МУК 4.2.3854-23. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Лабораторная диагностика особо опасных микозов. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 31.05.2023)
Примечание
Документ введен в действие с 31.08.2023.
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 31 мая 2023 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ОСОБО ОПАСНЫХ МИКОЗОВ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.3854-23
Дата введения 31 августа 2023 года
Методические указания разработаны ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (И.В. Новицкая, А.В. Топорков, А.В. Липницкий, Н.В. Половец, Г.А. Ткаченко, Т.Н. Шаров, И.М. Шпак, А.А. Муругова, Л.В. Рябинина, Д.Л. Терешко).
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) определяют методы диагностических исследований, направленных на выявление возбудителей особо опасных (эндемических) микозов, и порядок забора, хранения, транспортирования и выполнения лабораторных исследований биологического материала от больных и умерших людей, животных с подозрением на инфицированность возбудителями особо опасных микозов (Coccidioides spp., Histoplasma spp., Blastomyces spp., Paracoccidioides spp.), а также смывов с объектов окружающей среды, подозрительных на контаминацию этими микромицетами.
1.2 МУК носят рекомендательный характер.
2.1. К особо опасным (эндемическим) микозам относятся кокцидиоидомикоз, гистоплазмоз, бластомикоз и паракокцидиоидомикоз. Эти микозы вызывают микроскопические грибы II группы патогенности (опасности) <1>, относящиеся к одному порядку, имеющие общие характеристики и занимающие специфические экологические ниши в определенных регионах мира.
<1> Приложение 1 СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней», утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 28.01.2021 № 4 (зарегистрировано Минюстом России 15.02.2021, регистрационный № 62500), с изменениями, внесенными постановлениями Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 11.02.2022 № 5 (зарегистрировано Минюстом России 01.03.2022, регистрационный № 67587); от 25.05.2022 № 16 (зарегистрировано Минюстом России 21.06.2022, регистрационный № 68934) (далее — СанПиН 3.3686-21).
2.2. Возбудители особо опасных микозов (грибы родов Coccidioides, Histoplasma, Blastomyces и Paracoccidioides) являются первичными патогенами, вызывающими заболевание у субъектов с неповрежденной иммунной системой, однако тяжелые (диссеминированные) формы этих микозов с высокой летальностью чаще отмечаются у лиц с различными видами иммуносупрессии.
2.3. Особо опасные микозы относятся к сапронозам. В естественных условиях их возбудители растут и размножаются в почвах соответствующих эндемичных регионов мира. Возбудители всех особо опасных микозов — диморфные грибы, которые во внешней среде существуют в виде мицелиальной (сапробной) формы, а в организме человека и животных трансформируются в тканевую (паразитическую) фазу развития.
2.4. Особо опасные микозы развиваются преимущественно после вдыхания из внешней среды фрагментов мицелия грибов, преимущественно в виде спор. Передача инфекции от человека к человеку не зарегистрирована.
2.5. Клинические формы особо опасных микозов связаны в основном с поражениями дыхательных путей, не отличаются специфичностью и схожи с проявлениями заболеваний вирусной или бактериальной природы.
2.6. Методы лабораторной диагностики включают способы микроскопической (морфологической) и патогистологической характеристики возбудителей, их культивирование in vitro на питательных средах, оценку вирулентности при заражении экспериментальных животных, иммунологические методы выявления антигенов и антител, молекулярно-генетические и масс-спектрометрические исследования.
2.7. В мицелиальной фазе роста возбудители особо опасных микозов являются аэробами, хотя могут развиваться и в условиях недостатка кислорода (факультативные анаэробы). Грибы в сапробной форме растут на простых питательных средах (приложение 1 к настоящим МУК) в широком диапазоне температур от плюс 4 °C и до плюс 41 °C и pH среды от 3,5 до 9,0; для культивирования in vitro тканевых форм микромицетов используются специальные среды (Конверса — для сферул Coccidioides spp., Френсиса — для дрожжеподобных клеток Histoplasma spp., Blastomyces spp., Paracoccidioides spp.) (приложение 1 к настоящим МУК). Оптимальные условия роста мицелиальной фазы — температура плюс 26 — 28 °C, pH 6,8 — 7,2; тканевой фазы — плюс 37 °C, pH 6,8.
2.8. Таксономическое положение возбудителей особо опасных микозов представлено в табл. 1.
Систематика возбудителей особо опасных микозов
2.9. В связи с отсутствием сведений о наличии природных источников возбудителей особо опасных микозов и автохтонных случаев заболеваний на территории Российской Федерации основой для лабораторной диагностики этих микозов являются данные эпидемиологического анамнеза пациента, свидетельствующие о его пребывании в эндемичных регионах (место и страна пребывания с учетом последующего инкубационного периода микоза). Возможна латентная (скрытая) форма микоза, манифестация которой может произойти спустя длительный период времени (месяцы, годы) при наличии факторов риска, связанных с иммуносупрессией и рядом хронических заболеваний.
2.10. Кокцидиоидомикоз (синонимы: болезнь Посадас-Вернике, лихорадка Сан-Иоахима, кокцидиоидная гранулема, долинная лихорадка, пустынный ревматизм, кокцидиоидоз) — инфекционное заболевание, вызываемое двумя видами микромицетов — C. immitis и C. posadasii. Оба вида фенотипически идентичны и идентифицируются только молекулярно-генетическими методами. Клиническая картина при заражении разными видами возбудителя не различается.
2.11. Около 60% случаев первичных инфекций, вызванных Coccidioides spp., протекают бессимптомно [27]. У большинства заболевших после инкубационного периода в течение 7 — 20 дней появляются гриппоподобные симптомы (кашель, повышение температуры, боли в груди, слабость, потеря аппетита), которые разрешаются без применения лекарственных препаратов. В 5% случаев развивается хроническая прогрессирующая пневмония, нередко с образованием легочных каверн, поражением суставов и появлением узловатой или многоформной кожной эритемы (преимущественно в области головы, шеи, конечностей). Внелегочная диссеминация возбудителя сопровождается вовлечением в процесс многих органов с образованием в них кокцидиоидомикозных гранулем, склонных к гнойному расплавлению, что может приводить к развитию тяжелого генерализованного сепсиса, наиболее опасным осложнением которого является гнойный менингит, который регистрируется у 1% больных. Афроамериканцы и филиппинцы имеют генетическую предрасположенность к развитию диссеминированных форм заболевания.
Для лечения кокцидиоидомикоза используются антимикотики двух классов: амфотерицин B и производные триазола (итраконазол, позаконазол, вориконазол, флуконазол).
2.12. Эндемичные по кокцидиоидомикозу территории включают в себя пустынную и полупустынную часть юго-запада США (штаты Калифорния, Невада, Юта, Нью-Мексико, Техас, Джорджия, Аризона). Вне США возбудители кокцидиоидомикоза встречаются в странах Центральной и Южной Америки (Мексика, Бразилия, Венесуэла, Гватемала, Аргентина, Парагвай, Гондурас).
2.13. Гистоплазмоз (синонимы: болезнь Дарлинга, цитоплазмоз Дарлинга, цитомикоз Дарлинга, ретикулоэндотелиальный цитомикоз) — инфекционное заболевание, вызываемое двумя вариантами H. capsulatum — var. capsulatum и var. duboisii.
