МУК 4.2.3733-21. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Подготовка культур микроорганизмов I — II групп патогенности для анализа методом MALDI-TOF масс-спектрометрии и формирование баз данных референсных масс-спектров для автоматической идентификации микроорганизмов. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 28.12.2021)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 28 декабря 2021 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
ПОДГОТОВКА КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ I — II ГРУПП ПАТОГЕННОСТИ ДЛЯ АНАЛИЗА МЕТОДОМ MALDI-TOF МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ И ФОРМИРОВАНИЕ БАЗ ДАННЫХ РЕФЕРЕНСНЫХ МАСС-СПЕКТРОВ ДЛЯ АВТОМАТИЧЕСКОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.3733-21
Методические указания разработаны: ФКУЗ Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора (Д.В. Уткин, А.С. Абдрашитова, Н.Е. Щербакова, Н.А. Осина, И.Н. Шарова, С.А. Портенко, Ж.А. Касьян, А.М. Сеничкина, В.Е. Куклев, А.Н. Спицын, В.В. Кутырев), ФБУН «Государственный научный центр прикладной микробиологии и биотехнологии» Роспотребнадзора (К.В. Детушев, Т.Н. Мухина, И.А. Дятлов), ФКУЗ «Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Сибири и Дальнего Востока» Роспотребнадзора (А.С. Остяк, Е.А. Басов, Л.В. Миронова, С.А. Витязева, Е.В. Кравец, С.В. Балахонов), ФКУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (О.С. Чемисова, М.М. Сагакянц, Н.В. Павлович, М.В. Цимбалистова, Н.В. Аронова, С.В. Титова), ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (В.В. Воропаев, Е.А. Котенева, А.Г. Рязанова, Д.А. Ковалев, Д.В. Ульшина, А.А. Худолеев, Л.Ю. Аксенова, Е.И. Еременко, О.И. Цыганкова, Д.Г. Пономаренко, Н.В. Жаринова, С.В. Писаренко, Г.И. Лямкин, А.Н. Куличенко), ФКУЗ «Волгоградский научно-исследовательский противочумный институт» Роспотребнадзора (Т.Н. Шаров, Я.А. Лопастейская, Е.В. Молчанова, И.Б. Захарова, Д.В. Викторов, А.В. Топорков).
I. Область применения
1.1. Настоящие методические указания (далее — МУК) устанавливают способы подготовки микроорганизмов I — II групп патогенности для исследования с помощью MALDI-TOF (англ. Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization, MALDI; англ. time of flight, ToF) масс-спектрометрии и определяют методику формирования базы данных референсных масс-спектров для автоматической идентификации.
1.2. МУК предназначены для органов и организаций Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также могут быть использованы организациями, применяющими методы масс-спектрометрии для идентификации микроорганизмов I — II групп патогенности, и в экспериментальной работе <1>.
<1> СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».
1.3 МУК носят рекомендательный характер.
II. Общие положения
2.1. Масс-спектрометрический анализ представляет собой точный и чувствительный метод (чувствительность метода 10-12 — 10-15 моль, точность до 0,1 а.е.м.) <2>, позволяющий измерять массы органических и неорганических соединений, посредством ионизации исследуемого вещества и дальнейшего разделения полученных ионов по массам под воздействием электрических полей.
<2> ОФС.1.2.1.1.0008.15 Масс-спектрометрия
Принцип матрично-активированной лазерной десорбции/ионизации (MALDI) основан на «мягкой» ионизации аналита вместе с летучим органическим веществом — матрицей под действием коротких мощных лазерных импульсов.
Наиболее распространенными матрицами при анализе белков являются \alpha - \text{циано} - 4 - \text{гидроксикоричная} кислота и 3-гидроксипиколиновая кислота для олигонуклеотидов, 2,5-дигидроксибензойная кислота для пептидов и полисахаридов.
2.2. Во времяпролетном масс-спектрометре ионы вещества ускоряются пропорционально их заряду в электрическом поле. После попадания на детектор и оцифровки результата выдается график, где по оси абсцисс находится соотношение m/z, а ординат — количество событий регистрации ионов на детекторе. Анализаторы данного типа носят название линейных времяпролетных (ToF), а их сочетание с MALDI эффективно для анализа белков, пептидов и нуклеиновых кислот.
