ОФС.1.7.2.0025.18. Общая фармакопейная статья. Количественное определение тиомерсала в биологических лекарственных препаратах

(утв. и введена в действие Приказом Минздрава России от 31.10.2018 № 749)

(«Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том II»)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["ОФС.1.7.2.0025.15"]:::rst
  click n0 "https://bukva.ai/docs/gf-xiii-minzdrav-rossii-ministerstvo-274" "ОФС.1.7.2.0025.15. Общая фармакопейная статья'Количественное определение тиомерсала в иммунобиологических лекарственных препаратах. ОФС.1.7.2.0025.15'"
  n1["ОФС.1.7.2.0025.18"]:::doc
  click n1 "https://bukva.ai/docs/ofs-1-7-2-0025-18" "ОФС.1.7.2.0025.18. Общая фармакопейная статья. Количественное определение тиомерсала в биологических лекарственных препаратах (утв. и введена в действие Приказом Минздрава России о"
  n0 --> n1
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ

Настоящая общая фармакопейная статья предназначена для количественного определения тиомерсала в биологических лекарственных препаратах (БЛП) методами: колориметрическим, полярографическим, методом электротермической атомно-абсорбционной спектрометрии (ЭААС) и методом атомно-абсорбционной спектроскопии холодного пара (ААС-ХП).

Указанные методы предназначены для определения содержания тиомерсала в сорбированных и несорбированных БЛП.

Колориметрический метод основан на выделении из тиомерсала ртути в виде свободных ионов и последующем колориметрическом определении ртути дитизоната.

Полярографический метод основан на полярографической активности тиомерсала.

Метод электротермической атомно-абсорбционной спектрометрии (ЭААС) для определения тиомерсала в БЛП вводится впервые. Метод основан на измерении оптической плотности атомного пара ртути, получаемого при электротермической атомизации исследуемого образца. Сигнал максимального поглощения резонансового излучения атомами ртути прямо пропорционален концентрации тиомерсала в исследуемом образце. Содержание тиомерсала в испытуемом образце определяется по калибровочному графику.

Метод атомно-абсорбционной спектроскопии холодного пара (ААС-ХП) для определения тиомерсала в БЛП вводится впервые. Метод атомно-абсорбционной спектроскопии холодного пара основан на восстановлении ртути с помощью сильного восстановителя до атомарного состояния. Атомарная ртуть выделяется в виде паров и способна поглощать (абсорбировать) излучение световых потоков при длине волны 253,7 нм. При этом абсорбция световых потоков прямо пропорциональна концентрации ионов ртути в испытуемом образце. Содержание ртути в исследуемом образце определяется по калибровочному графику с пересчетом на тиомерсал.

Содержание тиомерсала, определяемое указанными методами в БЛП, не должно превышать 20 — 120 мкг/мл.

Колориметрический метод

Испытуемый образец помещают в колбу с притертой пробкой вместимостью 100 мл, прибавляют 1,2 мл серной кислоты разведенной концентрированной (при наличии сорбента алюминия гидроксида смесь осторожно нагревают на водяной бане, постоянно помешивания до его полного растворения), добавляют 5 мл 5% раствора калия перманганата, перемешивают и оставляют на 1 ч при комнатной температуре. После этого удаляют избыток калия перманганата, прибавляя 1,5 мл 20% раствора гидроксиламина сульфата, 30 мл воды очищенной и 5 мл 6 М раствора уксусной кислоты. Полученный раствор перемешивают, прибавляют 10 мл 0,001% раствора дитизона (точно отмеренный объем) и встряхивают в течение 30 с. Содержимое колбы переносят в делительную воронку и после разделения слоев фильтруют в кювету толщиной 10 мм нижний хлороформный слой через предварительно прокипяченную и высушенную вату. Затем измеряют оптическую плотность хлороформного раствора при 597 нм по сравнению с контрольным раствором, содержащим 0,2 мл воды очищенной и все вышеперечисленные реагенты.