2.14. Инкубационный период составляет от 2 до 4 недель. Спектр клинических проявлений гистоплазмоза широко варьирует — от бессимптомного течения у подавляющего большинства больных (60 — 80%) до тяжелых диссеминированных форм инфекции. У 8% больных развивается острый легочный гистоплазмоз с признаками очаговой пневмонии, которую необходимо дифференцировать от бластомикоза и атипичной пневмонии, вызванной микоплазмами, легионеллами и хламидиями. Хронический гистоплазмоз развивается при несвоевременной диагностике и запоздалом лечении острой фазы. Симптомы хронического легочного гистоплазмоза проявляются как симптомы прогрессирующего поражения мелких бронхов при хронической обструктивной болезни легких. Дифференциальный диагноз хронического гистоплазмоза проводится с такими инфекциями, как туберкулез или другие эндемические микозы. Диссеминированный гистоплазмоз проявляется в виде поражений печени, селезенки, костного мозга, лимфатических узлов, с наибольшей частотой встречаясь у ВИЧ-инфицированных больных, что позволяет отнести его к СПИД-маркерным заболеваниям. Выявлена взаимосвязь между вариантами возбудителя гистоплазмоза и клинической картиной — при инфицировании H. capsulatum var. duboisii характерно более частое поражение кожи, слизистых оболочек и костей.
2.15. H. capsulatum var. capsulatum — самый распространенный из возбудителей особо опасных микозов. Регионы эндемичности включают в себя большинство стран Центральной и Южной Америки, Центральной и Западной Африки, Азии, центральных и восточных районов США. Вариант гриба H. capsulatum var. duboisii эндемичен для тропических районов Африки и острова Мадагаскар.
2.16. Бластомикоз — заболевание, вызываемое микромицетами рода Blastomyces (B. dermatitidis и B. gilchristii). Спектр клинических проявлений бластомикоза включает как острые, подострые или хронические поражения легких, так и диссеминированные экстрапульмональные формы с наиболее частым вовлечением в патологический процесс кожи, костей, суставов и органов мочеполового тракта. Инкубационный период составляет в среднем 4 — 6 недель.
2.17. Бластомикоз наиболее распространен в южных и восточных штатах центральной области США (расположенных в пределах бассейна реки Миссисипи и Огайо), Среднем Западе, канадских провинциях, граничащих с Великими Озерами, а также в небольших областях вдоль берегов реки св. Лаврентия на территории Нью-Йорка и Канады. Заболевание встречается на африканском континенте, особенно в Южно-Африканской Республике и Зимбабве, а также в Индии.
2.18. Паракокцидиоидомикоз — системный микоз, вызываемый грибами рода Paracoccidioides (P. brasillensis и P. lutzii). Заболевание отличается хроническим течением и возникает, как правило, у взрослых мужчин. Могут поражаться легкие, слизистые оболочки желудочно-кишечного тракта, кожа и подкожная клетчатка. Клинические проявления паракокцидиоидомикоза легких напоминают туберкулез. Характерная особенность заболевания — длительный инкубационный период. Возбудитель может сохраняться в организме инфицированных субъектов в течение нескольких месяцев или лет.
2.19. Географическое распространение паракокцидиоидомикоза ограничено странами Центральной и Южной Америки (Мексика, Аргентина, Бразилия, Колумбия, Венесуэла, Эквадор).
III. Основные методы лабораторной диагностики особо опасных микозов
3.1. Все работы по исследованию материала, подозрительного на присутствие в пробах возбудителей особо опасных микозов, проводятся с соблюдением санитарно-эпидемиологических требований к обеспечению безопасности при работе с ПБА II группы патогенности <2>.
<2> Глава IV СанПиН 3.3686-21.
3.2 Лабораторная диагностика особо опасных микозов состоит из следующих этапов:
- обнаружение элементов гриба в патологическом материале;
- выявление и идентификация ДНК грибных патогенов молекулярно-генетическими методами;
- обнаружение специфических антигенов (антител) иммунологическими методами;
- выделение чистой культуры микологическим или биологическим методами с последующим определением видовой принадлежности возбудителя;
- идентификация чистой культуры с использованием времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (англ. Matrix-Assisted Lazer Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry, далее — MALDI-TOF MC).
3.3. Проведение экспресс- и ускоренной диагностики с использованием микроскопии нативных и окрашенных образцов, метода флуоресцирующих антител (далее — МФА), реакции непрямой гемагглютинации (далее — РНГА) и постановки полимеразной цепной реакции (далее — ПЦР) обеспечивает получение предварительного ответа в течение первых суток с момента поступления проб на исследование.
3.4. Процесс выделения возбудителей и их окончательная идентификация могут составлять до 30 суток с момента поступления материала на исследование.
3.5. Идентификация выделенных чистых культур, подозрительных на принадлежность к возбудителям особо опасных микозов, проводится иммунологическими методами, а также с помощью MALDI-TOF MC. Для окончательного установления видовой принадлежности микромицета рекомендуется использовать молекулярно-генетические тесты.
3.6. Для диагностики особо опасных микозов используются наборы реагентов, зарегистрированные в установленном порядке, согласно инструкции производителя (приложение 2 к настоящим МУК). В исследованиях, осуществляемых в Референс-центре по мониторингу за возбудителями особо опасных микозов ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (далее — Референс-центр), а также центрах верификации диагностической деятельности, применяются экспериментальные серии диагностических препаратов <3>.
<3> Пункт 2.9 приложения 7 приказа Роспотребнадзора от 01.12.2017 № 1116 «О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации» (далее — приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 № 1116); пункт 3.2.5 главы V МР 3.1.0129-18 «Порядок организации и проведения индикации патогенных биологических агентов, в том числе неустановленного систематического положения», утвержденных Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 31.05.2018 (далее — МР 3.1.0129-18).
IV. Отбор проб и направление материала для лабораторных исследований
4.1. При подозрении на кокцидиоидомикоз, гистоплазмоз, бластомикоз или паракокцидиоидомикоз на основе клинических и эпидемиологических данных медицинские организации (далее — МО) направляют информацию в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <4>, а также методическими документами <5> и осуществляют:
- отбор и направление материала от больных для лабораторных исследований;
- патологоанатомическое вскрытие умерших с целью установления диагноза и взятия материала для исследования.
<4> Пункт 24 главы 2 СанПиН 3.3686-21.
<5> Пункты 5.1.1, 5.1.2, 5.1.3 главы V МР 3.1.0129-18.
Забор материала от больных, а также вскрытие трупа проводится в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <6>.
<6> Пункты 453, 460 главы IV, приложение 3 СанПиН 3.3686-21.
4.2. У больных, подозрительных на заболевание особо опасными микозами, вне зависимости от формы заболевания осуществляется взятие проб крови и мочи. Дополнительно, в зависимости от клинической формы болезни, проводится забор материала из очага поражения, в котором наиболее вероятно нахождение возбудителя (мокрота, бронхоальвеолярный лаваж, соскобы и гной из кожных очагов и свищевых ходов, спинномозговая жидкость, пунктаты органов и тканей).
4.3. От умерших с подозрением на особо опасные микозы производится отбор материала из очагов кожных поражений, увеличенных лимфоузлов, измененных участков легких, печени, селезенки, мозга.
4.4. Биопсийный материал помещается в две стерильные емкости, одна из которых заливается 10%-м раствором формалина для дальнейшего гистологического исследования, а вторая используется для проведения микологического анализа.
4.5. Упаковка клинического и секционного материала, относящегося к подклассу 6.2 «Инфекционные вещества», проводится с соблюдением общих принципов «тройной» упаковки в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <7>. Образец направления на исследование материала представлен в приложении 3 к настоящим МУК.
<7> Пункты 522, 524 главы IV СанПиН 3.3686-21.
4.6. Транспортирование и хранение биологического материала для исследования осуществляется с соблюдением «холодовой цепи»: образцы цельной крови — при температуре плюс 2 — 8 °C — в течение 1 суток; образцы плазмы и сыворотки крови — при температуре плюс 2 — 8 °C — в течение 5 суток, при температуре минус 70 °C — длительно. Образцы остальных видов биологического материала — при температуре плюс 2 — 8 °C — в течение 3 суток, при температуре минус 20 °C — в течение 1 недели, при температуре минус 70 °C — длительно. Допускается только однократное замораживание/оттаивание биопроб. Образцы спинномозговой жидкости рекомендуется хранить и транспортировать при температуре плюс 37 °C не более суток.
