МУК 4.2.3917-23. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации Rhodococcus erythropolis OPI-01 ВКПМ Ас-2143 в воздухе рабочей зоны. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 29.06.2023)
Примечание
Документ введен в действие с 29.09.2023.
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 29 июня 2023 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS OPI-01 ВКПМ АС-2143 В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.3917-23
Дата введения 29 сентября 2023 года
1. Разработаны ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России (д.б.н. Н.И. Шеина).
2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 июня 2023 г.
I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Rhodococcus erythropolis OPI-01 ВКПМ Ас-2143 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 м3 воздуха.
1.2 МУК носят рекомендательный характер.
II. БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS OPI-01 ВКПМ Ас-2143
2.1. Штамм Rhodococcus erythropolis OPI-01 <1> (далее — музейный штамм) планируется использовать штамм для создания микробиологического биопрепарата, действие которого направлено на деградацию гербицидов класса имидазолинов и стимуляцию роста растений.
<1> Штамм Rhodococcus erythropolis OPI-01 депонирован в Национальном биоресурсном центре Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (БРЦ ВКПМ) НИЦ «Курчатовский институт» — ГосНИИгенетика под номером ВКПМ Ас-2143.
2.2. Штамм Rhodococcus erythropolis OPI-01 выделен из ризосферной почвы, обработанной гербицидом имазетапир, где произрастала соя (Glycine max).
2.3. По результатам изучения культурально-морфологических и биохимических свойств выделенный штамм наиболее близок к видам, Rhodococcus erythropolis, Rhodococcus jialingiae и Rhodococcus qingshengii. По анализу секвенсов вариабельных участков генов, кодирующих 16S рРНК, тестируемый штамм является Rhodococcus erythropolis (99,5%). Тестирование на соответствие биохимических признаков с использованием набора реагентов Himedia HiCarbo KB009B1 показало, что виды Rhodococcus erythropolis и Rhodococcus jialingiae являются синонимами. На этом основании возможно для контроля воздушной среды использовать «Микробиологическое измерение концентрации клеток микроорганизма Rhodococcus jialingiae lkp ВКПМ Ас-1957 в воздухе рабочей зоны» <2>.
<2> МУК 4.2.3248-14 «Микробиологическое измерение концентрации клеток микроорганизма Rhodococcus jialingiae lkp ВКПМ Ас-1957 в воздухе рабочей зоны», утвержденные руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 30.12.2014.
2.4. Макроскопически колонии штамма округлые, непрозрачные, слизистые, блестящие, плоские, вершина приподнята, края ровные, окраска кремовая, густой маслянистой консистенции, со временем приобретают розоватый оттенок. Микроскопически культура представлена грамположительными короткими палочками неправильной часто V-образной формы, споры отсутствуют, по Граму окрашиваются положительно. В молодой культуре палочки проявляют склонность к ветвлению (образование примитивного мицелия), диаметр клеток 0,6 — 0,8 мкм, длина в среднем составляет 4 — 8 мкм, в случае примитивного мицелия до 10 — 12 мкм. Цикл развития хорошо выражен, на ранних стадиях (20 — 24 часа) наблюдается элементарное ветвление, в дальнейшем (3 — 4 сутки) происходит распад длинных клеток на палочковидные элементы.
2.5. Оптимальной твердой средой для выращивания и размножения штамма является мясо-пептонный агар (далее — МПА) (г/л): среда пептон — 20,0 г, глюкоза — 10,0 г, хлорид натрия — 5,0 г, агар-агар — 15,0 г, дистиллированная вода — 1000 мл, можно использовать стандартную глюкозо-пептонную среду — размешать 50,0 г порошка М649 в 1000 мл дистиллированной воды.
2.6. Штамм Rhodococcus erythropolis OPI-01 относится к микроорганизмам, непатогенным для человека <3>. Работа со штаммом не требует специальных мер предосторожности.
<3> Согласно классификации микроорганизмов, приведенных в СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней», утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 № 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021 № 62500) (далее — СанПиН 3.3686-21).
