МУК 4.2.3909-23. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации штамма Pseudomonas Aureofaciens ИМВ 2687 ВКПМ B-2883, активной субстанции биопрепарата Экстра Ps в атмосферном воздухе городских и сельских поселений. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 29.06.2023)
Примечание
Документ введен в действие с 29.09.2023.
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 29 июня 2023 года
Дата введения 29 сентября 2023 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ ШТАММА PSEUDOMONAS AUREOFACIENS ИМВ 2687 ВКПМ B-2883, АКТИВНОЙ СУБСТАНЦИИ БИОПРЕПАРАТА ЭКСТРА PS В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ ГОРОДСКИХ И СЕЛЬСКИХ ПОСЕЛЕНИЙ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.3909-23
1. Разработаны ФГАОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России (д.б.н. Н.И. Шеина); ФБУН «Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана» Роспотребнадзора (к.м.н. А.Л. Мишина).
2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 29 июня 2023 г.
I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ И ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации штамма Pseudomonas aureofaciens ИМВ 2687 ВКПМ B-2883 активной субстанции биопрепарата Экстра Ps в атмосферном воздухе городских и сельских поселений в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 м3 воздуха.
1.2 МУК носят рекомендательный характер.
II. БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ШТАММА PSEUDOMONAS AUREOFACIENS ИМВ 2687 ВКПМ B-2883
2.1. Штамм Pseudomonas aureofaciens ИМВ 2687 <1> является активной субстанцией биопрепарата Экстра Ps <2>. Содержание жизнеспособных клеток бактерий не менее 107 КОЕ/мл. В состав препарата кроме основного компонента Pseudomonas aureofaciens ИМВ 2687 ВКПМ B-2883 входит вспомогательный компонент-стабилизатор — водный экстракт полыни однолетней (Artemisia annua), 1% общей массы.
<1> Штамм депонирован во ФГУП ГосНИИГенетика под номером ВКПМ B-2883.
<2> Согласно ТУ 20.20.19-010-0139241345.
2.2. Биопрепарат является микробиологическим удобрением. Применяется в сельскохозяйственном производстве и в личных подсобных хозяйствах для предпосевной (предпосадочной) обработки семян (посадочного материала), полива почвы, некорневой и корневой подкормки вегетирующих растений, выращиваемых на различных типах почв в открытом и защищенном грунте.
2.3. Штамм Pseudomonas aureofaciens ИМВ 2687 ВКПМ B-2883 представлен аэробными грамотрицательными подвижными палочками со жгутиками, расположенными на полюсах клетки. Колонии желтоватые, гладкие, округлые, блестящие, пастообразные диаметром до 10 мм с крупно-волнистым краем. С возрастом колонии становятся неправильной формы красно-коричневого цвета за счет образования смеси феназин-карбоновых кислот.
2.4. Pseudomonas aureofaciens штамм ИМВ 2687 выделен из ризосферы капусты. Оптимальной твердой средой для выращивания и размножения штамма является агар Эндо-ГРМ. Состав агара Эндо-ГРМ <3> (г/дм3): панкреатический гидролизат рыбной муки — 12,0, дрожжевой экстракт — 1,0, натрия хлорид — 3,4, Д-(+)-лактоза — 10,0, натрия сульфит, безводный — 0,8, натрия фосфат 2-замещенный 12-водный — 0,5, фуксин основной — 0,2, агар — 10,0 +/- 3,0. pH 7,4 +/- 0,2.
<3> Согласно ТУ 9398-027-78095326.
2.5. Штамм относится к микроорганизмам, не патогенным для человека <4>. Работа со штаммом не требует специальных мер предосторожности.
<4> Согласно классификации микроорганизмов, приведенных в СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней», утвержденные постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 № 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021 № 62500) (далее — СанПиН 3.3686-21).