4.7. Отбор и направление материала из объектов окружающей среды осуществляются в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <8>.
<8> Пункты 582, 586 главы V СанПиН 3.3686-21.
Для отбора проб из объектов внешней среды используются стерильные инструменты однократного и многократного применения <9>. Материал помещают в полиэтиленовый пакет с застежкой или одноразовые пробирки (контейнеры), затем упаковывают с соблюдением принципа «тройной» упаковки <10>.
<9> Приложение 5 МУ 3.4.2552-09 «Организация и проведение первичных противоэпидемических мероприятий в случаях выявления больного (трупа), подозрительного на заболевания инфекционными болезнями, вызывающими чрезвычайные ситуации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения», утвержденных Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 17.09.2009.
<10> Пункт 524 главы IV СанПиН 3.3686-21.
4.8. Пробы почвы весом 100 — 200 г отбирают на глубине до 15 см. При взятии проб с больших участков обследуемую площадь разбивают на квадраты со стороной не более 4 м. В каждом квадрате намечают 5 точек по диагонали или 4 точки по краям и одну посередине, откуда производят отбор проб.
4.9. Пробы воды из естественных и искусственных водоемов берут у поверхности (на глубине 10 — 15 см) и у дна при помощи батометра или специально приспособленной бутыли. Объем каждой пробы не менее 0,5 л, общий объем не менее 1 л. Кроме того, берут пробы придонного осадка у береговой кромки, которые исследуют так же, как пробы почвы.
4.10. Смывы с объектов внешней среды производят в местах наиболее вероятного обсеменения микромицетами с помощью стерильного тампона, смоченного физиологическим раствором. Площадь смыва одним тампоном около 10 см2. Тампоны затем помещают в пробирки, заливают стерильным физиологическим раствором (15 мл) и закрывают пробкой.
4.11. Пробы воздуха отбирают с помощью специальных приборов (импакторов или импинжеров), снаряженных сорбирующей жидкостью или фильтрами. Объем исследуемого воздуха составляет не менее 3 — 5 м3.
4.12. Для исследования шерсти, хлопка, сельскохозяйственных культур отбирают не менее 5 образцов массой около 2 г каждый. Если шерсть или хлопок упакованы в кипы, берут не менее 10 образцов из разных мест каждой кипы, а также скопившуюся внутри обшивки пыль. Образцы от одной кипы объединяют и упаковывают вместе.
4.13. В сопроводительной документации к пробам указывают цель проведения исследования, наименование и количество, место и дату отбора материала. Для проб шерсти, зерновых и хлопка дополнительно указывают происхождение, объем партии, вид упаковки, количество упаковочных единиц и прилагают опись с указанием места отбора каждой пробы. Образец акта отбора проб объектов окружающей среды представлен в приложении 4 к настоящим МУК.
4.14. Для проведения комплексного лабораторного анализа и (или) подтверждения результатов выполненных ранее исследований клинический материал, а также пробы из объектов окружающей среды с подозрением на присутствие в них возбудителей особо опасных микозов рекомендуется направлять в Референс-центр <11>.
<11> Пункт 3.5 приложения 7 приказа Роспотребнадзора от 01.12.2017 № 1116.
V. Методы индикации и экспресс-диагностики
5.1. Подготовка материала для исследования, все работы с культурами, подозрительными на принадлежность к родам Coccidioides, Histoplasma, Blastomyces и Paracoccidioides, а также с выделенными культурами возбудителей кокцидиоидомикоза, гистоплазмоза, бластомикоза и паракокцидиоидомикоза проводится в соответствии с санитарно-эпидемиологическими требованиями <12>. Определение концентрации обеззараженной взвеси грибных клеток проводится в камере Горяева (приложение 5 к настоящим МУК).
<12> Глава IV СанПиН 3.3686-21.
5.2. Световая микроскопия исследуемого клинического материала проводится в препаратах, приготовленных по типу «раздавленной капли». При исследовании мокроты, гноя, кала, в которых в большом количестве содержатся посторонние примеси (например, лейкоциты, гибнущие тучные клетки, непереваренные остатки пищи), рекомендуется провести так называемое «просветление» патологического материала. Для этого используется 10%-й раствор гидроксида калия (гидроксида натрия) в смеси с равным количеством исследуемой пробы с последующей экспозицией в течение 10 — 15 мин.
5.3. Для выявления аутофлуоресценции исследуемых грибов проводят их микроскопию в ультрафиолетовом свете после подкрашивания калькофлуором белым — флуоресцирующим красителем, избирательно связывающимся с хитином клеточной стенки грибов. Окраску проводят в соответствии с инструкцией фирмы-изготовителя. При этом гифы и дрожжевые клетки визуализируются в виде хорошо окрашенных ярко-зеленых или голубовато-белых (в зависимости от используемого фильтра) элементов.
5.4. При исследовании гистологических препаратов возможно применение окраски (например, гематоксилин-эозином, по Романовскому-Гимзе, Лейшману, Райту, Май-Грюнвальду, Гомори-Грокотту, PAS).
5.5. В биопсийном и клиническом материале грибы рода Coccidioides обнаруживаются в виде сферул, которые представляют собой крупные, округлые толстостенные образования (приложение 6 к настоящим МУК). При исследовании материала на наличие возбудителей кокцидиоидомикоза окраска, как правило, не нужна, поскольку гриб обладает мощной светопреломляющей оболочкой и хорошо виден в нативных препаратах. Наилучшие результаты могут быть получены при добавлении патологического материала к смеси равных частей глицерина и физиологического раствора или дистиллированной воды. При этом посторонние примеси становятся светлее, в то время как оболочки сферул выявляются более отчетливо.
5.6. При изучении возбудителя гистоплазмоза в тканевой фазе развития — с учетом малых размеров дрожжеподобных клеток и их внутриклеточного расположения — обнаружение гриба в неокрашенных препаратах затруднено. После окрашивания мазков микромицет становится виден в цитоплазме фагоцитов в виде мелких базофильных телец, окруженных бесцветным ореолом.
5.7. Возбудитель бластомикоза при микроскопическом исследовании биоматериала обнаруживается по наличию почкующихся клеток, для которых характерно прочное связывание родительской и дочерней клеток с помощью широкого основания (приложение 6 к настоящим МУК).
5.8. При подозрении на паракокцидиоидомикоз клинический материал подвергается микроскопическому исследованию для обнаружения дрожжеподобных клеток с тонкой оболочкой, окруженных множеством почкующихся клеток с суженным основанием, что напоминает корабельный штурвал или корону — специфический для возбудителя паракокцидиоидомикоза признак (приложение 6 к настоящим МУК).
5.9. Прямой вариант МФА используется для выявления возбудителей особо опасных микозов в пробах из объектов окружающей среды, клинического материала и идентификации выделенных культур.
Приготовление, окрашивание, просмотр мазков и оценка результатов исследований осуществляется в соответствии с инструкцией по применению препарата. Микроморфологическая характеристика возбудителей особо опасных микозов представлена в приложении 4 к настоящим МУК.
Реакция непрямой гемагглютинации
5.10. РНГА, направленная на выявление возбудителей особо опасных микозов, используется как на этапах исследования биологического материала, так и при идентификации выделенных культур. Исследование проводится в соответствии с инструкцией по применению. С целью подтверждения специфичности РНГА одновременно с ней проводится реакция торможения гемагглютинации (далее — РТГА). Результат РНГА считается специфичным, если различия в титрах РНГА и РТГА достигают 16 — 32 и более раз.
