Наставление по исследованию кожевенного и мехового сырья на сибирскую язву реакцией преципитации

(утв. Минсельхозом СССР 25.05.1971)

НАСТАВЛЕНИЕ ПО ИССЛЕДОВАНИЮ КОЖЕВЕННОГО И МЕХОВОГО СЫРЬЯ НА СИБИРСКУЮ ЯЗВУ РЕАКЦИЕЙ ПРЕЦИПИТАЦИИ

Составители: Б.И. Антонов, В.В. Борисова, П.М. Волкова, Л.П. Каменева, Л.В. Кошеленко, Г.А. Михальский, В.В. Поповцев, Л.И. Прянишникова, В.Е. Храпов

В книге даны методы лабораторных исследований патологического материала с целью определения возбудителя инфекционной болезни. Они изложены по единой схеме: бактериологические и бактериоскопические исследования, биопроба, идентификация и дифференциация возбудителей. Методы унифицированы и стандартизированы.

Для ветврачей и фельдшеров, лаборантов ветеринарных лабораторий.

I. Прием проб на исследование

1. Пробы кожевенного и мехового сырья для исследования на сибирскую язву принимают ветеринарные лаборатории в порядке, установленном «Указаниями по ветеринарно-санитарной обработке заготовляемого кожевенного и мехового сырья», утвержденными Главным управлением животноводства и ветеринарии Минсельхоза СССР 30 декабря 1954 г.

Примечание. В случае несоблюдения установленных требований по отбору и пересылке проб для исследования ветеринарные лаборатории дают соответствующие указания предприятиям (заготовительным пунктам), приславшим пробы, а при необходимости могут требовать вторичного отбора и присылки проб.

2. Пробы от парного или мороженого сырья до стерилизации выдерживают для накопления преципитиногена в течение 2 сут при комнатной температуре (не ниже 20 °C).

При приеме и подготовке проб для исследования (до стерилизации) следует соблюдать все меры предосторожности, предусмотренные в отношении поступающего в лабораторию заразного материала.

II. Порядок исследования проб

3. Работа по исследованию проб кожевенного и мехового сырья на сибирскую язву реакцией преципитации как парного, так и консервированного (пресносухое, мороженое, сухосоленое, мокросоленое), слагается из следующих процессов: стерилизации, измельчения и экстрагирования проб, фильтрации экстрактов, соединения компонентов и учета результатов исследования.

4. Стерилизация проб. Исследуемые пробы стерилизуют в автоклаве при 1,5 атм в течение 30 мин или при 1 атм в течение 1 ч; на кожевенно-сырьевых заводах стерилизацию проб проводят в камерах Крупина под давлением 0,7 атм в течение 1 ч 45 мин при температуре 110 — 115 °C.

При стерилизации необходимо следить за тем, чтобы пробы не замокали. Для этого мокросоленое сырье стерилизуют в отдельной таре с решетчатой подставкой на дне или, при необходимости совместной стерилизации проб различной консервировки, его помещают в нижней части автоклава (камеры) также на решетчатой подставке и отделяют от другого сырья пергаментной бумагой, куском брезента и т.п.

По окончании экспозиции выключают автоклав (камеру), спускают пар и вынимают пробы.

О проведенной стерилизации проб и тары делают соответствующие записи в специальном журнале с указанием даты, организации, приславшей пробы, наименования стерилизуемого материала и режима, при котором проводилась стерилизация (экспозиция, показания термометра, манометра).

5. Измельчение проб. После стерилизации пробы охлаждают и проверяют наличие и правильность нумерации, затем их измельчают автоматическими или ручными приборами (предварительно удалив шерсть), учитывая, что чем мельче измельчены пробы, тем полнее будет экстрагирован антиген.

О проведенной проверке нумерации проб, обнаруженных неправильностях, а также о количестве измельченных проб делают отметку в рабочей тетради.

От каждой пробы пресносухого, сухосоленого, мороженого и парного сырья измельчают точно по массе 1 г и помещают в баночку емкостью 50 мл с соответствующим номером пробы.

Затвердевшие обеззараженные пробы пресносухого и сухосоленого сырья для удобства измельчения могут быть размягчены текучим паром в автоклаве однократно в течение 10 — 15 мин.