Содержание тиомерсала (X1) в растворе в мкг/мл вычисляют по формуле:

X_{1} = \frac{a \cdot 100}{0,2 \cdot 49,55} = a \cdot 10,1,

где a — количество ртути, найденное по калибровочному графику, мкг;

100 — разведение испытуемого образца;

0,2 — объем испытуемого образца, мл;

49,55 — коэффициент пересчета ртути на тиомерсал.

Построение калибровочного графика. К 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2 мл стандартного раствора № 2 прибавляют 1,2 мл серной кислоты разведенной, 30 мл воды очищенной, 5 мл 0,9% раствора натрия хлорида, 5 мл 6 М раствора уксусной кислоты и перемешивают (содержание ртути: 4; 6; 8; 10; 12 мкг соответственно). Далее определение проводят по методике, указанной выше. Калибровочный график воспроизводят при каждом анализе.

Одновременно с испытуемым образцом для подтверждения правильности методики проводят анализ стандартного образца (СО) «Содержание тиомерсала в сорбированных препаратах». Анализ СО проводят при каждом определении.

Содержание тиомерсала в БЛП не должно превышать 20 — 120 мкг/мл.

Примечания

Испытуемый раствор. 0,2 мл раствора испытуемого образца, приготовленного, как указано в фармакопейной статье или нормативной документации.

Основной стандартный раствор ртути металлической 1 мг/мл (раствор № 1). Помещают 0,5 г ртути металлической (точная навеска) в мерную колбу вместимостью 500 мл, растворяют в 15 мл азотной кислоты концентрированной, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают.

Для определения содержания ртути отмеряют 10 мл стандартного раствора № 1, прибавляют 0,5 мл 10% раствора квасцов железоаммонийных и медленно титруют 0,01 М раствором аммония роданида до оранжевого окрашивания раствора.

Содержание ртути (X2) в мг/мл вычисляют по формуле:

X_{2} = \frac{V \cdot 0,001003}{10} ,

где V — раствор аммония роданида, мл;

0,001003 — количество ртути, соответствующее 1 мл 0,01 М раствора аммония роданида, в г;

10 — объем испытуемого образца, в мл.

Раствор хранят в течение 3 мес при комнатной температуре в вытяжном шкафу в специально отведенном месте.

Стандартный раствор ртути металлической 10 мкг/мл (раствор № 2). В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 1 мл стандартного раствора № 1, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают.

Возможно использование государственного стандартного образца (ГСО) раствора ионов ртути (II).

Стандартные образцы (СО) «Содержание тиомерсала в сорбированных препаратах» с различным диапазоном содержания тиомерсала в пределах от 20 до 120 мкг/мл.

Приготовление 5% раствора калия перманганата. Растворяют 50 г калия перманганата в 700 мл горячей воды очищенной, помещенной в коническую колбу, охлаждают и переносят в мерную колбу вместимостью 1000 мл, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор хранят при температуре 4 — 8 °C в течение 3 мес.

Приготовление 0,001% раствора дитизона. В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 10 мг дитизона (точная навеска), растворяют в хлороформе, доводят объем раствора хлороформом до метки и перемешивают. Раствор хранят в темном месте при температуре 4 — 8 °C в течение 1 мес.

Перед использованием 10 мл раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора хлороформом до метки и перемешивают. Раствор используют свежеприготовленным.

Измеряют оптическую плотность полученного раствора при длине волны 597 нм в кюветах с толщиной слоя 10 мм по сравнению с контрольным раствором (вода очищенная). Диапазон колебаний показаний оптической плотности от среднего значения не должен превышать +/- 0,05.

Приготовление 20% раствора гидроксиламина сульфата. В мерном цилиндре вместимостью 500 мл в воде очищенной растворяют 100 г гидроксиламина сульфата, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор хранят при комнатной в течение 6 мес.

