МУК 4.2.3528-18. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации Corynebacterium glutamicum H150 (Brevibacterium flavum) ВКПМ В-12692 в воздухе рабочей зоны. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 01.02.2018)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 1 февраля 2018 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ
И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ CORYNEBACTERIUM GLUTAMICUM H150 (BREVIBACTERIUM FLAVUM) ВКПМ В-12692 В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.3528-18
1. Разработаны и подготовлены ГБОУ ВПО РНИМУ им. Н.И. Пирогова Минздрава России (проф., д.б.н. Н.И. Шеина).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 ноября 2017 г. № 1).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 1 февраля 2018 г.
1. Назначение и область применения
1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Corynebacterium glutamicum H150 (Brevibacterium flavum) ВКПМ В-12692 в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентрации от 50 до 500 000 клеток в 1 м3 воздуха.
1.2 Методические указания носят рекомендательный характер.
2. Биологическая характеристика штамма Corynebacterium glutamicum H150 (Brevibacterium flavum) ВКПМ В-12692 и его гигиенический норматив в воздухе рабочей зоны
Штамм Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) H150 происходит от одноименного штамма ВКПМ В-12504, продуцент лизина, не является генетически-инженерно-модифицированным штаммом.
Corynebacterium относится к роду бактерий и порядку Actinomycetales. Виды этого рода являются грамм положительными аэробными микроорганизмами и представлены неподвижными овальными или слегка удлиненными палочками, которые не образуют спор.
Штамм растет в средах, обогащенных углеводами: МПА, L-среда, 2LB-среда с мальтозой (20,0 г/л). Колонии интенсивно желтого цвета округлой формы, приподняты над поверхностью, края колоний ровные, консистенция нетягучая, клетки легко отделяются друг от друга. Оптимальная температура — 30 °C, время выращивания — 1 - 2 сут.
Депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИ Генетика под номером ВКПМ В-12692.
Штамм Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) H150 ВКПМ В-12692 не является фито- и зоопатогенным, а также не входит в состав 4 групп патогенности в соответствии с Санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами» в редакции Дополнений и изменений 2, утвержденных постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 29.06.2011 № 86.
Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны — 50 000 кл/м3.
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 500 000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
4. Метод измерений
Метод основан на аспирации из воздуха рабочей зоны клеток и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы.
5.1 Средства измерений
| Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 — 790 мм рт. ст. и с пределом допустимой погрешности +/- 2,5 мм рт. ст. | ТУ 2504-1799-75 |
|---|---|
| Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности +/- 0,2 мг | ГОСТ Р 53228-08 |
| Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2 | ГОСТ 1770-74 |
| Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 см3 | ГОСТ 29227-91 |
| Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см3 | ГОСТ 1770 |
| Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0 — 55 °C | ТУ 25-2021.003-88 |
| Аспирационный аппарат и устройство для отбора проб воздуха |
Примечание. Допускается использование других средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
5.2 Вспомогательные устройства и материалы
| Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру (160 +/- 5) °C | ТУ 9452-010-00141798-02 |
| Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру (30 +/- 2) и (37 +/- 2) °C | ТУ 9452-002-00141798-97 |
| Автоклав электрический | ГОСТ 9586-75 |
| Стерилизаторы паровые медицинские | ГОСТ Р ЕН 13060-11, ГОСТ Р 51935-02 |
| Дистиллятор | ТУ 4952-007-33142130-2000 |
| Облучатель бактерицидный настенный | ТУ 9444-015-03965956-08 |
| Холодильник бытовой | ГОСТ 26678-85 |
| Микроскоп биологический с иммерсионной системой | |
| Лупа с увеличением x 10 | ГОСТ 25706-83 |
| Пробирки типов П1, П2 | ГОСТ 25336-82 |
| Спиртовки лабораторные стеклянные | ГОСТ 23932-90 |
| Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов | ГОСТ 23932-90 |
| Воронки конусные диаметром 40 — 45 мм | ГОСТ 25336-82 |
| Груша резиновая | ТУ 9398-005-0576-9082-03 |
| Петля бактериологическая | |
| Марля медицинская | ГОСТ 9412-77 |
| Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81 | |
| Бумага фильтровальная лабораторная | ГОСТ 12026-76 |
| Примечание. Допускается применение другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками. | |
5.3 Реактивы и питательные среды
| Агар микробиологический | ГОСТ 17206-96 |
| Вода дистиллированная ГОСТ 6709-90 | |
| Дрожжевой экстракт, сухой | ГОСТ 17206-84 |
| Натрий хлористый | ГОСТ 4233-77 |
| Патока мальтозная | ГОСТ 55316-12 |
| Спирт этиловый технический ГОСТ 17299-78 | |
| Спирт этиловый ректификованный | ГОСТ Р 51652-2000 или ГОСТ 18300-87 |
| Триптон | |
| Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками. | |
| 6. Требования безопасности | |
При выполнении измерений концентрации клеток бактерий в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.
