МУК 4.2.3530-18. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации Beauveria bassiana ОРВ-43 в воздухе рабочей зоны. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 01.02.2018)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 1 февраля 2018 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ Beauveria bassiana ОРВ-43 В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.3530-18
1. Разработаны и подготовлены ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России (Н.И. Шеина).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 ноября 2017 г. № 1).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 1 февраля 2018 г.
1. Назначение и область применения
1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Beauveria bassiana ОРВ-43 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500 000 клеток в 1 м3 воздуха.
1.2 Методические указания носят рекомендательный характер.
2. Биологическая характеристика штамма Beauveria bassiana ОРВ-43 и его гигиенический норматив в воздухе рабочей зоны
Штамм Beauveria bassiana ОРВ-43 является энтомопатогенным микроорганизмом, выделенным из личинок колорадского жука (Leptinotarsa decemlineata) третьего поколения и прошедшим серию длительных лабораторных пассажей с заражением различных вредителей и последующей реизоляцией. Была проведена идентификация штамма ОРВ-43 на базе ГНУ ВНИИ сельскохозяйственных микроорганизмов Россельхозакадемии с использованием метода секвенирования ITS региона. По результатам работы микроорганизм был отнесен к виду Beauveria bassiana.
Штамм является активным началом препарата Биослип БВ, Ж. Инсектицид «Биослип БВ, Ж» состоит из жизнеспособных бластоспор, конидий, остатков мицелия штамма Beauveria bassiana ОРВ-43 и культуральной жидкости, представляющей собой водный раствор остатков питательной среды и продуктов жизнедеятельности культуры штамма. Содержание жизнеспособных конидий Beauveria bassiana ОРВ-43 в биологическом инсектициде составляет не менее 1 x 108 КОЕ/мл.
Штамм Beauveria bassiana ОРВ-43 является патогеном для широкого спектра насекомых-вредителей, механизм действия которого характеризуется попаданием жизнеспособных конидий и/или бластоспор штамма на поверхность тела насекомого с последующим прорастанием мицелия во внутренние ткани насекомого, сопровождаемым гибелью последнего.
При попадании на покровы насекомых конидии и бластоспоры прорастают сквозь них, образуя мицелий, и постепенно проникают в гемолимфу, где гриб начинает активно размножаться, распространяясь по всему телу насекомого. При этом гриб потребляет растворенные в гемолимфе питательные вещества и продуцирует токсины, в частности, боверин. В результате насекомое гибнет от истощения и интоксикации. Развивающийся мицелий выходит через покровы насекомого на поверхность, на нем образуются споры, которые при попадании на поверхность следующей генерации насекомых заражают их, и цикл повторяется. Штамм не обладает патогенностью в отношении полезных и нейтральных для человека членистоногих в агроценозах.
Систематическое положение штамма
| Царство | Fungi |
|---|---|
| Отдел | Coelomycetes (митоспоровые грибы) |
| Класс | Hyphomycetes |
| Род | Beauveria |
| Вид | bassiana |
| Штамм | ОРВ-43 |
Рис. 1. Внешний вид Beauveria bassiana sp.
Мицелиальный гриб образует практически одинаковые колонии на среде Сабуро и картофельно-декстрозном агаре, достигающие 25 — 30 мм в диаметре на 10 сутки роста при 23 °C. Колонии войлочные, плотно прилегающие к поверхности среды, белого цвета, обладают слабым невнятным запахом. С возрастом поверхность колоний становится мучнистой. Обратная сторона колонии имеет желтоватую окраску, растворимый пигмент отсутствует.
При микроскопировании обнаруживаются септированные, разветвленные, бесцветные вегетативные гифы с гладкими стенками, 1 — 2 мкм шириной. Конидиеносцы образуются латерально на воздушных гифах.
Конидиогенные клетки расположены одиночно, парами или пучками, с расширенным основанием и тонкой вытянутой вершиной с зигзагообразным недетерминированным рахисом (окончанием), несущим одиночные шаровидные гладкие конидии шириной 2 — 3 мкм.
Конидии бесцветные, несептированные, с тонкими гладкими стенками, имеют размер 2 — 3 мкм, форму, близкую к сферической, иногда со слабозаметной выемкой у основания. В массе конидии белого цвета, агрегированы в сферические кластеры среди воздушного мицелия.
Штамм Beauveria bassiana ОРВ-43 по критериям вирулентности, токсичности, токсигенности и диссеминации относится к непатогенным микроорганизмам для теплокровных животных. Он не является фитопатогеном, а также не входит в состав 4 групп патогенности в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами» в редакции Дополнений и изменений № 2, утвержденных Постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 29.06.2011 № 86.
Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны — 50 000 кл./м3.
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500 000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
4. Методы измерений
Метод основан на аспирации из воздуха производственных помещений конидий и/или бластоспор гриба на среду Сабуро и подсчета количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы, реактивы и питательные среды.