5.11. Для обнаружения и идентификации возбудителей особо опасных микозов в пробах из объектов окружающей среды, клинического материала и выделенных культур методом ПЦР используются наборы реагентов, зарегистрированные в установленном порядке.
5.12. Пробы для исследования методом ПЦР обеззараживают добавлением раствора мертиолята натрия (до конечной концентрации 1:1000) с последующей экспозицией при комнатной температуре в течение 24 ч. Возможно обеззараживание лизирующим буфером, содержащим гуанидинтиоцианат натрия и фенол. К пробе объемом 0,1 мл добавляют 600 мкл лизирующего раствора, содержащего 6 М гуанидинтиоцианат натрия и фенол, забуференный трис-HCl, pH 8,0 (в соотношении 1:1), и перемешивают на вортексе в течение 10 с, после чего инкубируют при температуре плюс 95 °C в течение 30 мин.
Обработанные таким образом пробы считаются обеззараженными.
5.13. После проведения этапов обеззараживания и лизиса образец центрифугируют и проводят выделение ДНК согласно протоколу, изложенному в приложении 7 к настоящим МУК. Реактивы, необходимые для проведения этапов обеззараживания и выделения ДНК, представлены в приложении 8 к настоящим МУК.
5.14. Рекомендуется использование литических ферментов для расщепления клеточной стенки микромицетов и коммерческих наборов для выделения нуклеиновых кислот.
5.15. Постановка ПЦР и учет результатов проводятся в соответствии с методическими документами <13> и согласно инструкциям по использованию наборов реагентов.
<13> МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I — IV групп патогенности», утвержденные Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 22.12.2009.
VI. Выделение возбудителей особо опасных микозов из исследуемого материала
Культуральный (микологический) метод
6.1. Для культурального (микологического) исследования используются питательные среды (приложение 6 к настоящим МУК). Все исследуемые образцы рекомендуется культивировать параллельно при температуре плюс 20 — 28 °C и 37 °C в течение 30 и 14 суток соответственно. На жидких питательных средах рост грибов происходит быстрее, хотя он более скудный и не имеет дифференциально-диагностических особенностей.
6.2. Культурально-морфологические признаки возбудителей особо опасных микозов представлены в приложении 6 к настоящим МУК.
6.3. При выделении возбудителей особо опасных микозов с целью подавления контаминантов в качестве ингибиторов бактериального роста в питательную среду добавляется левомицетин (хлорамфеникол) — 0,05 г/л, с целью торможения роста плесневой микобиоты, не относящейся к группе возбудителей особо опасных микозов, используется актидион (циклогексимид) — 0,5 г/л.
6.4. Высокочувствительной биологической моделью для возбудителей особо опасных микозов являются как инбредные, так и беспородные белые мыши. Исследуемую пробу объемом 0,5 — 1,0 мл вводят внутрибрюшинно. На каждый исследуемый образец берут по 4 животных. Культуры выделяются посевом внутренних органов павших или забитых (через 2 и 4 недели) животных (измененные части тканей легких, селезенки, печени, лимфатических узлов) на плотные питательные среды. Сроки инкубации и характер роста колоний аналогичны описанным в приложении 6 к настоящим МУК.
VII. Идентификация возбудителей особо опасных микозов
7.1. Характер роста колоний, макро- и микроморфология возбудителей особо опасных микозов представлены в приложении 6 к настоящим МУК.
7.2. Биохимические свойства возбудителей особо опасных микозов неспецифичны и вариабельны. Для видовой идентификации этих микромицетов тесты на биохимическую активность не используются.
7.3. Для идентификации возбудителей особо опасных микозов используется метод MALDI-TOF MC. С целью получения белкового экстракта возбудителей особо опасных микозов применяется трифторуксусная кислота <14>. Используемые штаммы возбудителей особо опасных микозов культивируются на агаре Сабуро в течение 5 — 10 суток при температуре плюс (25 — 28) °C.
<14> МУК 4.2.3733-21 «Подготовка культур микроорганизмов I — II групп патогенности для анализа методом MALDI-TOF масс-спектрометрии и формирование баз данных референсных масс-спектров для автоматической идентификации микроорганизмов», утвержденные Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 28.12.2021; МР 4.2.0089-14 «Использование метода времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-ToF MS) для индикации и идентификации возбудителей I — II групп патогенности», утвержденные Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 24.04.2014.
7.4. Для идентификации возбудителей особо опасных микозов используются МФА, РНГА и ПЦР (см. п. 5.9 - 5.15).
7.5. Секвенирование ДНК применяется для установления видовой принадлежности выделенных культур. Для фрагментарного секвенирования основными ДНК-мишенями служат, в первую очередь, рибосомальные гены и межгенные участки рДНК (гены больших и малых рибосомальных субъединиц (англ. large subunit, LSU и англ. small subunit, SSU), внутренний транскрибированный спейсер (англ. internal transcribed spacer, ITS). Кроме того, допускается использование однокопийных генов «домашнего хозяйства» (фактор элонгации трансляции 1-альфа — tef1, субъединица 1 и 2 РНК-полимеразы II — RPB1 и RPB2, гены \beta - \text{тубулина} — tub2/BenA, кальмодулина — CaM, белка MCM7).
VIII. Выдача заключения по результатам лабораторной диагностики особо опасных микозов
8.1. Лабораторная диагностика особо опасных микозов включает в себя четыре этапа. В расчетные сроки лабораторного исследования не включено время, необходимое для подготовки проб.
8.2 Этап I (с момента поступления материала на исследование):
- приготовление мазков из нативного материала, окраска фиксированных препаратов для световой микроскопии и МФА;
- постановка ПЦР;
- проведение иммунологических методов исследования;
- посев на плотные и жидкие питательные среды;
- заражение биопробных животных.
8.3 Этап II (2 — 72 часа от начала исследования):
- учет результатов ПЦР и иммунологических реакций;
- выдача предварительного положительного ответа на основании наличия в мазках нативного материала характерных грибных элементов, положительного результата ПЦР, МФА и РНГА.
8.4 Этап III (3 — 15 суток от начала исследования):
- просмотр посевов нативного материала на плотных питательных средах;
- приготовление мазков из выросших колоний для световой микроскопии и МФА;
- постановка ПЦР, РНГА с материалом, полученным из подозрительных колоний;
- идентификация культур методом MALDI-TOF MC;
- подтверждение предварительного положительного ответа на основании наличия характерного роста на плотных питательных средах, положительного результата ПЦР, МФА и РНГА с материалом изолированной культуры.
8.5. Этап IV (16 — 30 суток от начала исследования). Идентификацию выделенной культуры проводят по следующим тестам:
- характерные культурально-морфологические свойства;
- обнаружение специфических элементов гриба в МФА;
- вскрытие павших и забитых биопробных животных, посев органов и крови на плотные питательные среды, приготовление и просмотр мазков-отпечатков органов, постановка ПЦР, МФА, РНГА с суспензиями органов биомоделей;
- выявление видоспецифичных ДНК-мишеней методом ПЦР в выделенных культурах;
- определение нуклеотидных последовательностей генов-«маркеров» методом секвенирования.
8.6. Выдача окончательного положительного ответа проводится на основании выделения чистой культуры возбудителей особо опасных микозов из посевов нативного материала в двух фазах (дрожжевой и мицелиальной), результатов идентификации выделенных культур по фенотипическим признакам, положительных результатов иммунологического анализа, наличия ДНК возбудителей, а также данных масс-спектрометрии и секвенирования ДНК <15>. Отрицательные результаты экспресс-методов являются предварительными и не могут являться основанием для окончательного заключения об отсутствии возбудителей особо опасных микозов в исследуемом материале.
<15> Пункт 3.5.6 МР 3.1.0129-18.
