МУК 4.2.3527-18. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации Bacillus thuringiensis ssp. toumanoffi 25 в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 01.02.2018)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 1 февраля 2018 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ
ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ Bacillus thuringiensis ssp. toumanoffi 25 В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.3527-18
1. Разработаны и подготовлены ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России (Н.И. Шеина).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 24 ноября 2017 г. № 1).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 1 февраля 2018 г.
1. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации B. thuringiensis ssp. toumanoffi 25 в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 50 000 клеток в 1 м3 воздуха.
1.2 Методические указания носят рекомендательный характер.
2. Биологическая характеристика штамма Bacillus thuringiensis ssp. toumanoffi 25 и его гигиенический норматив в атмосферном воздухе населенных мест
Штамм B. thuringiensis ssp. toumanoffi 25 выделен с поверхности листьев сои в Новосибирской области в 2010 г.
На основе штамма энтомопатогенной бактерии B. thuringiensis ssp. toumanoffi 25 создан инсектицид «Биослип БТ, П», который обладает широким спектром действия в отношении насекомых-вредителей сельского хозяйства, относящихся к отрядам Чешуекрылые и Двукрылые. Он активен в отношении личинок бабочек из семейства Белянки, Совки, Настоящие моли, Выемчатокрылые моли, Огневки, Плодожорки, а также в отношении насекомых из отряда Двукрылые: журчалок, галлиц, серебрянок.
Действующей основой препарата являются кристаллы белкового \delta -эндотоксина и жизнеспособные споры штамма B. thuringiensis ssp. toumanoffi 25. Содержание жизнеспособных спор в инсектициде «Биослип БТ, П» составляет не менее 1 x 1010 КОЕ/г, количество кристаллов токсина равно общему количеству спор в препарате.
В качестве вспомогательных веществ инсектицид содержит остатки защитной среды для сублимационной сушки — неорганические фосфаты, сухое молоко, желатин. Инсектицид представляет собой водорастворимый порошок.
Кристаллы токсина действуют в кишечнике насекомого при поедании, белковый токсин растворяется в кишечном соке насекомого при pH 9,5 — 10,5 и переходит в активную форму под действием протеолитических ферментов кишечного сока. В активном состоянии токсины формируют поры в клетках эпителия кишечника, что в дальнейшем приводит к гибели насекомого.
После попадания в кишечник насекомого гибель наступает в промежутке от 6 до 48 часов, в зависимости от вида насекомого, стадии его развития, количества попавшего в кишечник \delta -эндотоксина. Белковый \delta -эндотоксин конденсируется в кристаллы ромбовидной формы (параспоральные тельца) и экскретируется на завершающей стадии спорообразования. Кристаллический \delta -эндотоксин обладает высокой термостабильностью.
Штамм B. thuringiensis ssp. toumanoffi 25 представляет собой грамположительные, подвижные, образующие жгутики палочки размером 0,7 — 1,2 x 2,5 — 4,0 мкм. Через 48 часов роста на МПА образуют овальные споры размером 0,6 — 0,8 x 1,2 — 2,0 мкм. Одновременно со спорой образуются параспоральные тельца ромбовидной формы разных размеров. На среде АГВ и картофельно-глюкозном агаре образуют серые полупрозрачные колонии с ровным краем. Оптимальная температура роста +28 — 31 °C.
Систематическое положение микроорганизма:
| Царство | Procaryota |
|---|---|
| Класс | Schizomycetes |
| Отряд | Eubacteriales |
| Семейство | Bacillaceae |
| Род | Bacillus |
| Вид | thuringiensis |
| Штамм | ssp. toumanoffi 25 |
Рис. 2. Внешний вид Bacillus thuringiensis sp.
Штамм образует ацетилметилкарбинол, на желтковой среде лецито-вителлиновая реакция положительная, образует кислоту из маннозы, не образует кислоту при росте на салицине и сахарозе, не гидролизует эскулин, образует уреазу на среде с мочевиной, гидролизует крахмал, пептонизирует молоко, ДНКазная активность отсутствует, ингибирует рост Micrococcus lysodeikticus.
Штамм Bacillus thuringiensis ssp. toumanoffi 25 по критериям вирулентности, токсичности, токсигенности и диссеминации относится к непатогенным для теплокровных животных микроорганизмов. Он не является фитопатогенным, а также не входит в состав 4 групп патогенности в соответствии с санитарно-эпидемиологическими правилами СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами» в редакции Дополнений и изменений № 2, утвержденных Постановлением Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 29.06.2011 № 86.
Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест — 5 000 кл./м3.
Методика обеспечивает выполнение измерений количества штамма в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 50 000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
Прямой метод основан на аспирации из атмосферного воздуха населенных мест бактерий на мясо-пептонный агар (МПА) и подсчета количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы, реактивы и питательные среды.