2.3. Спектральный паттерн является уникальной родо-, видо-, а в некоторых случаях и штаммоспецифичной характеристикой, позволяющей идентифицировать микроорганизм до рода, вида, а в некоторых случаях осуществить и внутривидовую дифференциацию или определить дополнительные свойства микроорганизма. Собранные в процессе анализа спектры исследуемых микроорганизмов сравниваются с референсными спектрами базы данных. На основании коэффициента соответствия полученного паттерна референсному спектру выдается заключение о таксономической принадлежности исследуемого объекта.
2.4. Для создания баз данных референсных масс-спектров для указанной группы микроорганизмов при проведении автоматической идентификации методом MALDI-TOF масс-спектрометрии необходимо использовать белковые экстракты чистых культур микроорганизмов с типичными свойствами для вида.
2.5. Применение MALDI-TOF масс-спектрометрии для идентификации возбудителей I — II групп патогенности осуществляют в соответствии с документами, регламентирующими лабораторную диагностику для каждой нозологии. Если в документах использование метода MALDI-TOF масс-спектрометрии для определения таксономического положения патогена не предусмотрено, данный подход рассматривают как дополнительный, и исследования осуществляют после подготовки баз данных референсных масс-спектров микроорганизма и подтверждения диагностической эффективности метода для данного вида возбудителя.
2.6. При приготовлении реагентов и проведении анализа используют наконечники с фильтрами и пробирки, изготовленные из химически неактивного пластика, с целью исключения попадания в пробы пластификаторов.
2.7. Реактивы, используемые при пробоподготовке и проведении масс-спектрометрического анализа, должны иметь степень чистоты «химически чистые», специально предназначенные для масс-спектрометрического анализа или высокоэффективной жидкостной хроматографии.
2.8 Манипуляции с летучими химическими реактивами проводят:
- при приготовлении рабочих растворов и обработке мишени (чипа) после исследования в вытяжном шкафу;
- при приготовлении экстрактов микроорганизмов и при нанесении матрицы на лунки мишени в боксе микробиологической безопасности II класса типа B или III класса с использованием средств индивидуальной защиты, в том числе фильтрующей полумаски, обеспечивающей защиту органов дыхания от летучих химических веществ, в помещении, оборудованном приточно-вытяжной вентиляцией.
III. Материально-техническое обеспечение
3.1 Оборудование:
- MALDI-ToF масс-спектрометр;
- MSP-мишень (чип) для нанесения образцов;
- дозатор механический одноканальный 0,5 — 10 мкл;
- дозатор механический одноканальный 10 — 100 мкл;
- дозатор механический одноканальный 100 — 1000 мкл;
- штатив для механических дозаторов;
- вортекс;
- таймер-секундомер;
- центрифуга настольная с режимом 13000 об/мин;
- цилиндры мерные (100 мл);
- штативы «рабочее место» для микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл;
- боксы микробиологической безопасности II и/или III класса;
- вытяжной шкаф для работы с летучими реактивами;
- твердотельный термостат.
Примечание. Допускается использование средств измерений и стандартных образцов утвержденных типов с аналогичными или лучшими метрологическими характеристиками.
3.2 Расходные материалы:
- пробирки микроцентрифужные с защелкой 1,5 мл;
- микропробирки стерильные пластиковые с завинчивающейся крышкой и кольцевой прокладкой;
- центрифужные ультрафильтры с диаметром пор 0,22 мкм;
- наконечники с аэрозольным фильтром для механического дозатора, 0,1 — 10 мкл;
- наконечники с аэрозольным фильтром для механического дозатора, 10 — 100 мкл;
- наконечники с аэрозольным фильтром для механического дозатора 100 — 1000 мкл;
- петля бактериологическая пластиковая стерильная, 1 мкл;
- емкость-контейнер полимерный для дезинфекции;
- салфетки лабораторные безворсовые.
Примечание. Допускается применение вспомогательного оборудования, отличного от указанного, с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.