III. ПРЕДЕЛЫ ИЗМЕРЕНИЙ
3.1. Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток микроорганизма в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
IV. МЕТОД ИЗМЕРЕНИЙ
4.1. Метод основан на аспирации из воздуха рабочей зоны клеток микроорганизма и подсчета количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам на МПА. При наличии в воздухе высоких концентраций штамма возможно использование седиментационного метода Коха.
V. СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ, ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА, РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ
5.1. При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы, приведенные в таблицах 1 - 3.
| Наименование средств измерения | Обозначение и наименование документов |
|---|---|
| Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 — 790 мм рт. ст. и с пределом допустимой погрешности +/- 2,5 мм рт. ст. | ТУ 2504-1799 |
| Весы лабораторные, аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности +/- 0,2 мг | ГОСТ Р 53228 |
| Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2 | ГОСТ 1770 |
| Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0, 2,0, 5,0, 10 см3 | ГОСТ 29227 |
| Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см3 | ГОСТ 1770 |
| Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0 — 55 °C | ТУ 25-2021.003 |
| Аспирационный бактериологический пробоотборник (со скоростью до 40 л/мин, расход регулируется по ротаметру, диаметр чашек Петри 90, 100, 120 мм, определение в диапазоне 25 — 10000 кл/м3) | - |
Примечание: допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
Вспомогательные устройства и материалы
| Наименование аппаратуры и материалов | Обозначение и наименование документов |
| Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру плюс (160 +/- 5) °C | ТУ 9452-010-00141798 |
| Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру плюс (28 +/- 2) °C и плюс (37 +/- 2) °C | ТУ 9452-002-00141798 |
| Автоклав электрический | ГОСТ 9586 |
| Стерилизаторы паровые медицинские | ГОСТ Р ЕН 13060 ГОСТ Р 51935 |
| Дистиллятор | ТУ 4952-007-33142130 |
| Облучатель бактерицидный настенный | ТУ 9444-015-03965956 |
| Холодильник бытовой | ГОСТ 26678 |
| Микроскоп биологический с иммерсионной системой | |
| Лупа с увеличением x10 | ГОСТ 25706 |
| Пробирки типов П1, П2 | ГОСТ 25336 |
| Спиртовки лабораторные стеклянные | ГОСТ 23932 |
| Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов | ГОСТ 23932 |
| Воронки конусные диаметром 40 — 45 мм | ГОСТ 25336 |
| Груша резиновая | ТУ 9398-005-0576 |
| Петля бактериологическая | - |
| Марля медицинская | ГОСТ 9412 |
| Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556 | |
| Бумага фильтровальная лабораторная | ГОСТ 12026 |
| Примечание: допускается применение устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками. | |
| Наименование реактивов и питательных сред | Обозначение и наименование документов |
|---|---|
| Агар микробиологический | ГОСТ 17206 |
| Вода дистиллированная | ГОСТ 6709 |
| Мясо-пептонный бульон (МПБ) | ГОСТ 20730 |
| Натрий углекислый Na2CO3 | ГОСТ 83 |
| Спирт этиловый технический | ГОСТ 17299 |
| Спирт этиловый ректификованный | ГОСТ Р 51652 или ГОСТ 18300 |
Примечание: допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.
VI. ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ
6.1. При выполнении измерений концентрации клеток микроорганизма в атмосферном воздухе городских и сельских поселений соблюдают законодательство в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения <4>.
<4> СанПиН 3.3686-21; ГОСТ 12.1.005 «Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны», утв. и введен в действие Постановлением Госстандарта СССР от 29.09.1988 № 3388.
6.2. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования по электробезопасности при работе с электроустановками <5> и инструкции по эксплуатации прибора.
<5> ГОСТ 12.1.019 «Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты», введен в действие Приказом Росстандарта от 07.11.2018 № 941-ст.