Выдача отрицательного ответа проводится на 30-е сутки после начала исследования на основании отсутствия специфических морфологических элементов возбудителя на питательных средах при посеве нативного материала и органов забитых биопробных животных, отрицательных результатов ПЦР и иммунологических реакций.
IX. Порядок организации и проведения лабораторной диагностики особо опасных микозов для лабораторий территориального, регионального и федерального уровней
9.1 Лабораторные исследования на особо опасные микозы могут проводить:
- на территориальном уровне — лаборатории МО, филиалов ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора в субъекте Российской Федерации (далее — филиал ЦГиЭ), лаборатории особо опасных инфекций ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора в субъекте Российской Федерации (далее — лаборатории ООИ ЦГиЭ);
- на региональном уровне — центры индикации и диагностики возбудителей опасных инфекционных болезней I — II групп патогенности и обеспечения противоэпидемической готовности (далее — ЦИ) (противочумные учреждения Роспотребнадзора);
- на федеральном уровне — референс-центр.
Порядок организации и проведения лабораторной диагностики особо опасных микозов для лабораторий территориального уровня
9.2. В МО, имеющих лицензию на осуществление медицинской деятельности с указанием выполняемых в подразделениях видов работ (услуг), связанных с использованием ПБА, лаборатории 2 уровня биобезопасности (далее — УББ 2) <16>, имеющие санитарно-эпидемиологическое заключение на осуществление работ с ПБА III — IV групп <17>, проводятся исследования пораженной ткани или биологической жидкости (например, мокроты, смывов с бронхов, соскобов и гноя из кожных очагов и свищевых ходов, крови, цереброспинальной жидкости) от больных методами световой и флуоресцентной (с калькофлуором белым) микроскопии, гистологии, а также ПЦР, МФА, РНГА с помощью тест-систем, зарегистрированных в Российской Федерации в установленном порядке <18>.
<16> Пункт 143 главы IV СанПиН 3.3686-21.
<17> Пункты 134, 135 главы IV СанПиН 3.3686-21.
<18> Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416 «Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий» (далее — постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416).
9.3. В лабораториях МО не проводятся микологические (культуральные) диагностические исследования материала от больных с подозрением на особо опасные микозы.
9.4. В Центрах гигиены и эпидемиологии, имеющих лицензию на осуществление деятельности, связанной с использованием возбудителей II — IV (или III — IV) групп патогенности (опасности), лаборатории УББ 2 и УББ 3 <19>, имеющие санитарно-эпидемиологическое заключение на осуществление работ с ПБА III — IV (II — IV) групп <20>, проводят исследования биологического материала, а также проб из объектов окружающей среды методами световой и флуоресцентной микроскопии, гистологии, а также ПЦР, МФА, РНГА с помощью тест-систем, зарегистрированных в Российской Федерации в установленном порядке <21>.
<19> Пункт 143 главы IV СанПиН 3.3686-21.
<20> Пункты 134, 135 главы IV СанПиН 3.3686-21.
<21> Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416.
9.5. Рекомендуется передача материала в ЦИ или непосредственно в референс-центр (по согласованию).
Порядок организации и проведения лабораторной диагностики особо опасных микозов в лабораториях регионального уровня
9.6. Номенклатура и объем исследований ЦИ соответствуют единой комплексной схеме индикации патогенных биологических агентов, в том числе неустановленного систематического положения (неизвестного ПБА) <22> (например, экспресс-методы индикации ПБА — ПЦР, МФА, РНГА <23>, проводимые в лабораториях УББ 2 <24>).
<22> Приложение 4 приказа Роспотребнадзора от 01.12.2017 № 1116.
<23> Пункт 3.4.1 главы III МР 3.1.0129-18.
<24> Пункт 143 главы IV СанПиН 3.3686-21.
9.7. Информация о положительных пробах, а также материал для подтверждения полученных результатов и проведения комплексных микологических исследований направляются в референс-центр.
Порядок организации и проведения лабораторной диагностики особо опасных микозов для лабораторий федерального уровня
9.8 Лаборатории референс-центра проводят:
- обнаружение элементов гриба в патологическом материале;
- исследование клинического (секционного), биологического материала, проб объектов окружающей среды микологическим и биологическим методами;
- полную идентификацию штаммов возбудителей особо опасных микозов, в том числе штаммов с атипичными свойствами;
- выявление и идентификацию ДНК микромицетов молекулярно-генетическими методами;
- обнаружение антигенов (антител) иммунологическими методами;
- идентификацию возбудителей с использованием MALDI-TOF MC;
- генетическое типирование и секвенирование ДНК исследуемых микромицетов;
- определение чувствительности штаммов возбудителей особо опасных микозов к антифунгальным препаратам.
9.9. При идентификации выделенных штаммов возбудителей особо опасных микозов используется весь комплекс исследований, включая современные высокотехнологичные методы микологического, иммунологического, протеомного и молекулярно-генетического анализа.
9.10. Порядок исследования клинического материала, а также проб из объектов окружающей среды соответствует главам III - VIII настоящих МУК.
9.11. Исследования, не сопровождающиеся накоплением жизнеспособных микромицетов II группы патогенности, проводятся в лабораториях УББ 2. Исследования проб микологическим (культуральным) методом проводятся в лабораториях УББ 3, имеющих санитарно-эпидемиологическое заключение о возможности проведения работ с ПБА I — IV групп патогенности <25>.
<25> Пункты 143, 345 главы IV СанПиН 3.3686-21.
Порядок взаимодействия с лабораториями территориального уровня
9.12. Информация о положительных результатах МО, ЦГиЭ и ЦИ, проводившими исследования, передается в управления Роспотребнадзора по субъектам Российской Федерации <26>.
<26> Пункты 24 — 27 главы II СанПиН 3.3686-21.
9.13. Лаборатория МО может направить материал, подлежащий исследованию, в филиал ЦГиЭ, в лабораторию ООИ ЦГиЭ, ЦИ или непосредственно в референс-центр (по согласованию).
9.14. Пробы с положительным результатом исследования экспресс-методами передаются в референс-центр.
Приложение 1 к МУК 4.2.3854-23
ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ, ПРИМЕНЯЕМЫЕ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ОСОБО ОПАСНЫХ МИКОЗОВ <27>
<27> Примечание: допускается использование других питательных сред с аналогичными или лучшими характеристиками.
- пептон, сухой, ферментативный, для бактериологических целей — 10,0 г;
- глюкоза — 40,0 г;
- агар пищевой — 15,0 г;
- левомицетин (хлорамфеникол) — 0,5 г;
- вода дистиллированная — до 1000,0 мл.
- глюкоза — 20,0 г;
- калий фосфорнокислый двузамещенный, 3-водный — 1,0 г;
- натрий азотнокислый — 2,0 г;
- калий хлористый — 0,5 г;
- магний сернокислый, 7-водный — 0,5 г;
- железо (II) сернокислое, 7-водное — 0,01 г;
- агар пищевой — 15,0 г;
- вода дистиллированная — до 1000,0 мл.
- картофельный настой — 200,0 г;
- глюкоза — 20,0 г;
- агар-агар — 15,0 г;
- вода дистиллированная — до 1000,0 мл.
- вытяжка из говяжьего мозга — 12,5 г;
- вытяжка из говяжьего сердца — 5,0 г;
- пептон, сухой, ферментативный, для бактериологических целей — 10,0 г;
- натрий хлористый — 5,0 г;
- натрий фосфорнокислый двузамещенный — 2,5 г;
- глюкоза — 2,0 г;
- агар пищевой — 15,0 г;
- вода дистиллированная — до 1000,0 мл.