3.3 Средства индивидуальной защиты:
- противочумный костюм IV типа (или аналог, разрешенный к применению в установленном порядке);
- латексные перчатки;
- защитные очки;
- прорезиненный (водонепроницаемый) фартук;
- фильтрующая полумаска, обеспечивающая защиту органов дыхания от паров кислот.
3.4 Реактивы:
- ацетонитрил, 99.8%;
- вода деионизованная ультрачистая;
- муравьиная кислота для масс-спектрометрии, 98%;
- спирт этиловый, 96% (ГОСТ 5962);
- трифторуксусная кислота, 99%;
- \alpha - \text{циано} - 4 - \text{гидроксикоричная} кислота;
- 2,5-дигидроксибензойная кислота;
- калибровочный стандарт;
- хлорид натрия;
- стандартный образец мутности;
- гуанидин гидрохлорид (4М).
Примечание. Допускается применение реактивов с характеристиками не ниже указанных.
IV. Требования безопасности
4.1. При выполнении работ необходимо руководствоваться санитарно-эпидемиологическими требованиями к обеспечению безопасности при работе с патогенными микроорганизмами <3>, а также внутренними инструкциями по контролю соблюдения требований биологической безопасности организации, утвержденными руководителем, регламентирующими работу с возбудителями I — IV группы патогенности.
<3> СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».
Все манипуляции с живыми микроорганизмами I — II групп патогенности проводят в боксах микробиологической безопасности II (типа B) или III класса, в зависимости от группы патогенности микроорганизма, в противочумном костюме IV типа (или аналоге, разрешенном к применению в установленном порядке), дополненном двумя парами перчаток при работе в боксе II класса, в противочумном костюме IV типа (или аналоге, разрешенном к применению в установленном порядке) — при работе в боксе III класса <4>.
<4> ГОСТ Р ЕН 12469 «Биотехнология. Технические требования к боксам микробиологической безопасности».
Для индикации и идентификации возбудителей I — II групп патогенности работа с концентрированными растворами сильных органических кислот и растворителями, а также все манипуляции по приготовлению рабочих растворов и обработка мишени (чипа) после исследования должны проводиться в вытяжном шкафу для работы с летучими вредными веществами с использованием средств индивидуальной защиты: латексных перчаток, очков, фартука и фильтрующей полумаски, обеспечивающей защиту органов дыхания от паров кислот. Необходимо избегать попадания концентрированных и рабочих растворов на открытые участки кожи <5>.
<5> МР 4.2.0089-14 «Использование метода времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-ToF MS)».
V. Технология подготовки проб микроорганизмов
5.1. Для масс-спектрометрического анализа отбирают изолированные колонии культур микроорганизмов, находящихся в поздней логарифмической или стационарной фазе роста. Для культивирования возбудителей I — II групп патогенности с целью последующего исследования методом MALDI-TOF масс-спектрометрии применяются неселективные среды накопления, не содержащие красителей и антибиотиков. Для получения наилучших результатов рекомендуется использовать стандартные условия культивирования (среда, фаза роста, температура), идентичные тем, что были использованы для культивирования образцов, при создании референсных единиц базы данных (приложение 1 к настоящим МУК).
5.2. Для создания референсных масс-спектров возбудителей особо опасных инфекционных болезней и внесения их в базу данных используют исключительно белковые экстракты.
5.2.1. Для получения белкового экстракта штаммов возбудителей чумы, туляремии, бруцеллеза, холеры, сапа и мелиоидоза используют метод экстракции этанолом/муравьиной кислотой (приложение 2 к настоящим МУК).
5.2.2. Для получения белкового экстракта штаммов спорообразующих микроорганизмов и возбудителей глубоких микозов используют метод экстракции трифторуксусной кислотой (приложение 2 к настоящим МУК).
5.2.3. Для создания референсных масс-спектров возбудителей особо опасных инфекционных болезней с целью создания баз данных для их идентификации в качестве матрицы используют \alpha - \text{циано} - 4 - \text{гидроксикоричную} кислоту. Возможно применение других матриц (приложение 3 к настоящим МУК).