5.1 Средства измерений
| Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 — 790 мм рт. ст. и пределом допустимой погрешности +/- 2,5 мм рт. ст. | ТУ 2504-1799-75 |
|---|---|
| Весы лабораторные аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности +/- 0,2 мг | ГОСТ Р 53228-08 |
| Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2 | ГОСТ 1770-74 |
| Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 см3 | ГОСТ 29227-91 |
| Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см3 | ГОСТ 1770 |
| Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0 — 55 °C | ТУ 25-2021.003-88 |
| Аспирационный аппарат и устройство для отбора проб воздуха |
Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
5.2 Вспомогательные устройства и материалы
| Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру (160 +/- 5) °C | ТУ 9452-010-00141798-02 |
| Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру (30 +/- 2) °C и (37 +/- 2) °C | ТУ 9452-002-00141798-97 |
| Автоклав электрический | ГОСТ 9586-75 |
| Стерилизаторы паровые медицинские | ГОСТ Р ЕН 13060-11; ГОСТ Р 51935-02 |
| Дистиллятор | ТУ 4952-007-33142130-2000 |
| Облучатель бактерицидный настенный | ТУ 9444-015-03965956-08 |
| Холодильник бытовой | ГОСТ 26678-85 |
| Микроскоп биологический с иммерсионной системой | |
| Лупа с увеличением x10 | ГОСТ 25706-83 |
| Пробирки типов П1, П2 | ГОСТ 25336-82 |
| Спиртовки лабораторные стеклянные | ГОСТ 23932-90 |
| Чашки биологические (Петри) или одноразовые из полимерных материалов | ГОСТ 23932-90 |
| Воронки конусные диаметром 40 — 45 мм | ГОСТ 25336-82 |
| Груша резиновая | ТУ 9398-005-0576-908 |
| Петля бактериологическая | |
| Марля медицинская | ГОСТ 9412-77 |
| Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81 | |
| Бумага фильтровальная лабораторная | ГОСТ 12026-76 |
| Примечание. Допускается применение оборудования и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками. | |
5.3 Реактивы и питательные среды
| Агар микробиологический | ГОСТ 17206-96 |
|---|---|
| Мясо-пептонный бульон (МПБ) | ГОСТ 20730-75 |
| Спирт этиловый технический | ГОСТ 17299-78 |
| Спирт этиловый ректификованный | ГОСТ Р 51652-2000 или ГОСТ 18300-87 |
Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками.
При выполнении измерений концентрации штамма в атмосферном воздухе населенных мест соблюдают следующие требования.
6.1. СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней».
6.2. СП 1.3.2518-09 Дополнения и изменения № 1 к СП 1.3.2322-08.
6.3. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76.
6.4. Требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09 и инструкции по эксплуатации прибора.
6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований.
Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:
| - температура воздуха | (20 +/- 5) °C; |
|---|---|
| - атмосферное давление | (760 +/- 20) мм рт. ст.; |
| - влажность воздуха | не более 80%. |
9. Приготовление питательных сред
Для приготовления мясо-пептонного агара (МПА) к 1 000 см3 мясо-пептонного бульона (МПБ) добавляют 15,0 г агар-агара, тщательно перемешивают и нагревают до полного растворения агара.
Приготовленную среду разливают в стерильные колбы по 250 — 500 см3 и автоклавируют при 121 °C в течение 15 мин.
Готовые среды хранят в защищенных от света условиях при температуре не выше 8 °C в течение 14 дней, не более.
10.1 Отбор проб воздуха
Отбор проб воздуха проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» и Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».
Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96° этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
10.2 Выполнение анализа
При выполнении анализа воздуха стерильный МПА расплавляют, остужают до 50 — 60 °C и разливают в чашки Петри.
Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °C не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2 — 8) °C не более 10 дней.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (30 +/- 2) °C. Через 1 — 2 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.
Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316-08. Для этого эталонный музейный штамм B. thuringiensis ssp. toumanoffi 25 высевается на 2 — 3 чашки используемой среды.
Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 — 3 пассажа во избежание потери им заданных ростовых свойств.
11. Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации клеток производят по формуле:
К = (П x 1 000)/C x T кл./м3, где
К — концентрация B. thuringiensis ssp. toumanoffi 25 в воздухе, кл./м3;
П — количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;
1 000 — коэффициент перерасчета на 1 м3 воздуха;
C — скорость аспирации воздуха, л/мин;
12. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по следующей форме:
Протокол № количественного микробиологического анализа штамма B. thuringiensis ssp. toumanoffi 25 в атмосферном воздухе населенных мест
1. Дата проведения анализа ________________________________________________
2. Рабочее место (профессия работающего) __________________________________
3. Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы) ____________________________
3. Вид пробоотборника _____________________________________________________
4. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб ____
5. Питательная среда, время инкубации _____________________________________
6. Результаты испытания ростовых свойств питательной среды ________________
7. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний) __________________________________________
8. Результаты идентификации микроорганизмов B. thuringiensis ssp.
toumanoffi 25 (микроморфологические признаки) __________________________
9. Результаты расчета концентрации штамма _________________________________
10. Соотношение полученных результатов с уровнем ПДКа.в. __________________
11. Отбор пробы проведен (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _______________
12. Идентификация штамма и расчет концентрации проведены (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _____________________________________________