От каждой пробы мокросоленого сырья измельчают по 2 г, при этом простерилизованные мокросоленые пробы (на связке) непосредственно перед измельчением промывают в водопроводной воде (17 — 18 °C) в течение не более 25 — 30 с, перебирая их руками. Затем пробы слегка отжимают, перекладывают в сухой кювет и измельчают. Нельзя промывать пробы сразу после стерилизации — горячие, а также в теплой или горячей воде.

6. Кожевенное и меховое сырье пресносухой и сухосоленой консервировки разрешается исследовать сдвоенными пробами. Сдваивание проб при исследовании мороженого, парного и мокросоленого кожсырья не допускается.

7. При исследовании сдвоенных проб от каждой пробы измельчают по 1 г (в одну баночку 2 г).

8. Экстрагирование проб. При исследовании парного, мороженого, пресносухого, сухосоленого сырья применяют экстрагирующую жидкость, приготовленную путем добавления к физиологическому раствору (0,85%-ный раствор хлористого натрия на дистиллированной воде) 0,3% кристаллической карболовой кислоты. Для исследования мокросоленого сырья экстрагирующую жидкость готовят на дистиллированной воде с 0,3% карболовой кислоты без хлористого натрия.

Приготовленную экстрагирующую жидкость до заливки проб контролируют преципитирующей сывороткой. Правильно приготовленная экстрагирующая жидкость при наслаивании на преципитирующую сыворотку (или при подтаивании сыворотки) должна давать четкую границу без образования кольца.

9. Измельченные пробы заливают экстрагирующей жидкостью посредством разливательного прибора: пресносухое, сухосоленое, парное и мороженое — по 10 мл, а мокросоленое — по 7 — 8 мл.

Сдвоенные пробы пресносухого и сухосоленого сырья заливают 15 мл экстрагирующей жидкости. Содержимое каждой баночки обязательно взбалтывают для быстрейшего погружения в жидкость измельченных проб. Продолжительность экстрагирования — от 16 до 20 ч (холодный способ) при комнатной температуре (лучше 9 — 15 °C).

Пробы от свиных шкур экстрагируют горячим способом — в пробирках в кипящей водяной бане в течение 30 мин. Соотношение экстрагирующей жидкости и весь дальнейший порядок исследования свиных шкур аналогичны исследованию проб кожевенного и мехового сырья других видов животных с учетом консервировки.

10. Фильтрация экстрактов. После экстрагирования проб экстракты фильтруют через воронки диаметром 30 мм в укороченные бактериологические пробирки, укрепленные в отверстиях линеек аппаратуры Флоринского. Для удобства мойки и быстроты фильтрации рекомендуется воронки укреплять в покровных линейках резиновыми колечками.

В качестве фильтра применяют асбестовую вату, которую (при получении каждой новой партии) проверяют лакмусом на нейтральность. В случае кислой или щелочной реакции асбест перед работой промывают дистиллированной водой и физиологическим раствором, после этого отжимают и вновь проверяют на нейтральность. Плотность набивки фильтра должна обеспечивать возможность получения прозрачного экстракта в течение 1 — 2 ч. В крайнем случае (при отсутствии асбестовой ваты) в качестве фильтра может быть применен лигнин.

Перед разливом экстрактов на фильтры жидкость каждой баночки взбалтывают. При разливе нужно следить, чтобы жидкость не стекала на рядом стоящий фильтр.

При снятии фильтров (линеек с воронками) экстракты просматривают на количество и прозрачность. При наличии мутных экстрактов допускается вторичная их фильтрация. Количество экстракта, необходимое для исследования, должно быть 1/2 или 1/3 объема укороченной бактериологической пробирки.

III. Постановка реакции преципитации

11. Для постановки реакции преципитации применяют преципитирующую сибиреязвенную сыворотку, которая должна быть совершенно прозрачной, что достигается путем отстаивания ее во флаконах в течение 10 — 14 дн. с последующим осторожным декантированием верхнего слоя; в случае необходимости сыворотку можно фильтровать через асбестовую вату.