Приготовление 6 М раствора уксусной кислоты. Вносят в мерную колбу вместимостью 1000 мл 340 мл уксусной кислоты ледяной, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор хранят при комнатной температуре в течение 6 мес.

Приготовление 50% серной кислоты, разведенной по объему. В коническую колбу вместимостью 250 мл вносят 100 мл воды очищенной и осторожно при постоянном перемешивании прибавляют 100 мл серной кислоты концентрированной. Работу следует проводить в вытяжном шкафу, соблюдая технику безопасности. Раствор хранят при комнатной температуре в течение 6 мес.

Приготовление 0,1 М раствора аммония роданида (раствор A). Раствор готовят из 0,1 Н стандарт-титра (фиксанала) в мерной колбе вместимостью 1000 мл согласно инструкции по приготовлению. Раствор хранят при температуре 4 — 8 °C в течение 6 мес.

Приготовление 0,01 М раствора аммония роданида (раствор B). В мерную колбу вместимостью 50 мл вносят 5 мл раствора A и доводят объем водой очищенной до метки. Раствор готовят при каждом определении.

Приготовление раствора азотной кислоты разведенной. В коническую колбу вместимостью 250 мл вносят 100 мл воды очищенной и осторожно при постоянном перемешивании прибавляют 72 мл азотной кислоты концентрированной. Раствор хранят при комнатной температуре в течение 6 мес.

Приготовление 10% раствора квасцов железоаммонийных. В 90 мл воды растворяют 10 г квасцов железоаммонийных и прибавляют азотной кислоты разведенной до перехода коричневой окраски в желтовато-зеленую. В случае необходимости раствор фильтруют.

Полярографический метод

Испытуемый раствор помещают в колбу вместимостью 50 мл с притертой пробкой, прибавляют 0,5 мл 2 М раствора калия хлорида и помещают в электролизер, термостатируемый при температуре 19 — 21 °C. Через испытуемый раствор пропускают газообразный азот в течение 10 — 15 мин. Ртутный капельный электрод опускают в электролизер и снимают полярограмму на полярографе с регистрирующим устройством в области потенциала от 0,2 до 1,0 В (внутренний анод).

Содержание тиомерсала (X3) в мкг/мл рассчитывают по формуле:

X_{3} = \frac{a \cdot 5,0}{4,5} ,

где a — количество тиомерсала в испытуемом растворе, найденное по калибровочному графику, мкг/мл;

5,0 — общий объем пробы, мл;

4,5 — объем испытуемого раствора, взятого на анализ, мл.

Построение калибровочного графика. К 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5 мл стандартного раствора тиомерсала № 2 (150 мкг/мл тиомерсала) прибавляют 0,5 мл 2 М раствора калия хлорида, доводят общий объем водой очищенной до 5 мл (концентрация тиомерсала: 30; 45; 60; 75; 90; 105; 120; 135 мкг/мл соответственно) и перемешивают. Определение проводят, как указано выше. На полученных полярограммах строят калибровочный график, откладывая среднее значение высоты волны на оси ординат (OY), а на оси абсцисс (OX) — соответствующее значение концентрации тиомерсала в мкг/мл.

Калибровочный график пригоден неограниченное время для данного капилляра при постоянных условиях определения (температура, время каплеобразования).

Тиомерсал, используемый для приготовления стандартного раствора № 1, должен соответствовать требованиям, указанным в разделе «Методы оценки качества тиомерсала».

Примечания

Испытуемый раствор — 4,5 мл раствора испытуемого образца, приготовленного, как указано в фармакопейной статье или нормативной документации.

Стандартный раствор тиомерсала 15 мг/мл (раствор № 1). В мерную колбу вместимостью 100 мл помещают 1,50 г тиомерсала (точная навеска), растворяют в воде очищенной и доводят объем раствора тем же растворителем до метки. Раствор хранят при температуре 4 — 8 °C в течение 3 мес.