- мясной бульон (мясной экстракт) — 1000,0 мл;
- пептон, сухой, ферментативный, для бактериологических целей — 10,0 г;
- глюкоза — 25 мл 40%-го раствора;
- натрий хлористый — 5,0 г;
- l-цистеин — 1,0 г;
- агар пищевой — 15,0 г;
- дефибринированная кровь (кроличья, баранья или лошадиная) — 100,0 мл.
Среду применяют для осуществления конверсии возбудителей гистоплазмоза, бластомикоза, паракокцидиоидомикоза, культивирования их в дрожжевой фазе роста, а также для хранения дрожжевых клеток музейных культур диморфных микромицетов.
- вода дистиллированная — 1000,0 мл;
- калий фосфорнокислый однозамещенный — 0,3 г;
- калий фосфорнокислый двузамещенный, 3-водный — 0,4 г;
- магний сернокислый, 7-водный — 0,4 г;
- цинк сернокислый, 7-водный — 0,2 мл 1%-го раствора;
- натрий хлористый — 1,4 мл 1%-го раствора;
- кальций хлорид, 2-водный — 0,003 г;
- натрий углекислый кислый — 1 мл 1%-го раствора;
- аммоний уксуснокислый — 1,23 г;
- глюкоза — 10 г.
Среда применяется для получения сферул возбудителя кокцидиоидомикоза.
Приложение 2 к МУК 4.2.3854-23
ПРИМЕР ТЕСТ-СИСТЕМ, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ ПРИ ПРОВЕДЕНИИ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ОСОБО ОПАСНЫХ МИКОЗОВ
Приложение 3 к МУК 4.2.3854-23 (рекомендуемый образец)
ОБРАЗЕЦ НАПРАВЛЕНИЯ МАТЕРИАЛА НА ИССЛЕДОВАНИЕ <28>
1. Адрес и наименование организации, куда направляется проба (пробы)
______________________________________________________________
2. Вид материала, взятого для исследования ___________________
3. Дата и час забора материала _______________________________
4. Цель исследования _________________________________________
5. Фамилия, имя, отчество (при наличии) больного _____________
6. Пол, возраст ______________________________________________
7. Место жительства больного _________________________________
8. Дата заболевания __________________________________________
9. Дата обращения за медицинской помощью _____________________
10. Дата госпитализации ______________________________________
11. Диагноз предварительный __________________________________
12. Особенности эпидемиологического анамнеза (пребывание на эндемичных территориях, сроки, контакт с возможными факторами риска)
______________________________________________________________
13. Проводилась ли антифунгальная терапия до взятия материала (дата проведения, какие использовались препараты, какая доза)
______________________________________________________________
14. Наименование организации, должность, Ф.И.О. лица, направившего пробу (пробы)
______________________________________________________________
15. Время доставки пробы (проб) (час, минуты, дата, месяц, год)
______________________________________________________________
16. Ф.И.О., занимаемая должность лица, принявшего пробы
______________________________________________________________
17. Адрес, по которому следует сообщить результаты исследования
______________________________________________________________
<28> Примечание: рекомендуется заполнять в 2 экземплярах: для направления вместе с пробой в лабораторию; для организации (формирования), проводившей отбор материала.
Приложение 4 к МУК 4.2.3854-23 (рекомендуемый образец)
Акт отбора проб объектов окружающей среды на исследование <29>
1. Адрес и наименование организации, куда направляется проба (пробы)
______________________________________________________________
2. Место отбора пробы ________________________________________
3. Мною, _____________________________________________________
в присутствии ________________________________________________
проведен отбор проб __________________________________________
для исследования _____________________________________________
Пробы отобраны: дата __________________ время ________________
в количестве ________________________________________________,
пронумерованы и опломбированы (опечатаны)
4. Условия транспортировки: __________________________________
5. Наименование организации, должность, Ф.И.О. лица, направившего пробу (пробы)
______________________________________________________________
______________________________________________________________
6. Адрес, по которому следует сообщить результаты исследования
______________________________________________________________
7. Дополнительная информация: ________________________________
8. Время доставки пробы (проб) (час, минуты, дата, месяц, год)
______________________________________________________________
9. Ф.И.О., занимаемая должность лица, принявшего пробы
______________________________________________________________
<29> Примечание: рекомендуется заполнять в 2 экземплярах: для направления вместе с пробой в лабораторию; для организации (формирования), проводившей отбор материала.
Приложение 5 к МУК 4.2.3854-23
ПРИМЕР ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ МИКРОМИЦЕТОВ В КАМЕРЕ ГОРЯЕВА
1. Подсчет клеток в суспензиях артроспор и дрожжевых форм микромицетов проводят с помощью камеры Горяева. Подсчет клеток необходимо проводить из нескольких десятикратных разведений суспензии грибов до концентрации от 10 до 100 клеток в малом квадрате камеры Горяева. Расчет проводят для каждого разведения по формуле (1):
где X — количество клеток (м.к./мл);
A — количество клеток, подсчитанных в камере Горяева;
Общее количество клеток в камере Горяева (A) можно определить по следующему алгоритму:
- считают число клеток в 5 больших квадратах, расположенных по диагонали;
- определяют среднее арифметическое;
- увеличивают полученное число в 225 раз (всего квадратов в камере).
2. Конечный показатель концентрации взвеси определяют из расчета средней арифметической подсчетов при всех разведениях.
Приложение 6 к МУК 4.2.3854-23
КУЛЬТУРАЛЬНО-МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ОСОБО ОПАСНЫХ МИКОЗОВ
Приложение 7 к МУК 4.2.3854-23
ПРИМЕР ПРОТОКОЛА ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК ИЗ ГРИБОВ
1. Выделение ДНК из чистых культур микромицетов осуществляют с помощью метода гуанидинтиоцианат-фенольной экстракции с переосаждением ДНК изопропанолом. После проведения этапов обеззараживания и лизиса (см. п. 5.12) пробу центрифугируют на микроцентрифуге при 12 000 об/мин в течение 10 секунд для осаждения конденсата. Затем добавляют 300 мкл хлороформа, перемешивают и центрифугируют в течение 5 минут при 12 000 об/мин. После центрифугирования верхнюю водную фазу переносят в чистую микроцентрифужную пробирку и добавляют 0,1 объема 3 М ацетата натрия и равный объем изопропанола для осаждения ДНК. Смесь перемешивают и выдерживают 1 час при температуре минус 20 °C. После осаждения ДНК пробы центрифугируют при 12 000 об/мин в течение 15 минут, отбирают верхнюю часть. Осадок дважды промывают 500 мкл раствора для отмывки, приготовленного в соответствии с приложением 8 к настоящим МУК. После этого осадок высушивают при температуре плюс 60 °C в течение 10 мин и растворяют в 100 мкл ТЕ-буфера.
2. Выделение ДНК из проб почвы и воды проводят методом гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформной депротеинизации с последующей очисткой ДНК методом нуклеосорбции. Подготовленные пробы почвы и воды в объеме 100 мкл смешивают с лизирующим буфером. После проведения этапов обеззараживания и лизиса (см. п. 5.12) образец центрифугируют на микроцентрифуге при 12 000 об/мин в течение 10 секунд для осаждения конденсата. Затем добавляют 300 мкл хлороформа, перемешивают и центрифугируют на микроцентрифуге при 12 000 об/мин в течение 5 минут, после чего верхнюю водную фазу переносят в чистую микроцентрифужную пробирку и экстрагируют равным объемом хлороформа. Этот этап повторяют 2 раза. Центрифугируют в течение 5 минут при 12 000 об/мин. Далее верхнюю водную фазу переносят в чистую микроцентрифужную пробирку и добавляют 20 мкл раствора сорбента, содержащего 10 мМ трис, 2 мМ ЭДТА, pH 8,0 и 10 мкг сорбента SiO2, который предварительно тщательно перемешивают на вортексе. Пробы инкубируют при температуре плюс 60 °C в течение 10 минут, периодически встряхивая на вортексе для лучшей сорбции ДНК. Затем пробы центрифугируют при 12 000 об/мин на микроцентрифуге в течение 30 секунд, отбирают супернатант, а к осадку добавляют 100 мкл 4 М раствора гуанидинтиоцианата. Перемешивают до гомогенного состояния в течение 10 — 20 секунд на вортексе, центрифугируют на микроцентрифуге в том же режиме и отбирают супернатант. К осадку добавляют 500 мкл раствора для отмывки, приготовленного в соответствии с приложением 8 к настоящим МУК, перемешивают на вортексе и центрифугируют при 12 000 об/мин на микроцентрифуге в течение 30 секунд. Процедуру отмывки повторяют, после чего осадок высушивают при температуре плюс 60 °C в течение 10 минут. Для растворения ДНК к осадку добавляют 100 мкл ТЕ-буфера, инкубируют при температуре плюс 60 °C в течение 10 минут, периодически встряхивая на вортексе. По окончании процедуры десорбции пробу центрифугируют при 12 000 об/мин на микроцентрифуге в течение 1 — 2 минут и отбирают верхнюю фазу для проведения ПЦР.
3. Для выделения ДНК возбудителей особо опасных микозов из проб крови и секционного материала используют метод гуанидинтиоцианат-фенол-хлороформной депротеинизации с последующей очисткой ДНК методом нуклеосорбции в модификации. Перед этапом подсушивания осадок ДНК дополнительно промывают 500 мкл ацетона, перемешивают на вортексе и центрифугируют 12 000 об/мин на микроцентрифуге в течение 30 секунд, после чего высушивают при температуре плюс 60 °C в течение 10 минут и растворяют в 100 мкл ТЕ-буфера.
Приложение 8 к МУК 4.2.3854-23
ПРИМЕРЫ ПРИГОТОВЛЕНИЯ РАБОЧИХ РАСТВОРОВ И РЕАГЕНТОВ ДЛЯ ЭТАПОВ ОБЕЗЗАРАЖИВАНИЯ И ВЫДЕЛЕНИЯ ДНК <30>
<30> Примечание: при работе с фенолом рекомендуется надевать перчатки и очки, чтобы избежать химических ожогов, допускается использование реагентов, рабочих растворов с аналогичными или лучшими характеристиками.
1. Рабочие растворы и реагенты для этапов обеззараживания и выделения ДНК:
- лизирующий буфер с 6 М гуанидинтиоцианатом натрия (ЛБ). На 50 мл: 35,4 г гуанидинтиоцианата натрия растворить в дистиллированной воде, добавить 1 мл 0,5%-го раствора ЭДТА (pH 8,0) и довести до 50 мл дистиллированной водой. К раствору гуанидинтиоцианата натрия добавить в сухом виде 0,154 г дитиотрейтола (далее — ДТТ) до конечной концентрации 20 мМ. Буфер хранить в полипропиленовой посуде при температуре 4 — 10 °C до 6 месяцев;
- раствор 4 М гуанидинтиоцианата натрия. Навеску гуанидинтиоцианата натрия, равную 23,6 г, растворить в дистиллированной воде и довести объем раствора до 50 мл. Рекомендуется добавить ДТТ до конечной концентрации 20 мМ. Раствор хранить при температуре 4 — 10 °C до 12 месяцев;
- раствор для отмывки. К 1 мл 1 М раствора трис-HCl, pH 8,5, добавить 1 мл 5 М раствора натрия хлорида, довести объем до 30 мл дистиллированной водой и добавить 70 мл 96%-го спирта этилового. Раствор хранить в полипропиленовой посуде при температуре 4 — 10 °C до 6 месяцев;
- суспензия сорбента (СС). Готовят 50%-ю (вес/объем) суспензию силикагеля (SiO2) с размером частиц 0,5 — 10 мкм в деионизованной воде. Хранить при температуре 4 — 10 °C до 12 месяцев;
- ТЕ-буфер, pH 7,4. На 100 мл: 1 мл 1 М раствора трис-HCl, pH 8,0, 0,2 мл 0,5 М раствора ЭДТА, деионизованная вода — до 100 мл. Буфер хранить в полипропиленовой посуде при температуре 4 — 10 °C до 6 месяцев;
- 0,5 М раствор ЭДТА, pH 8,0. 18,61 г этилендиаминтетрауксусной кислоты поместить в химический стакан на 100 мл, добавить 80 мл дистиллированной воды, интенсивно перемешать на магнитной мешалке и довести pH до 8,0 +/- 0,1 путем добавления по каплям концентрированного раствора гидроксида натрия. Довести объем до 100 мл дистиллированной водой. Раствор хранить в темной полипропиленовой посуде при температуре (4 +/- 2) °C до 3 месяцев;
- 1 М раствор трис-HCl, pH (8,0 +/- 0,1). Навеску 6,5 г трис-(оксиметил)-аминометана поместить в химический стакан на 50 мл, добавить 25 мл дистиллированной воды. После полного растворения соли довести объем дистиллированной водой до 50 мл и выставить pH (8,0 +/- 0,1) путем добавления по каплям концентрированной соляной кислоты. Раствор хранить при температуре (4 +/- 2) °C до 3 месяцев;
- 0,1 М раствор трис-HCl, pH (6,4 +/- 0,1). Навеску 1,21 г трис-(оксиметил)-аминометана поместить в химический стакан на 100 мл, добавить 50 мл дистиллированной воды. После полного растворения соли довести объем дистиллированной водой до 100 мл. Довести pH до (6,4 +/- 0,1) с помощью концентрированной соляной кислоты. Раствор хранить при температуре (4 +/- 2) °C до 3 месяцев;
- 5 М раствор натрия хлорида. Навеску 29,22 г натрия хлорида поместить в химический стакан и добавить 100 мл дистиллированной воды. Раствор хранить в стеклянной посуде при температуре (4 +/- 2) °C до 3 месяцев;
- 3 М раствор ацетата натрия. Навеску 40,8 г трехводного ацетата натрия поместить в химический стакан на 100 мл, растворить в 80 мл дистиллированной воды, откорректировать pH до 5,2 ледяной уксусной кислотой. Довести объем до 100 мл дистиллированной водой. Раствор хранить при температуре 4 — 10 °C до 12 месяцев;
- фенол, забуференный трис-HCl, pH 8,0. Перед употреблением перегнанный фенол достать из холодильника, выдержать при комнатной температуре и расплавить при температуре плюс 68 °C. К расплавленному фенолу добавить равный объем H2O, тщательно перемешать и выдержать раствор до разделения фаз. После этого удалить верхнюю водную фазу. К фенолу добавить равный объем 1 М раствора трис-HCl, pH (8,0 +/- 0,1), тщательно перемешать и выдержать раствор до разделения фаз. Удалить верхнюю водную фазу. Затем к фенолу добавить равный объем 0,1 М раствора трис-HCl, pH (8,0 +/- 0,1), тщательно перемешать и выдерживать раствор до разделения фаз до тех пор, пока pH водной фазы не станет (8,0 +/- 0,1). Раствор фенола можно хранить при температуре плюс 4 °C до появления розового окрашивания.
НОРМАТИВНЫЕ И МЕТОДИЧЕСКИЕ ДОКУМЕНТЫ
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. Федеральный закон от 30.12.2020 № 492-ФЗ «О биологической безопасности в Российской Федерации.»
3. Постановление Правительства Российской Федерации от 27.12.2012 № 1416 «Об утверждении Правил государственной регистрации медицинских изделий».
4. СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».
5. Приказ Роспотребнадзора от 01.12.2017 № 1116 «О совершенствовании системы мониторинга, лабораторной диагностики инфекционных и паразитарных болезней и индикации ПБА в Российской Федерации».
6. МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I — IV групп патогенности».
7. МУ 3.4.2552-09 «Организация и проведение первичных противоэпидемических мероприятий в случаях выявления больного (трупа), подозрительного на заболевания инфекционными болезнями, вызывающими чрезвычайные ситуации в области санитарно-эпидемиологического благополучия населения».
8. МУК 4.2.3733-21 «Подготовка культур микроорганизмов I — II групп патогенности для анализа методом MALDI-ToF масс-спектрометрии и формирование баз данных референсных масс-спектров для автоматической идентификации микроорганизмов».
9. МР 4.2.0089-14 «Использование метода времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-ToF MS) для индикации и идентификации возбудителей I — II групп патогенности».
10. МР 3.1.0129-18 «Порядок организации и проведения индикации патогенных биологических агентов, в том числе неустановленного систематического положения».
1. Липницкий А.В., Маркин А.М., Суркова Р.С., Викторов Д.В., Топорков А.В. Молекулярная диагностика гистоплазмоза (обзор)//Проблемы особо опасных инфекций. 2019. № 3. С. 14 — 18.
2. Липницкий А.В., Маркин А.М., Шаров Т.Н., Викторов Д.В., Топорков А.В. Клинико-эпидемиологический анализ заболеваемости гистоплазмозом в мире. Эпидемиология и инфекционные болезни//Актуальные вопросы. 2019. Т. 9. № 4. С. 71 — 76.
3. Липницкий А.В., Маркин А.М., Шаров Т.Н., Викторов Д.В., Топорков А.В. Эпидемиологическая ситуация по особо опасным микозам в мире и прогноз ее развития//Проблемы особо опасных инфекций. 2018. Вып. 3. С. 25 — 31.
4. Липницкий А.В., Половец Н.В., Антонов В.А. Проблемы вакцинопрофилактики глубоких микозов//Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2016. Т. 15. № 3 (88). С. 66 — 71.
5. Липницкий А.В., Половец Н.В., Суркова Р.С., Шергина О.А., Викторов Д.В., Топорков А.В. Актуальные проблемы особо опасных микозов//Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2021. № 1. С. 57 — 63.
6. Микология сегодня. Под редакцией Ю.Т. Дьякова, А.Ю. Сергеева. Т. 3. М.: Национальная академия микологии, 2016. 372 с.
7. Микология сегодня. Под редакцией А.В. Куракина, А.Ю. Сергеева. Т. 4. М.: Национальная академия микологии, 2022. 204 с.
8. Муругова А.А., Половец Н.В., Липницкий А.В., Суркова Р.С. Современные аспекты лабораторной диагностики кокцидиоидомикоза. Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2021. № 4. С. 54 — 59.
9. Новицкая И.В., Жога Л.К., Терешко Д.Л. Модификация среды Френсиса для осуществления конверсии гриба Histoplasma capsulatum в дрожжевую фазу роста//Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2019. Т. 167. № 1. С. 68 — 71.
10. Новицкая И.В., Рябинина Л.А. Первичные микозы и вопросы вирулентности диморфных особо опасных микромицетов//Иммунология, аллергология, инфектология. 2022. № 3. С. 48 — 56.
11. Новицкая И.В., Прохватилова Е.В., Топорков А.В., Викторов Д.В., Кулаков М.Я., Савина Е.В., Пушкарь В.Г., Белицкая Л.И., Осина Н.А., Касьян Ж.А., Шульгина И.В., Лобовикова О.А. Диагностические возможности эритроцитарного иммуноглобулинового диагностикума для выявления и идентификации возбудителей особо опасных (глубоких) микозов//Проблемы особо опасных инфекций. 2017. № 3. С. 75 — 79.
12. Особо опасные микозы. Под редакцией В.В. Малеева. Волгоград: Издательство «Волга-Паблишер», 2013. 193 с.
13. Половец Н.В., Липницкий А.В., Суркова Р.С., Шергина О.А., Викторов Д.В., Топорков А.В. Оценка возможности применения коммерческих питательных сред для выделения возбудителей особо опасных микозов из проб почвы//Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2019. № 3. С. 83 — 86.
14. Попова А.Ю., Топорков А.В., Липницкий А.В., Половец Н.В., Викторов Д.В. Распространение в мире особо опасных микозов//Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2016. № 3. С. 120 — 126.
15. Прохватилова Е.В., Новицкая И.В., Кулаков М.Я., Савина Е.В., Пушкарь В.Г., Белицкая Л.И., Плеханова Н.Г., Викторов Д.В., Топорков А.В. Набор реагентов для диагностики in vitro кокцидиоидомикоза и гистоплазмоза: разработка, испытание, государственная регистрация, использование в лабораторной практике//Проблемы медицинской микологии. 2017. Т. 19. № 4. С. 26 — 31.
16. Прохватилова Е.В., Ткаченко Г.А., Леденева М.Л., Половец Н.В., Белицкая Л.И., Плеханова Н.Г., Викторов Д.В., Топорков А.В. Перспектива применения в лабораторной практике наборов реагентов для диагностики гистоплазмоза с помощью полимеразной цепной реакции//Клиническая лабораторная диагностика. 2017. Т. 62. № 7. С. 426 — 431.
17. Суркова Р.С., Шаров Т.Н., Половец Н.В., Липницкий А.В., Муругова А.А. Применение MALDI-TOF масс-спектрометрии для идентификации возбудителей микозов//Иммунопатология, аллергология, инфектология. 2021. № 3. С. 73 — 78.
18. Терешко Д.Л., Новицкая И.В. Анализ цитотоксических свойств коллекционных штаммов возбудителей кокцидиоидомикоза//Иммунология, аллергология, инфектология. 2022. № 3. С. 40 — 47.
19. Терешко Д.Л., Парфенова М.Д. Методы лабораторной диагностики гистоплазмоза — проблемы и перспективы//Иммунология, аллергология, инфектология. 2021. № 4. С. 83 — 90.
20. Шаров Т.Н., Маркин А.М., Липницкий А.В., Викторов Д.В., Топорков А.В. Особенности масс-спектров Coccidioides immitis и Coccidioides posadasii//Проблемы медицинской микологии. 2018. Т. 20. № 2. С. 128.
21. Almeida-Paes R., Bernardes-Engemann A.R., da Silva Motta B. et al. Immunologic diagnosis of endemic mycoses. J. Fungi (Basel). 2022. V. 8. № 10. P. 993.
22. Ashraf N., Kubat R.C., Poplin V. et al. Re-drawing the maps for endemic mycoses. Mycopathologia. 2020. V. 185. № 5. P. 843 — 865.
23. de Hoog G.S., Guarro J., Gené J. et al. Atlas of Clinical Fungi, 4th edition. Hilversum. 2020.
24. Jenks J.D., Gangneux J.P., Schwartz I.S. et al. European Confederation of Medical Mycology (ECMM) Council Investigators. Diagnosis of breakthrough fungal infections in the clinical mycology laboratory: An ECMM consensus statement. J. Fungi (Basel). 2020. V. 6. № 4. P. 216.
25. Sousa C., Marchiori E., Youssef A. et al. Chest imaging in systemic endemic mycoses. J. Fungi (Basel). 2022. V. 8. № 11. P. 1132.
26. Thompson G.R. 3rd, Le T., Chindamporn A. et al. Global guideline for the diagnosis and management of the endemic mycoses: an initiative of the European Confederation of Medical Mycology in cooperation with the International Society for Human and Animal Mycology. Lancet Infect. Dis. 2021. V. 21. № 12. P. e364 — e374.
27. Williams S.L., Chiller T. Update on the epidemiology, diagnosis, and treatment of coccidioidomycosis. J. Fungi (Basel). 2022. V. 8. № 7. P. 666.