных из нейлона (PA6), с размером ячеек 1,4 мм и диаметром нитей 0,405 мм.

Жевательную резинку подвергают воздействию при помощи нижней и верхней жевательных поверхностей. Скорость прибора контролируют для обеспечения постоянства рабочего цикла. Расстояние между нижней и верхней жевательными поверхностями может устанавливаться до 5 миллиметров. Угол вращения вращательного устройства составляет около 20 градусов.

Ячейки для испытаний могут также оснащаться 1 или 2 стеклянными трубками для отбора проб, имеющими двойные термостатируемые стенки. Трубки позволяют также обеспечить сток жидкости наружу, который может потребоваться для умеренно растворимых веществ.

Все части прибора, которые могут находиться в контакте с препаратом или средой растворения, должны быть химически инертными и не должны адсорбировать, реагировать или взаимодействовать с образцом.

МЕТОДИКА

В частной фармакопейной статье и (или) нормативном документе по качеству на конкретную жевательную резинку указывается:

• используемый прибор (тип А или тип Б);
• состав, объем и температура среды растворения;
• количество циклов "жевания" в минуту;
• время и метод отбора проб;
• методика количественного определения;
• критерии приемлемости.

Количественное определение действующего вещества проводят с использованием остатка жевательной резинки или среды растворения.

В камеру для имитации жевания помещают указанный объем среды растворения, как правило, 20 мл фосфатного буферного раствора с pH 6,0 P2. Поддерживают температуру среды растворения при (37 +/- 0,5) °C, используя электрическое устройство с внешним контролем (прибор А) или термостат (прибор Б). Задают скорость движения поршней при указанном числе циклов жевания в минуту (обычно 60). Точно взвешивают часть жевательной резинки или резинку целиком, помещают ее в камеру для имитации жевания и приводят прибор в действие.

ОТБОР ПРОБ И ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ

Останавливают прибор в указанное время. Удаляют остатки резинки и отбирают пробу среды растворения. Определяют содержание действующего(их) вещества (веществ) по соответствующей методике. После каждого отбора проб допускается восполнение среды растворения; при расчетах необходимо учитывать изменение объема среды растворения или разбавление пробы. В качестве альтернативы возможно определение содержания действующего вещества (веществ), оставшегося(ихся) в жевательной резинке. Испытание последовательно проводят на 6 жевательных резинках.

Количество действующего(их) вещества (веществ), растворенного(ых) за определенное время, выражается в процентах от содержания, указанного на этикетке лекарственного препарата.

201090024-2022

2.1.9.24 Подтверждение однородности дозированных единиц с использованием выборки большого размера

Испытание предназначено для оценки лекарственных препаратов, производство которых осуществляется с применением процессно-аналитической технологии. В этом случае испытание проводится на выборке большого размера, в которой число дозированных единиц составляет не менее 100 (n >= 100). Для такой выборки соответствие требованиям общей фармакопейной статьи 2.1.9.14. Однородность дозированных единиц может подтверждаться с помощью альтернативных испытаний, описанных в данной общей фармакопейной статье. Применение данной общей фармакопейной статьи не является обязательным.

Выполнение требований любого из альтернативных испытаний означает, что испытуемый лекарственный препарат соответствует требованиям общей фармакопейной статьи 2.1.9.14. Однородность дозированных единиц. Приведенные альтернативные испытания считают эквивалентными при подтверждении соответствия требованиям общей фармакопейной статьи 2.1.9.14. Однородность дозированных единиц.

АЛЬТЕРНАТИВНОЕ ИСПЫТАНИЕ 1 (ПАРАМЕТРИЧЕСКОЕ)

Отбирают не менее 100 дозированных единиц в соответствии с предварительно составленным планом отбора проб.

Однородность дозированных единиц оценивают по однородности содержания или изменению массы, как указано в таблице 2.1.9.24.-1. Допустимое значение (AV) рассчитывают по следующей формуле:

AV = |M - X| +/- kS,

для которой величины определяют из таблицы 2.1.9.24.-2, а значение K, зависящее от числа дозированных единиц в выборке, определяют из таблицы 2.1.9.24.-1.

Таблица 2.1.9.24.-1. - Постоянная допустимости (k) и допустимое число дозированных единиц с содержанием действующего вещества за пределами (1 +/- L2 · 0,01) · M (= c2) для данного размера выборки n

Таблица 2.1.9.24.-2. - Допустимое число отдельных дозированных единиц с содержанием действующего вещества за пределами (1 +/- L1 · 0,01) · T (= c1) и (1 +/- L2 · 0,01) · T (= c2) соответственно для каждого размера выборки n