VI. Подготовка MALDI-мишени
6.1. Новые или одноразовые MALDI-мишени не требуют специальной обработки и могут быть сразу использованы для анализа микроорганизмов. Ранее использованные в идентификации MALDI-мишени подвергают процедуре тщательной промывки с помощью 70% раствора этанола и 80% раствора трифторуксусной кислоты по изложенному ниже протоколу (приложение 2 к настоящим МУК).
6.2 Для чистки мишеней используют следующую схему.
6.2.1. Помещают мишень в подходящий контейнер и наливают достаточное для полного покрытия поверхности мишени количество 70% этанола.
6.2.2 Выдерживают мишень в течение 5 мин при комнатной температуре.
6.2.3. Вынимают мишень и тщательно промывают в проточной водопроводной воде.
6.2.4. Тщательно очищают мишень, используя безворсовую лабораторную салфетку, смоченную в 70% этаноле.
6.2.5. Промывают мишень проточной водой и промокают безворсовой салфеткой до полного высушивания или высушивают в вытяжном шкафу.
6.2.6. На поверхность мишени наносят 100 мкл 80% трифторуксусной кислоты и тщательно протирают поверхность мишени салфеткой, соблюдая правила работы с кислотами.
6.2.7. Промывают мишень деионизованной водой и промокают безворсовой салфеткой.
6.2.8 Просушивают мишень при комнатной температуре (не менее 15 мин).
6.2.9 Мишень готова к использованию.
6.3. Для мишеней с высокой степенью загрязненности промывка проводится по следующей схеме.
6.3.1. Мишень помещают в подходящий контейнер и вносят достаточное для полного покрытия поверхности мишени количество 70% этанола.
6.3.2 Выдерживают мишень в течение 5 мин при комнатной температуре.
6.3.3. Достают мишень и тщательно промывают в проточной водопроводной воде.
6.3.4. Тщательно очищают мишень, используя безворсовую лабораторную салфетку, смоченную в 70% этаноле.
6.3.5. Промывают мишень проточной водой и промокают безворсовой салфеткой до полного высушивания или высушивают в вытяжном шкафу.
6.3.6. На поверхность мишени наносят слой гуанидин гидрохлорида (4М) и выдерживают 10 мин при комнатной температуре.
6.3.7. Промывают мишень проточной водопроводной водой и просушивают безворсовой салфеткой.
6.3.8. Протирают мишени салфеткой смоченной в гуанидин гидрохлориде (4М), затем промывают под проточной водой и просушивают салфеткой.
6.3.9 При необходимости повторяют два предыдущих шага.
6.3.10. Промывают мишень деионизованной водой и промокают безворсовой салфеткой.
6.3.11. Просушивают мишень при комнатной температуре (не менее 15 мин).
6.3.12 Мишень готова к дальнейшей работе.
VII. Масс-спектрометрическое измерение
7.1. Для проведения масс-спектрометрических измерений заранее приготовленный экстракт образца наносят на 8 лунок мишени по 1 мкл на лунку. В одну лунку мишени наносят 1 мкл бактериального калибровочного стандарта.
7.2. После высыхания нанесенных экстрактов и бактериального калибровочного стандарта, лунки покрывают матрицей (по 1 — 2 мкл), дают подсохнуть при комнатной температуре в вытяжном шкафу или боксе микробиологической безопасности (II класс типа B или III класс).
7.3. Мишень (чип) с нанесенными образцами помещают в масс-спектрометр, производят калибровку, необходимую для увеличения достоверности получаемых результатов и контроля качества приготовленных образцов.
7.4. Приступают к сбору спектров в автоматическом режиме, устанавливая необходимые параметры. Результирующее количество спектров должно быть не менее 20. Возможен сбор спектров в ручном режиме.
7.5. Из исходных спектров создают референсный масс-спектр (англ. Main Spectrum, далее — MSP) исследуемого штамма микроорганизма и вносят его в базу данных программы.
VIII. Создание базы данных референсных масс-спектров микроорганизмов
8.1. Для создания базы данных референсных масс спектров микроорганизмов одной таксономической единицы (например, вида микроорганизма) используют штаммы микроорганизмов, таксономическая принадлежность которых определена и подтверждена бактериологическими и/или молекулярно-генетическими методами.