5.1 Средства измерений
| Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 — 790 мм рт. ст. и пределом допустимой погрешности +/- 2,5 мм рт. ст. | ТУ 2504-1799-75 |
|---|---|
| Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности +/- 0,2 мг | ГОСТ Р 53228-08 |
| Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2 | ГОСТ 1770-74 |
| Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 см3 | ГОСТ 29227-91 |
| Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см3 | ГОСТ 1770 |
| Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0 — 55 °C | ТУ 25-2021.003-88 |
| Аспирационный аппарат и устройство для отбора проб воздуха |
Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
5.2 Вспомогательные устройства и материалы
| Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру (160 +/- 5) °C | ТУ 9452-010-00141798-02 |
| Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру (27 +/- 2) °C и (37 +/- 2) °C | ТУ 9452-002-00141798-97 |
| Автоклав электрический | ГОСТ 9586-75 |
| Стерилизаторы паровые медицинские | ГОСТ Р ЕН 13060-11; ГОСТ Р 51935-02 |
| Дистиллятор | ТУ 4952-007-33142130-2000 |
| Облучатель бактерицидный настенный | ТУ 9444-015-03965956-08 |
| Холодильник бытовой | ГОСТ 26678-85 |
| Микроскоп биологический с иммерсионной системой | |
| Лупа с увеличением x10 | ГОСТ 25706-83 |
| Пробирки типов П1, П2 | ГОСТ 25336-82 |
| Спиртовки лабораторные стеклянные | ГОСТ 23932-90 |
| Чашки биологические (Петри) | ГОСТ 23932-90 |
| Воронки конусные диаметром 40 — 45 мм | ГОСТ 25336-82 |
| Груша резиновая | ТУ 9398-005-0576-908 |
| Петля бактериологическая | |
| Марля медицинская | ГОСТ 9412-77 |
| Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81 | |
| Бумага фильтровальная лабораторная | ГОСТ 12026-76 |
| Примечание. Допускается применение оборудования и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками. | |
5.3 Реактивы и питательные среды
| Среда Сабуро ГОСТ 10444.12-18 | |
| Вода дистиллированная | ГОСТ 6709-90 |
| Спирт этиловый ректификованный ГОСТ Р 51652-2000 или ГОСТ 18300-87 | |
| Спирт этиловый технический | ГОСТ 17299-78 |
| Канамицина сульфат | |
| Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками. | |
| 6. Требования безопасности | |
При выполнении измерений концентрации клеток в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.
6.1. СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
6.2. СП 1.3.2518-09 Дополнения и изменения № 1 к СП 1.3.2322-08.
6.3. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76.
6.4. Требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09 и инструкции по эксплуатации прибора.
6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:
| - температура воздуха | (20 +/- 5) °C; |
|---|---|
| - атмосферное давление | 760 +/- 20 мм рт. ст.; |
| - влажность воздуха | не более 80%. |
9. Приготовление питательных сред
Для приготовления агаризованной среды Сабуро 62 г препарата размешивают в 1 дм3 воды, кипятят до полного растворения препарата и фильтруют через ватно-марлевый тампон. Стерилизуют среду в течение 15 мин при температуре (121 +/- 1) °C. Для подавления роста посторонней микрофлоры ex temporo в готовую и охлажденную до температуры (48 +/- 2) °C среду добавляют канамицин из расчета 50 мкг/мл среды, после чего разливают в чашки Петри.
Среду хранят в герметично закрытой упаковке в помещении с относительной влажностью не более 60% и температурой от 5 до 25 °C.
10. Проведение измерения
10.1 Отбор проб воздуха
Отбор проб воздуха проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 с изменением № 1 «ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны» и ГОСТ 8.563-96. «ГСП. Методики выполнения измерений».
Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96° этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
10.2 Выполнение анализа
При выполнении анализа воздуха стерильную среду Сабуро расплавляют, остужают до температуры (48 +/- 2) °C, добавляют канамицин из расчета 50 мкг/мл среды и разливают в чашки Петри.
Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °C не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2 — 8) °C не более 10 дней.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (27 +/- 2) °C. Через 5 — 7 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.
Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316-08. Для этого эталонный музейный штамм Beauveria bassiana ОРВ-43 высевается на 2 — 3 чашки используемой среды.
Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 — 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.
11. Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации клеток производят по формуле:
где К — концентрация Beauveria bassiana ОРВ-43 в воздухе, кл./м3;
П — количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;
1 000 — коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;
C — скорость аспирации воздуха, л/мин;
12. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по нижеприведенной форме.
Протокол № количественного микробиологического анализа Beauveria bassiana ОРВ-43 в воздухе рабочей зоны
1. Дата проведения анализа ________________________________________________
2. Рабочее место (профессия работающего) __________________________________
3. Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы) _______________________________
3. Вид пробоотборника _____________________________________________________
4. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб ____
5. Питательная среда, время инкубации _____________________________________
6. Результаты испытания ростовых свойств питательной среды ________________
7. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний) _____________________________________________
8. Результаты идентификации микроорганизмов Beauveria bassiana ОРВ-43 (морфологические признаки) ________________________________________________
9. Результаты расчета концентрации штамма _________________________________
10. Соотношение полученных результатов с уровнем ПДКр.з. __________________
11. Отбор пробы проведен (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _______________
12. Идентификация штамма и расчет концентрации проведены (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _________________________________________________