6.1. Санитарные правила «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней», СП 1.3.2322-08.
6.2. Дополнения и изменения 1 к СП 1.3.2322-08. Санитарно-эпидемиологические правила СП 1.3.2518-09.
6.3. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76.
6.4. Требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09 и инструкции по эксплуатации прибора.
6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:
| - температура воздуха | (20 +/- 5) °C; |
|---|---|
| - атмосферное давление | (760 +/- 20) мм рт. ст.; |
| - влажность воздуха | не более 80%. |
9. Приготовление 2LB-среды
Для приготовления среды 2LB используют отдельные компоненты среды следующего состава (г/1 000 см3): триптон — 20,0 г; 50%-я патока мальтозная — 20,0 г; дрожжевой экстракт — 10,0 г; агар-агар — 15,0 г; натрий хлористый — 10,0 г; дистиллированная вода — 1 000 см3.
Сухие компоненты растворяют в 1 000 см3 дистиллированной воды, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.
Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 — 500 см3 и автоклавируют при 121 °C в течение 15 мин.
Готовую среду хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °C в течение 10 дней, не более. Раствор мальтозы 50%-й готовится и стерилизуется отдельно. При разливе среды в чашки Петри добавляется из расчета 40 мл/л 50%-я мальтоза.
10. Проведение измерения
10.1 Отбор проб воздуха
Отбор проб воздуха проводят с учетом требований ГОСТ 12.1.005-88 с изменением 1 «ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны» и ГОСТ 8.563-96 «ГСИ. Методики выполнения измерений».
Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96° этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
10.2 Выполнение анализа
При выполнении анализа воздуха прямым методом стерильную агаризованную среду (2LB) расплавляют, остужают до 50 — 60 °C и разливают в чашки Петри. Затем добавляют из расчета 40 мл/л стерилизованный 50%-й раствор мальтозы.
Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °C не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре 2 — 8 °C не более 10 дней.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (30 +/- 2) °C. Через 1 — 3 суток проводят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.
Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316-08. Для этого эталонный музейный штамм Corynebacterium glutamicum (Brevibacterium flavum) H150 ВКПМ В-12692 высевается на 2 — 3 чашки используемой среды.
Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 — 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.
11. Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации клеток проводят по формуле:
К = (П x 1 000)/С x Т кл/м3, где
К — концентрация штамма в воздухе, кл/м3;
П — количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;
1 000 — коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;
С — скорость аспирации воздуха, л/мин;
12. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по нижеприведенной форме.
Протокол № количественного микробиологического анализа Corynebacterium glutamicum H150 ВКПМ В-12692 в воздухе рабочей зоны
1. Дата проведения анализа ________________________________________________
2. Рабочее место (профессия работающего) __________________________________
3. Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы) _______________________________
3. Вид пробоотборника _____________________________________________________
4. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб ____
5. Питательная среда, время инкубации _____________________________________
6. Результаты испытания ростовых свойств питательной среды ________________
7. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний) _____________________________________________
8. Результаты идентификации микроорганизмов Corynebacterium glutamicum H150 ВКПМ В-12692 (морфологические признаки) ______________________________
9. Результаты расчета концентрации штамма _________________________________
10. Соотношение полученных результатов с уровнем \text{ПДК}_{\text{р}.\text{з}.} __________________
11. Отбор пробы проведен (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _______________
12. Идентификация штамма и расчет концентрации проведены (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _________________________________________________