8.2 Создание MSP.
8.2.1. Предварительно производят обработку исходных спектров: сглаживание, вычитание фоновой линии спектра, контроль спектров (следят, чтобы разброс пиков масс-спектра не превышал 500 ppm), удаляют спектры, отличающиеся от остальных. Результат сохраняют в отдельную папку.
8.2.2. Для создания одного MSP одного штамма необходимо не менее 20 исходных спектров. Создают MSP из выделенных 20 исходных спектров.
8.2.3. Созданный MSP перемещают в таксономическое дерево, выбрав при этом пользовательский проект.
8.3. Создание подтипов спектров. Для более точной идентификации близкородственных микроорганизмов создают подтипы спектров. Каждый подтип хранит информацию о различиях спектров.
IX. Идентификация микроорганизмов с использованием созданной базы данных масс-спектров
9.1. После формирования базы данных референсных масс-спектров возможна таксономическая идентификация исследуемого микроорганизма в автоматическом режиме, которая строится на основе сравнения данных спектров, полученных в ходе эксперимента, с базой данных референсных масс-спектров.
9.2. На первом этапе идентификации производится сбор исходных спектров исследуемых образцов. Для получения одиночного масс-спектра используют 40 импульсов лазера (частота 60 Гц), анализируемый диапазон m/z составляет 2000 — 20000 Да. С каждой ячейки чипа снимается исходный спектр, представляющий собой сумму шести одиночных спектров (240 импульсов лазера).
9.3. На следующем этапе проводится автоматическая идентификация, сравниваются собранные исходные спектры с референсными спектрами базы данных. По окончании процесса идентификации программа отображает результат, приводя наиболее соответствующую исходному спектру таксономическую единицу базы данных, с указанием значения коэффициента соответствия (анг. Skore Value, далее — SV). Чем выше SV, тем вероятнее видовая идентификация. Для лучшего восприятия результаты идентификации помечены одним из трех цветов: зеленый, желтый или красный. Заключение о таксономической принадлежности микроорганизма осуществляется на основании значения SV. Значение SV >= 2,3 соответствует достоверной идентификации до вида (зеленый цвет); SV менее 2,299, но более 2,000 — достоверной идентификации до рода и вероятной идентификации до вида (зеленый цвет); значение SV в диапазоне 1,7 — 1,999 рассматривается как вероятная идентификация до рода (желтый цвет) и менее 1,7 — недостоверный результат (красный цвет).
Приложение 1 к МУК 4.2.3733-21
СРЕДЫ И УСЛОВИЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ АНАЛИЗА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ I — II ГРУПП ПАТОГЕННОСТИ
Приложение 2 к МУК 4.2.3733-21
1. Проведение экстракции неспорообразующих микроорганизмов этанолом/муравьиной кислотой.
1.1. Подготавливают и маркируют необходимое количество микропробирок с защелкой объемом 1,5 мл, соответствующее числу исследуемых штаммов.
1.2. В каждую микропробирку вносят 300 мкл деионизованной воды для масс-спектрометрии.
1.3. Бактериологической пластиковой петлей объемом 1 мкл вносят в пробирку культуру возбудителя (1 петля) и аккуратными, плавными движениями тщательно суспендируют.
1.4. К суспензии добавляют 900 мкл 96% этилового спирта и инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин (для бруцелл — в течение 90 мин).
1.5. Полученную смесь тщательно перемешивают на вортексе не менее 1 мин.
1.6. После перемешивания пробирки помещают в центрифугу (необходимо сохранять ориентацию пробирок после помещения их в ротор) и центрифугируют в течение 2 мин при 13000 об/мин.
1.7. Супернатант аккуратно, не задевая осадка, отбирают одноразовым наконечником и сливают в емкость с дезинфицирующим раствором. В случае неполного удаления спирта пробы подсушивают с открытыми крышками на воздухе или в твердотельном термостате при температуре 37 — 42 °C или дополнительно центрифугируют в течение 2 мин при 13000 об/мин с отбором супернатанта.