III. ПРЕДЕЛЫ ИЗМЕРЕНИЙ
3.1. Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток микроорганизма в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
IV. МЕТОДЫ ИЗМЕРЕНИЙ
4.1. Метод основан на аспирации из атмосферного воздуха клеток микроорганизма и подсчета общего количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам на агаризованной среде Эндо-ГРМ. При наличии в воздухе высоких концентраций штамма возможно использование седиментационного метода Коха.
V. СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ, ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА, РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ
5.1. При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы, приведенные в таблицах 1 - 3.
| Наименование средств измерения | Обозначение и наименование документов |
|---|---|
| Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 — 790 мм рт. ст. и с пределом допустимой погрешности +/- 2,5 мм рт. ст. | ТУ 2504-1799 |
| Весы лабораторные, аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности +/- 0,2 мг | ГОСТ Р 53228 |
| Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2 | ГОСТ 1770 |
| Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0, 2,0, 5,0, 10 см3 | ГОСТ 29227 |
| Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см3 | ГОСТ 1770 |
| Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения плюс 0 — 55 °C | ТУ 25-2021.003 |
| Аспирационный бактериологический пробоотборник (со скоростью до 40 л/мин, расход регулируется по ротаметру, диаметр чашек Петри 90, 100, 120 мм, определение в диапазоне 25 — 10000 кл./м3) | - |
Примечание: допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
Вспомогательные устройства и материалы
| Наименование аппаратуры и материалов | Обозначение и наименование документов |
|---|---|
| Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру плюс (160 +/- 5) °C | ТУ 9452-010-00141798 |
| Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру плюс (28 +/- 2) °C и плюс (37 +/- 2) °C | ТУ 9452-002-00141798 |
| Автоклав электрический | ГОСТ 9586 |
| Стерилизаторы паровые медицинские | ГОСТ Р ЕН 13060; ГОСТ Р 51935 |
| Дистиллятор | ТУ 4952-007-33142130 |
| Облучатель бактерицидный настенный | ТУ 9444-015-03965956 |
| Холодильник бытовой | ГОСТ 26678 |
| Микроскоп биологический с иммерсионной системой | - |
| Лупа с увеличением x 10 | ГОСТ 25706 |
| Пробирки типов П1, П2 | ГОСТ 25336 |
| Спиртовки лабораторные стеклянные | ГОСТ 23932 |
| Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов | ГОСТ 23932 |
| Воронки конусные диаметром 40 — 45 мм | ГОСТ 25336 |
| Груша резиновая | ТУ 9398-005-0576-908 |
| Петля бактериологическая | - |
| Марля медицинская | ГОСТ 9412 |
| Вата медицинская гигроскопическая | ГОСТ 25556 |
| Бумага фильтровальная лабораторная | ГОСТ 12026 |
Примечание: допускается применение устройств и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
| Наименование реактивов и питательных сред | Обозначение и наименование документов |
|---|---|
| Вода дистиллированная | ГОСТ 6709 |
| Агар Эндо-ГРМ | ТУ 9398-027-78095326 |
| Спирт этиловый технический | ГОСТ 17299 |
| Спирт этиловый ректификованный | ГОСТ Р 51652 |
Примечание: допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.
VI. ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ
6.1. При выполнении измерений концентрации клеток микроорганизма в атмосферном воздухе городских и сельских поселений соблюдают законодательство в области обеспечения санитарно-эпидемиологического благополучия населения <5>.
<5> СанПиН 3.3686-21; ГОСТ 12.1.005 «Система стандартов безопасности труда (ССБТ). Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны», утв. и введен в действие Постановлением Госстандарта СССР от 29.09.1988 № 3388.
6.2. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования по электробезопасности при работе с электроустановками <6> и инструкции по эксплуатации прибора.
<6> ГОСТ 12.1.019 «Межгосударственный стандарт. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты», введен в действие Приказом Росстандарта от 07.11.2018 № 941-ст.
6.3. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
6.4. К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
VII. УСЛОВИЯ ИЗМЕРЕНИЙ
7.1 Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:
- <a id="p100115"></a>температура воздуха плюс (20 +/- 5) °C;
- <a id="p100116"></a>атмосферное давление 760 +/- 20 мм рт. ст.;
- <a id="p100117"></a>влажность воздуха не более 80%.
VIII. ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПЛОТНОЙ СРЕДЫ ЭНДО-ГРМ
8.1. Для приготовления агаризованной среды Эндо-ГРМ на 1,0 дм3 дистиллированной воды добавляют сухой агар Эндо-ГРМ согласно инструкции, прилагаемой к питательной среде. Помешивая, нагревают до полного растворения агара. В готовой среде pH 7,4 +/- 0,2.
8.2. Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 — 500 см3 и автоклавируют при плюс 120 °C в течение 15 — 20 мин.
8.3. Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше плюс 8 °C в течение 10 дней, не более.
IX. ПРОВЕДЕНИЕ ИЗМЕРЕНИЯ
9.1. Отбор проб воздуха. Отбор проб воздуха проводят в соответствии с МУК 4.2.1054-01 и ГОСТ 8.563-09.
Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависят от предполагаемой концентрации микроорганизма (таблица 4).
Время и скорость отбора проб воздуха
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96° этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с Инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2 Выполнение анализа.
9.2.1. При выполнении анализа воздуха стерильную агаризованную среду расплавляют, остужают до плюс 50 — 60 °C и разливают в чашки Петри.
9.2.2. Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с методами контроля <7>. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре плюс 37 °C не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2 — 8) °C не более 10 дней.
<7> Пункт 7.1.1 МУК 4.2.2316-08 «Методы контроля бактериологических питательных сред», утвержденных руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 18.01.2008 (далее — МУК 4.2.2316-08).
9.2.3. После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой плюс 28 +/- 2 °C. Через 1 — 3 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.
9.2.4. Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии ростовыми свойствами питательных сред <8>. Для этого музейный штамм, входящий в состав препарата, высевается на 2 — 3 чашки используемой среды.
<8> МУК 4.2.2316-08.
9.2.5. Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 — 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.
9.2.6. Идентификацию штаммов до вида можно проводить с помощью анализа 16S РНК с помощью ПЦР-реакции.
X. ВЫЧИСЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЯ
10.1 Расчет концентрации клеток производят по формуле:
\text{К} = \frac{\text{П } \times 1000}{\text{С } \times \text{Т}} , (1)
где: К — концентрация штамма в воздухе, кл./м3;
П — количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;
1000 — коэффициент пересчета дм3 на м3 воздуха;
С — скорость аспирации воздуха, дм3/мин;
XI. ОФОРМЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗМЕРЕНИЙ
11.1. Результаты измерений оформляют протоколом, приведенным в приложении к настоящим МУК.
Пример оформления протокола № количественного микробиологического анализа штамма Pseudomonas aureofaciens ИМВ 2687 ВКПМ B-2883 в атмосферном воздухе городских и сельских поселений
1. <a id="p100177"></a>Дата проведения анализа ____________________________________________
2. <a id="p100178"></a>Место отбора пробы (название и адрес организации, производство,
технологическая стадия, точка отбора пробы) _______________________________
3. <a id="p100180"></a>Вид пробоотборника _________________________________________________
4. <a id="p100181"></a>Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора
проб ______________________________________________________________________
5. <a id="p100182"></a>Питательная среда, время инкубации _________________________________
6. <a id="p100183"></a>Результаты испытания ростовых свойств питательной
среды _____________________________________________________________________
7. <a id="p100184"></a>Количественная и качественная характеристика выросших колоний
(количество типичных колоний) _____________________________________________
8. <a id="p100185"></a>Результаты идентификации микроорганизма препарата
(морфологические признаки) ________________________________________________
9. <a id="p100186"></a>Результаты расчета концентрации штамма _____________________________
11. <a id="p100188"></a>Отбор пробы произведен (ФИО, должность, дата, подпись) ____________
12. <a id="p100189"></a>Идентификация штамма и расчет концентрации произведены (ФИО,
должность, дата, подпись) _________________________________________________