12. При исследовании сырья сухосоленой н мокросоленой консервировки к преципитирующей сыворотке добавляют 3 — 4%, а в некоторых случаях и до 5% х.ч. хлористого натрия. При исследовании сдвоенными пробами пресносухого сырья к сыворотке добавляют 1% хлористого натрия, сухосоленого — 3 - 5%. При индивидуальном исследовании пресносухого сырья, а также парного и мороженого, хлористый натрий к сыворотке не добавляют.

Неиспользованную в тот же день приготовленную преципитирующую сыворотку можно использовать на следующий день при условии хранения ее в закрытом сосуде в холодильнике.

13. Подготовленную преципитирующую сибиреязвенную сыворотку перед постановкой реакции преципитации с экстрактами из исследуемых проб проверяют на активность и специфичность:

стандартным сибиреязвенным антигеном — реакция положительная, т.е. характерное кольцо — диск появляется в течение 1 — 2 мин после соединения компонентов;

экстрактом заведомо благополучных боенских кож — реакция отрицательная при наблюдении в течение часа.

Результаты контроля преципитирующей сыворотки записывают в журнал лабораторных исследований.

14. Соединение компонентов проводят осторожным наслаиванием профильтрованных, прозрачных экстрактов на преципитирующую сыворотку, разлитую в специальные узкие пробирки (Уленгута).

Разлив сыворотки и наслаивание экстрактов проводят разливателем Флоринского одновременно в 10 пробирок по 0,25 — 0,3 мл каждого компонента. Вначале разливают сыворотку, а затем на нее наслаивают экстракты.

Начало и конец наслаивания каждой сотни экстрактов фиксируют на бумажном ярлыке, который вкладывают в соответствующий штатив с пробирками, например: 12 ч 15 мин — 12 ч 20 мин.

При исследовании небольшого количества проб можно пользоваться пастеровской пипеткой, при этом экстракт наслаивают на сыворотку или сыворотку подслаивают под экстракт.

Соединение компонентов — ответственный и важный момент в проведении исследований, и только наличие резко выраженной границы между компонентами (совершенно прямая линия) дает правильные результаты исследования. Если резко выраженная граница между компонентами отсутствует — необходимо провести повторное соединение компонентов.

15. Учет результатов исследования проводят путем просмотра исследуемых экстрактов на черном фоне при проходящем дневном свете у окна или при электрическом свете настольной лампы с абажуром.

16. При исследовании проб от парного, мороженого и пресносухого кожевенного сырья учет результатов проводят через 10 — 12 и не позднее 15 мин с момента соединения компонентов; от сухосоленого — через 30 мин; от мокросоленого — через 60 мин.

Результаты исследования сдвоенных проб пресносухой консервировки учитывают через 30 мин, а сухосоленой — через 60 мин.

17. Реакцию считают положительной, если на границе соприкосновения экстрактов с сывороткой в течение указанного времени появляется ясно выраженный серовато-белый диск (кольцо). При отрицательном результате на резко выраженной границе между компонентами незаметно никаких следов преципитации. В остальных случаях (слабо выраженное кольцо, помутнение в виде облачка и т.п.) реакцию считают сомнительной.

Результаты диагностической оценки записывают в журнал лабораторных исследований с обозначением в положительном случае (+) плюс, в сомнительном (+-) плюс-минус и в отрицательном (-) минус.

Примечание. Применяемые для консервирования сырья парадихлорбензол, кремнефтористый натрий, 10%-ный дуст (ДДТ) и нафталин не влияют на показания реакции преципитации.

IV. Проверочно-контрольные исследования

18. При получении положительных или сомнительных результатов исследования лаборатория должна немедленно потребовать вторично доставить пробы от соответствующих шкур для проверочно-контрольного исследования.

Окончательное заключение о тюке или штабеле, в котором была обнаружена хотя бы одна шкура, давшая положительную или сомнительную реакцию, лаборатория дает только после проверочно-контрольного исследования.

Для проверочно-контрольного исследования отбирают по три пробы с разных мест от шкуры, давшей положительную или сомнительную реакцию, причем одна проба должна быть взята с места первого среза. Использовать кусочки проб, оставшиеся от первого исследования, для проверочно-контрольного исследования не разрешается.

Диагностическую оценку осуществляют по результатам реакции трех проб. Если все три пробы от данной шкуры дают отрицательный результат — шкура считается благополучной в отношении сибирской язвы независимо от положительного результата реакции преципитации при первом исследовании.

В том случае, когда хотя бы в одной пробе из трех будет получен положительный результат исследования — шкура считается неблагополучной в отношении сибирской язвы.

19. Если при контрольно-проверочном исследовании проб от шкурок мерлушки или козлика получен положительный результат, то пробы от этих шкурок подвергают обязательному бактериологическому исследованию на сибирскую язву. При отрицательном результате бактериологического исследования такие шкуры считают благополучными в отношении сибирской язвы, и их выпускают без ограничений.

Результаты проверочно-контрольного исследования вносят в журнал лабораторных исследований.

20. По окончании исследования лаборатория сообщает о полученных результатах ветеринарному врачу, приславшему пробы, с точным указанием серий, номеров и количества исследованных проб и номеров шкур, от которых требуется вторичная доставка проб.

О шкурах, давших при контрольном исследовании положительную реакцию, лаборатория обязана сообщить также и главному ветеринарному врачу района (города), по месту нахождения кожевенного предприятия (заготовительного пункта).

21. Вся посуда, употребляемая для исследования, должна быть чистой и прозрачной. Для этого ее промывают в теплой соленой воде (1 — 2%-ном растворе поваренной соли) при помощи волосяных ершей и щеток с последующим промыванием в чистой воде. Уленгутовские пробирки, кроме того, промывают в дистиллированной воде. После мытья посуду просушивают.

22. Преципитирующую сибиреязвенную сыворотку и стандартный сибиреязвенный антиген хранят в темном месте при температуре не ниже 2° и не выше 15 °C. Сыворотка, подвергшаяся замораживанию, к применению непригодна.

I. Компоненты (должны быть прозрачны)

1. Экстракты кож. Экстрагирующую жидкость для парного, мороженого,

   пресносухого,  сухосоленого  сырья  готовят  на физиологическом растворе
   NaCl  с  добавлением  0,3%  кристаллической  карболовой  кислоты,  а для
   мокросоленого  сырья  -  0,3%-ный   раствор  кристаллической  карболовой

кислоты на дистиллированной воде.

2. Преципитирующая сибиреязвенная сыворотка. Для сухосоленого и мокросоленого сырья с добавлением х.ч. поваренной соли (NaCl) от 3 до 5%; для пресносухого сдвоенными пробами — 1%.

II. Контроли

1. Преципитирующей сибиреязвенной сыворотки:

а) со стандартным сибиреязвенным антигеном (+) в течение 1 — 2 мин;

б) с экстрактом заведомо благополучных боенских кож (-) в течение часа;

в) с экстрагирующей жидкостью (-) в течение часа.

2. Асбестовой ваты на нейтральность (при поступлении каждой новой партии).

> В автоклаве
III. Стерилизация проб		> 1,0 атм 1 ч

                        при 110 - 115 °C 0,7 атм 1 ч 45 мин

IV. Измельчение проб (навеска)	сухосоленого сырья 1 г

V

   Парного, мороженого 10 мл      Мокросоленого: одиночных 7 - 8 мл

              V                             V
   Пресносухого: одиночных 10 мл  Сухосоленого: одиночных 10 мл
                 сдвоенных 15 мл                сдвоенных 15 мл

                 V                      V
    Холодный способ: 16 - 20 ч    Горячий способ: от свиных шкур
    при комнатной температуре     в водяной бане кипятить

в течение 30 мин

баночек взбалтывать

                                 до прозрачности экстрактов

              V                         V
        Наслаивание:                Подслаивание:
        разливателем Флоринского    пастеровской пипеткой экстракта
        или пастеровской пипеткой   0,25 - 0,3 мл, сыворотки
        сыворотки 0,25 - 0,3 мл,    0,25 - 0,3 мл

экстракта 0,25 — 0,3 мл

V

Парное, мороженое: через 10 — 15 мин Пресносухое: одиночных -

в течение 10 — 15 мин, сдвоенных — через 30 мин

          V                                    V
    Сухосоленое: одиночных - через         Мокросоленое: через 60 мин

             30 мин

сдвоенных — через 60 мин

---