1.8. К осадку добавляют 70% водный раствор муравьиной кислоты (см. п. 4 приложения 3 к настоящим МУК). Вносимый объем муравьиной кислоты зависит от первоначального количества культуры, взятой в исследование, и может варьировать от 1 до 80 мкл (таблица 1).
| Размер колонии | Объем петли | |||
| < 1,0 мм | > 1,0 мм | 1 мкл | 10 мкл | |
| Муравьиная кислота | 1 — 5 мкл | 5 — 15 мкл | 10 — 40 мкл | 30 — 80 мкл |
| Ацетонитрил | 1 — 5 мкл | 5 — 15 мкл | 10 — 40 мкл | 30 — 80 мкл |
Объем муравьиной кислоты и ацетонитрила
1.9 Полученную смесь тщательно перемешивают пипетированием.
1.10. К суспензии добавляют ацетонитрил в объеме, равном объему муравьиной кислоты, и смесь повторно тщательно перемешивают пипетированием.
1.11. После перемешивания пробирки помещают в центрифугу (необходимо сохранять ориентацию пробирок после помещения их в ротор) и центрифугируют в течение 2 мин при 13000 об/мин.
1.12. Отбирают супернатант в стерильную микропробирку типа «Эппендорф», а исходную пробу помещают в емкость с дезинфицирующим раствором.
1.13. Наружную поверхность микропробирки обтирают салфеткой, смоченной в дезинфицирующем растворе.
1.14. После проведения описанной методики образцы считаются обеззараженными и могут быть переданы для исследования на масс-спектрометре.
1.15 Полученная суспензия готова для нанесения на ячейки мишени.
2. Проведение экстракции и фильтрации спорообразующих микроорганизмов (сибиреязвенного микроба) 80%-й трифторуксусной кислотой.
2.1. Подготавливают и маркируют необходимое количество микропробирок с завинчивающейся крышкой объемом 1,5 мл, соответствующее числу исследуемых штаммов.
2.2 В каждую пробирку вносят 300 мкл деионизованной воды.
2.3. Микробиологической пластиковой петлей объемом 1 мкл, вносят в пробирку одну изолированную колонию возбудителя и аккуратными, плавными движениями тщательно суспендируют.
2.4. Для культур со среды хранения (споровые формы) взвесь микроорганизмов готовят в 0,9% растворе хлорида натрия по стандартному образцу мутности, который ориентировочно соответствует 109 концентрации спор в 1 мл, с помощью бактериологической петли объемом 1 мкл.
2.5. Отбирают 20 мкл полученной взвеси и переносят в 80 мкл 100% трифторуксусной кислоты в микропробирке 1,5 — 2 мл с завинчивающейся крышкой и кольцевой прокладкой.
2.6. Полученную смесь тщательно перемешивают на микроцентрифуге-вортексе и выдерживают при комнатной температуре в течение 10 мин.
2.7. Пробирки помещают в центрифугу (необходимо сохранять ориентацию пробирок после помещения их в ротор) и центрифугируют в течение 20 мин при 13000 об/мин.
2.8. Полученный супернатант аккуратно, не задевая осадка, отбирают одноразовым наконечником и переносят в микропробирку с ультрамикроцентрифужным фильтром (поливинилиденфторид, ПВДФ) с диаметром пор 0,22 мкм.
2.9 Центрифугируют при 13000 об/мин в течение 20 мин.
2.10. Фильтрат из нижней части центрифужного ультрафильтра переносят в микропробирку. Верхнюю и нижнюю составляющую часть центрифужного ультрафильтра помещают в дезинфицирующий раствор в соответствии с требованиями нормативных документов для спорообразующих микроорганизмов. Затем после экспозиции твердые отходы утилизируют в автоклаве.
2.11. Наружную поверхность микропробирки обтирают салфеткой, смоченной в дезинфицирующем растворе.
2.12. Полученный объем фильтрата доводят до 200 мкл деионизованной водой, добавляют 200 мкл ацетонитрила, перемешивают на вортексе и центрифугируют в течение 20 с при 13000 об/мин, чтобы убрать капли образца со стенок и крышки пробирки. Полученная суспензия готова для нанесения на ячейки мишени.