6.3. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
6.4. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
VII. УСЛОВИЯ ИЗМЕРЕНИЙ
7.1 Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:
| - температура воздуха | плюс (20 +/- 5) °C; |
|---|---|
| - атмосферное давление | 760 +/- 20 мм рт. ст.; |
| - влажность воздуха | не более 80%. |
VIII. ПРИГОТОВЛЕНИЕ МЯСО-ПЕПТОННОГО АГАРА (МПА)
8.1. Для приготовления МПА на 1000 см3 мясо-пептонного бульона добавляют 20 г агар-агара и помешивая нагревают до полного растворения агара.
8.2. По каплям добавляют 20% раствор Na2CO3, устанавливая слабо щелочную среду pH 7,2 +/- 0,1.
8.3. Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 — 500 см3 и автоклавируют при плюс 120 °C в течение 15 — 20 мин.
8.4. Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше плюс 8 °C в течение 10 дней не более.
IX. ПРОВЕДЕНИЕ ИЗМЕРЕНИЯ
9.1. Отбор проб воздуха. Отбор проб воздуха проводят в соответствии с МУК 4.2.1054-01 и ГОСТ 8.563-09.
Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.
Время и скорость отбора проб воздуха
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96% этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с Инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2 Выполнение анализа.
9.2.1. При выполнении анализа воздуха стерильную агаризованную среду (МПА) расплавляют, остужают до плюс 50 — 60 °C и разливают в чашки Петри.
9.2.2. Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с методами контроля <6>. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре плюс 37 °C не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре плюс (2 — 8) °C не более 10 дней.
<6> Пункт 7.1.1 МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред», утвержденных руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 18.01.2008 (далее - МУК 4.2.2316-08).
9.2.3. После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой плюс 30 +/- 2 °C. Через 1 — 3 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.
9.2.4. Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии ростовыми свойствами питательных сред <7>. Для этого музейный штамм Rhodococcus erythropolis OPI-01 ВКПМ Ас-2143 высевается на 2 — 3 чашки используемой среды.
<7> МУК 4.2.2316-08.
9.2.5. Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 — 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.
9.2.6. Идентификацию штамма до вида можно проводить с помощью анализа 16S РНК на основе ПЦР-реакции.
XI. ВЫЧИСЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЯ
11.1 Расчет концентрации клеток производят по формуле:
\text{К } = \frac{\text{П } \times 1000}{\text{С } \times \text{Т}} , (1)
где: К — концентрация штамма в воздухе, кл/м3;
П — количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;
1000 — коэффициент пересчета дм3 на м3 воздуха;
С — скорость аспирации воздуха, дм3/мин;
XI. ОФОРМЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ
11.1. Результаты измерений оформляют протоколом, приведенным в приложении к настоящим МУК.
ПРИМЕР ОФОРМЛЕНИЯ ПРОТОКОЛА N КОЛИЧЕСТВЕННОГО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО АНАЛИЗА RHODOCOCCUS ERYTHROPOLIS OPI-01 ВКПМ Ас-2143 В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
1. <a id="p100184"></a>Дата проведения анализа ____________________________________________
2. <a id="p100185"></a>Рабочее место (профессия работающего) ______________________________
3. <a id="p100186"></a>Место отбора пробы (название и адрес организации, производство,
технологическая стадия, точка отбора пробы) _______________________________
3. <a id="p100187"></a>Вид пробоотборника _________________________________________________
4. <a id="p100188"></a>Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб
5. <a id="p100189"></a>Питательная среда, время инкубации _________________________________
6. <a id="p100190"></a>Результаты испытания ростовых свойств питательной среды
7. <a id="p100191"></a>Количественная и качественная характеристика выросших колоний
(количество типичных колоний) _____________________________________________
8. <a id="p100192"></a>Результаты идентификации микроорганизмов Rhodococcus erythropolis
OPI-01 (морфологические признаки) _________________________________________
9. <a id="p100193"></a>Результаты расчета концентрации штамма _____________________________
11. <a id="p100195"></a>Отбор пробы произведен (ФИО, должность, дата, подпись)
12. <a id="p100196"></a>Идентификация штамма и расчет концентрации произведены (ФИО,
должность, дата, подпись) _________________________________________________