Стандартный раствор тиомерсала 150 мкг/мл (раствор № 2). Перед определением 1 мл стандартного раствора тиомерсала № 1 помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают.

Приготовление 2 М раствора калия хлорида. В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 149,1 г калия хлорида, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор хранят при комнатной температуре в течение 6 мес.

Метод электротермической атомно-абсорбционной спектрометрии

Анализ проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации прибора — электротермического атомно-абсорбционного спектрометра.

Испытуемый образец, приготовленный, как указано в фармакопейной статье или нормативной документации, вносят в отверстие графитовой трубки прибора и измеряют оптическую плотность образцов при длине волны 253,7 нм в следующей последовательности: вода очищенная (контрольный раствор), калибровочные растворы (в порядке увеличения измеряемой концентрации), стандартный образец «Содержание тиомерсала в сорбированных препаратах» и испытуемый образец. Анализ испытуемых образцов проводят не менее трех раз.

Содержание тиомерсала в испытуемом образце в мкг/мл рассчитывают по калибровочному графику с помощью программного обеспечения к прибору с учетом разведения испытуемого образца.

Построение калибровочного графика. Отбирают 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 мл стандартного раствора тиомерсала № 2 (2 мкг/мл), доводят объем растворов водой очищенной до 1 мл и перемешивают (концентрация тиомерсала: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2 мкг/мл соответственно). Строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс количество тиомерсала в мкг/мл, а по оси ординат — среднее значение оптической плотности атомного пара ртути. Калибровочный график воспроизводят при каждом определении.

Метод электротермической атомно-абсорбционной спектрометрии может быть применим и для анализа остаточного содержания тиомерсала в БЛП.

Примечания

Испытуемый раствор. Испытуемый раствор разводят водой очищенной, как указано в фармакопейной статье или нормативной документации.

Основной стандартный раствор тиомерсала 1 мг/мл (раствор № 1). В мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 100 мг тиомерсала (точная навеска), растворяют в воде очищенной, доводят объем раствора водой очищенной до метки и перемешивают. Раствор хранят в склянке из темного стекла с притертой пробкой при температуре 4 — 8 °C в течение 1 мес.

Стандартный раствор тиомерсала 2 мкг/мл (раствор № 2). К 20 мкл стандартного раствора № 1 прибавляют 9,98 мкл воды очищенной и перемешивают. Раствор хранят в склянке из темного стекла с притертой пробкой при температуре 4 — 8 °C в течение 3 дней.

Стандартные образцы (СО) «Содержание тиомерсала в сорбированных препаратах» с диапазоном содержания тиомерсала от 20 до 120 мкг/мл. Перед использованием СО разводят согласно инструкции по применению. Раствор СО готовят и используют в день проведения анализа.

Метод атомно-абсорбционной спектроскопии холодного пара (ААС-ХП)

Основными стадиями метода атомно-абсорбционной спектроскопии холодного пара являются:

1. Минерализация — испытуемый образец минерализуют в кислой среде в присутствии окислителя (например, калия перманганата); в результате данного процесса ртуть переходит в ионную форму с образованием ионов ртути (II).

2. Восстановление — образец, содержащий ионы ртути (II), смешивают с восстанавливающим агентом (например, раствором олова (II) хлорида). В результате окислительно-восстановительной реакции, ионы ртути (II) восстанавливаются до атомарного состояния (Hg0) по следующей схеме:

Hg2+ + Sn2+ -> Hg0 + Sn4+.

3. Детектирование — потоком инертного газа (например, аргона) восстановленная ртуть переносится в оптическую ячейку, где происходит измерение абсорбции излучения атомами ртути с длиной волны 253,7 нм.

На определение отбирают 0,025 мл испытуемого раствора и помещают в мерную колбу вместимостью 50 мл, добавляют 0,15 мл 50% раствора серной кислоты, разбавленной по объему, 0,7 мл 5% раствора калия перманганата, перемешивают и выдерживают в течение 1 ч при комнатной температуре. Затем добавляют 0,2 мл 20% раствора гидроксиламина сульфата, перемешивают, доводят объем раствора 3% раствором хлористоводородной кислоты, разбавленной по объему до метки, и вновь перемешивают.

Анализ испытуемых образцов проводят в соответствии с инструкцией по эксплуатации оборудования с системой проточно-инжекционного типа, зарегистрированного в Государственном реестре средств измерений России. В процессе измерения аликвота образца отбирается из общего объема реакционной смеси автоматической системой прибора, смешивается в сепараторе с восстанавливающим реагентом (раствор олова (II) хлорида) и далее образовавшиеся пары ртути переносятся в измерительную ячейку, где происходит измерение поглощения излучения световых потоков атомами ртути при 253,7 нм.

Измерение испытуемых образцов проводят в 3-х повторностях в следующей последовательности: вода очищенная (используется в качестве контрольного раствора), калибровочные растворы (в порядке увеличения измеряемой концентрации) и испытуемый образец.

Содержание ртути в испытуемом образце (среднее значение) в мкг/мл вычисляют по калибровочному графику с помощью программного обеспечения к прибору.

Количество тиомерсала (C) в мкг/мл вычисляют по формуле:

C = \frac{X \cdot A \cdot 100}{N \cdot 49,55 \cdot 1000} ,

где X — количество ионов ртути, найденное по калибровочному графику, мкг/л;

N — объем испытуемого образца, мл;

A — конечный объем реакционной смеси, мл;

1000 — пересчет количества ртути на 1 мл;

100/49,55 — коэффициент пересчета ртути на тиомерсал.

Построение калибровочного графика. Отбирают 2,5; 12,5; 25; 37,5; 50 мкл стандартного раствора ионов ртути (10 мкг/мл) помещают в мерные колбы вместимостью 25 мл, добавляют 20 мл 3% раствора хлористоводородной кислоты и каплю 5% раствора калия перманганата, доводят объем раствора до метки 3% раствором хлористоводородной кислоты и перемешивают. Концентрации ионов ртути (II) в указанных растворах соответственно: 1,0; 5,0; 10; 15; 20 мкг/л. Строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс количество ртути в мкг/л, а по оси ординат — среднее значение оптической плотности атомного пара ртути. Измерения проводят, как указано выше. Калибровочный график воспроизводится при каждом определении.

Метод атомно-абсорбционной спектроскопии холодного пара (ААС-ХП) может быть применим и для анализа остаточного содержания тиомерсала в БЛП.

Примечания

Испытуемый раствор: 0,025 мл раствора испытуемого образца, приготовленного, как указано в фармакопейной статье или нормативной документации.

Приготовление 3% раствора хлористоводородной кислоты. В мерную колбу вместимостью 1000 мл вносят 700 мл воды очищенной, добавляют 30 мл хлористоводородной кислоты концентрированной, перемешивают и доводят объем раствора до метки водой очищенной и вновь перемешивают.

Приготовление 50% раствора кислоты серной (см. Примечания колориметрического метода, п. 9).

Приготовление 5% раствора калия перманганата (см. Примечания колориметрического метода, п. 5).

Приготовление 20% раствора гидроксиламина сульфата (см. Примечания колориметрического метода, п. 7).

Приготовление стандартного раствора ионов ртути (10 мкг/мл): стандартный раствор ионов ртути (II) готовят, используя стандарты ионов ртути для ААС или ГСО (1 г/л): в мерную колбу вместимостью 100 мл вносят 1 мл ГСО, доводят объем раствора 3% раствором хлористоводородной кислоты до метки и перемешивают.

Приготовление восстанавливающего реагента 1,1% раствор олова хлорида в 3% растворе хлористоводородной кислоты. В мерную колбу, вместимостью 1000 мл вносят 100 мл воды очищенной и постепенно при постоянном помешивании добавляют 11 г олова (II) хлорида, затем добавляют 30 мл концентрированной хлористоводородной кислоты, перемешивают, доводят объем водой очищенной до метки и вновь перемешивают.

Приготовление и количество испытуемого образца, соотношение реагентов и объем реакционной смеси, и другие реактивы могут быть изменены в зависимости от модели используемого оборудования.

Методы оценки качества тиомерсала

O-этилртутьтиосалицилат натрия М.м. 404,8 C9H9HgNaO2S

Описание. Белый порошок с легким кремовым оттенком со слабым характерным запахом.

Растворимость. 1 г реактива без остатка растворяется при температуре 18 — 22 °C в 1 мл воды, а также в 35 мл спирта. Раствор должен быть бесцветным или светло-желтым. Препарат почти не растворим в бензоле и эфире.

Значение pH 6,0 — 8,0. Используют 1% раствор на свежепрокипяченной воде очищенной. Определение проводят потенциометрическим методом в соответствии с ОФС «Ионометрия».

Подлинность. 0,05 г реактива растворяют в 5 мл воды очищенной. К раствору прибавляют 1,0 мл 10% раствора меди сульфата. Образуется осадок зеленого цвета.

Растворяют 0,5 г реактива в 10 мл воды очищенной и прибавляют 1 мл 2 М раствора хлористоводородной кислоты; выделившийся осадок отфильтровывают на воронке Бюхнера и промывают водой очищенной до исчезновения хлорид ионов. Осадок, высушенный до постоянной массы при комнатной температуре в присутствии фосфора (V) оксида при давлении не более 0,667 кПа (5,0 мм рт. ст.), имеет температуру плавления 110 °C.

Ртутные соли. Растворяют 0,1 г реактива в 5 мл воды очищенной. К раствору прибавляют 1 мл 5% свежеприготовленного раствора натрия сульфида. Выпавший осадок не должен изменять цвета при выдерживании в темном месте в течение 30 мин.

Растворимые в эфире вещества. 0,5 г реактива (точная навеска) встряхивают с 20 мл эфира в течение 10 мин, фильтруют через плотный фильтр. После испарения эфира остаток, высушенный в течение 22 — 24 ч в присутствии фосфора (V) оксида при давлении не более 0,667 кПа (5,0 мм рт. ст.) и комнатной температуре, должен весить не более 4 мг.

Потеря в массе при высушивании. Высушивают 0,5 г реактива в течение 24 ч в присутствии фосфора (V) оксида до постоянной массы. Потеря в массе при высушивании не должна превышать 0,5%. Определение проводят в соответствии ОФС «Потеря в массе при высушивании».

Количественное определение. Растворяют 0,3 г реактива (точная навеска) в 10 мл воды очищенной в термостойкой колбе или химическом стакане вместимостью 50 мл, прибавляют 1,5 г растертого калия перманганата и хорошо перемешивают. Через 5 мин в колбу осторожно прибавляют при постоянном перемешивании по каплям 5 мл серной кислоты концентрированной. Через 5 — 10 мин образовавшийся осадок растворяют при постепенном прибавлении 4 — 8 мл 3% раствора водорода пероксида. К обесцвеченному раствору прибавляют по каплям 5% раствор калия перманганата до исчезающего розового окрашивания. Раствор вновь обесцвечивают добавлением по каплям 4% раствора щавелевой кислоты. Полученный раствор после прибавления 5 мл 10% раствора квасцов железоаммонийных медленно титруют 0,1 М раствором аммония роданида до изменения окраски. 1 мл 0,1 М раствора аммония роданида соответствует 0,02024 г тиомерсала.

Высушенный в присутствии фосфора (V) оксида реактив должен содержать не менее 98% и не более 101% тиомерсала.

Хранение. ЯД! Хранят в банке с притертой пробкой, в защищенном от света сейфе. Реактив подвергают контролю 1 раз в 3 мес. Если тиомерсал не соответствует одному из перечисленных требований, его бракуют.