2.13. После проведения описанной методики образцы считаются обеззараженными и могут быть переданы для исследования на масс-спектрометре.
3. Проведение экстракции возбудителей глубоких микозов 80%-й трифторуксусной кислотой.
3.1. В микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл добавляют 50 мкл 80%-го раствора трифторуксусной кислоты.
3.2. В эту пробирку переносят мицелий микромицета в объеме 1 микологической лопатки (приблизительно 50 мг), исключив попадание в микропробирку питательной среды, и механически измельчают микологической лопаткой.
3.3 Инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин.
3.4 Добавляют 150 мкл воды и перемешивают.
3.5 Добавляют 200 мкл ацетонитрила, повторно перемешивают.
3.6 Центрифугируют при 10000 — 12000 об/мин в течение 2 мин.
3.7. Супернатант отбирают в отдельные микропробирки и используют для масс-спектрометрического анализа.
3.8. После проведения описанной методики образцы считаются обеззараженными и могут быть переданы для исследования на масс-спектрометре.
3.9 Материал можно хранить при температуре не выше минус 20 °C.
Приложение 3 к МУК 4.2.3733-21
ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧИХ РАСТВОРОВ ДЛЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ МЕТОДОМ MALDI-TOF МАСС-СПЕКТРОМЕТРИИ
1. Приготовление раствора матрицы ( \alpha - \text{циано} - 4 - \text{гидроксикоричной} кислоты; 2,5-дигидроксибензойной кислоты).
1.1. Для приготовления «стандартного растворителя» в микропробирку объемом 1 мл вносят 475 мкл деионизованной воды, 25 мкл 100% трифторуксусной кислоты и 500 мкл ацетонитрила.
1.2. Смесь тщательно перемешивают на вортексе. Переносят 250 мкл стандартного растворителя в пробирку с сухой порционной матрицей массой 2,5 мг.
1.3. Растворяют матрицу перемешиванием при комнатной температуре до просветления раствора на вортексе (все кристаллы должны раствориться). Конечная концентрация матричного раствора составляет 10 мг/мл.
1.4. Для приготовления не порционной матрицы взвешивают навеску сухой матрицы массой 5 мг, переносят в микропробирку объемом 1 мл. В микропробирку вносят 500 мкл стандартного растворителя. Растворяют матрицу перемешиванием при комнатной температуре до просветления раствора на вортексе.
Примечание. Приготовленный раствор матрицы хранят в темном месте (во избежание ультрафиолетового воздействия) при комнатной температуре в течение 7 дней.
2. Приготовление 100 мл 70% этанола.
2.1. В мерный стакан с помощью градуированного цилиндра объемом 100 мл вносят 27 мл деионизованной воды.
2.2 Добавляют 73 мл 96% этанола и тщательно перемешивают.
3. Приготовление 100 мкл 80% раствора трифторуксусной кислоты:
3.1 В микропробирку объемом 1,5 мл вносят 20 мкл деионизованной воды.
3.2 Добавляют 80 мкл 100% трифторуксусной кислоты.
3.3 Перемешивают на вортексе.
4. Приготовление 100 мкл 70% раствора муравьиной кислоты.
4.1 В микропробирку объемом 1,5 мл вносят 30 мкл деионизованной воды.
4.2 Осторожно добавляют 70 мкл 100% муравьиной кислоты.
4.3 Тщательно перемешивают на вортексе.
Библиографические ссылки
1. Федеральный закон от 30.03.1999 № 52-ФЗ «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения».
2. СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней».
3. МР 4.2.0089-14 «Использование метода времяпролетной масс-спектрометрии с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией (MALDI-TOF MS) для индикации и идентификации возбудителей I — II групп патогенности».
4. ГОСТ Р ЕН 12469 «Биотехнология. Технические требования к боксам микробиологической безопасности».
5. ГОСТ 5962 «Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья».
6. ОФС.1.2.1.1.0008.15 «Масс-спектрометрия».
Термины и сокращения
Для целей настоящей методики использованы следующие понятия: