МУК 4.2.3438-17. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Микробиологическое измерение концентрации Trichoderma asperellum OPF-19 в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 22.02.2017)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 22 февраля 2017 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗМЕРЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ TRICHODERMA ASPERELLUM OPF-19 В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.3438-17
1. Разработаны и подготовлены ФГБОУ ВО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России (Н.И. Шеина).
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 22 декабря 2016 г. № 2).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 22 февраля 2017 г.
1. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода микробиологического количественного анализа концентрации Trichoderma asperellum OPF-19 в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 50 000 клеток в 1 м3 воздуха.
1.2 Методические указания носят рекомендательный характер.
2. Биологическая характеристика штамма Trichoderma asperellum OPF-19 и его гигиенический норматив в атмосферном воздухе населенных мест
Мицелиальный гриб Trichoderma asperellum OPF-19 является действующей субстанцией фунгицида «Оргамика Ф, Ж (титр не менее 1 x 108 КОЕ/мл).»
Источником выделения штамма является поверхность корней томатов, выращенных в условиях открытого грунта в Высокогорском районе Республики Татарстан.
Штамм отличается наличием широкого спектра антагонистической активности по отношению к фитопатогенным грибам, является быстрорастущим как в условиях in vitro, так и в естественной среде. Штамм проявляет способность эффективно колонизировать поверхность корней растений.
Систематическое положение микроорганизма
| Класс | Fungi imperfecti |
|---|---|
| Порядок | Hyphomycetales |
| Род | Trichoderma |
| Вид | asperellum |
| Штамм | OPF-19 |
Культурально-морфологические признаки. Растет на агаризованных средах (Мальц-агар, среда Чапека с дрожжевым автолизатом, сусло-агар, глюкозо-картофельный агар, среда Сабуро) при температуре 29 — 34 °C в течение 7 суток, pH 3,5 — 5,0.
После 72 часов роста на глюкозо-картофельном агаре при температуре 30 °C колония штамма T. asperellum OPF-19 имеет максимальный диаметр 55 — 65 мм. Колонии образуют несколько концентрических колец, на поверхности которых заметно интенсивное спороношение.
В центральной части колония более темная, которая раньше, чем периферия приобретает зеленую окраску. По мере удаления от центра формируется воздушный мицелий. При культивировании при температуре 25 °C в отсутствие света, конидии формируются через 35 — 45 часов. Диффузии пигмента в агар не происходит, у старых колоний присутствует слабый специфический запах.
При росте на агаризованной среде Сабуро в течение 5 суток при температуре 25 °C конидиальная зона сформирована конидиеносцами, сгруппированными в коремии и спородохии, имеющими вид многочисленных компактных подушечек диаметром до 2 мм, изначально белого цвета, с возрастом — зеленого, подушечки образуются по всей поверхности колонии, обильно.
Конидиеносцы чаще формируются в подушечках и редко на воздушном мицелии, конидиеносцы симметричные, завершаются четырьмя фиалидами. Парные ответвления формируются ниже верхушки конидиеносца и располагаются под углом около 90° по отношению к основной оси. Первичные ветки, по мере удаления от верхушки, удлиняются, парные ответвления имеют одинаковую длину, на боковых ветвях первого порядка формируются неветвящиеся боковые ветви второго порядка. Ширина конидиеносца 2,1 — 5,0 мкм.
Фиалиды образуются на концах ветвей первого и второго порядка, образуются скопления из 2 — 4 фиалид. Фиалиды прямые, колбовидные, немного расширенные в середине, длина — 5 - 10 мкм, ширина — 2,2 — 5,7 мкм. Интеркалярные фиалиды не формируются. Конидии имеют темно-зеленый цвет, форма — немного яйцевидная, часто ближе к шаровидной, диаметр — 3,5 — 4 мкм.
Штамм Trichoderma asperellum OPF-19 по критериям вирулентности, токсичности, токсигенности и диссеминации относится к непатогенным для теплокровных животных микроорганизмов.
Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест — 5 000 кл./м3.
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 50 000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
4. Методы измерений
Метод основан на аспирации из атмосферного воздуха населенных мест мицелиального гриба на среде Сабуро и подсчете количества выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1 Средства измерений
| Барометр-анероид с диапазоном измерения атмосферного давления 5 — 790 мм рт. ст. и с пределом допустимой погрешности +/- 2,5 мм рт. ст. | ТУ 2504-1799-75 |
|---|---|
| Весы лабораторные, аналитические, наибольший предел взвешивания 110 г, предел допустимой погрешности +/- 0,2 мг | ГОСТ Р 53228-08 |
| Колбы мерные 2-100-2, 2-250-2, 2-1000-2 | ГОСТ 1770-74 |
| Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1,0; 2,0; 5,0; 10 см3 | ГОСТ 29227-91 |
| Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 25 и 50 см3 | ГОСТ 1770-74 |
| Термометр лабораторный шкальный, пределы измерения 0 — 55 °C | ТУ 25-2021.003-88 |
| Аспирационный аппарат и устройство для отбора проб воздуха |
Примечание. Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.
5.2 Вспомогательные устройства и материалы
| Шкаф сушильный стерилизационный, позволяющий поддерживать температуру (160 +/- 5) °C | ТУ 9452-010-00141798-02 |
| Термостаты, позволяющие поддерживать рабочую температуру (27 +/- 2) и (37 +/- 2) °C | ТУ 9452-002-00141798-97 |
| Автоклав электрический | ГОСТ 9586-75 |
| Стерилизаторы паровые медицинские | ГОСТ Р ЕН 13060-2011, ГОСТ Р 51935-02 |
| Дистиллятор | ТУ 4952-007-33142130-2000 |
| Облучатель бактерицидный настенный | ТУ 9444-015-03965956-08 |
| Холодильник бытовой | ГОСТ 26678-85 |
| Микроскоп биологический с иммерсионной системой | |
| Лупа с увеличением x10 | ГОСТ 25706-83 |
| Пробирки типов П1, П2 | ГОСТ 25336-82 |
| Спиртовки лабораторные стеклянные | ГОСТ 23932-90 |
| Чашки биологические (Петри) | ГОСТ 23932-90 |
| Воронки конусные диаметром 40 — 45 мм | ГОСТ 25336-82 |
| Груша резиновая | ТУ 9398-005-0576-9082-03 |
| Петля бактериологическая | |
| Марля медицинская | ГОСТ 9412-77 |
| Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81 | |
| Бумага фильтровальная лабораторная | ГОСТ 12026-76 |
| Примечание. Допускается применение оборудования и материалов с аналогичными или лучшими техническими характеристиками. | |
5.3 Реактивы и питательные среды
| Вода дистиллированная | ГОСТ 6709-90 |
| Натрий хлористый, хч ГОСТ 4233-77 | |
| Спирт этиловый ректификованный | ГОСТ Р 51652-2000 или ГОСТ 18300-87 |
| Спирт этиловый технический | ГОСТ 17299-78 |
| Бензилпенициллина натриевая соль | |
| Тетрациклин | |
| Примечание. Допускается использование других питательных сред и диагностических препаратов с аналогичными характеристиками. | |
| 6. Требования безопасности | |
При выполнении измерений концентрации клеток в атмосферном воздухе населенных мест соблюдают требования, изложенные в следующих документах.
6.1. Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней: СП 1.3.2322-08.
6.2. Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности (опасности) и возбудителями паразитарных болезней. Дополнения и изменения № 1 к СП 1.3.2322-08: СП 1.3.2518-09.
6.3. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.
6.4. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Приготовление сред, подготовку к анализу проводят в следующих условиях:
| - температура воздуха | (20 +/- 5) °C; |
|---|---|
| - атмосферное давление | (60 +/- 20) мм рт. ст.; |
| - влажность воздуха | не более 80%. |
9. Приготовление питательных сред
Для приготовления агаризованной среды Сабуро 62 г препарата размешивают в 1 дм3 воды, кипятят до полного растворения препарата и фильтруют через ватно-марлевый тампон. Стерилизуют среду в течение 15 мин при температуре (121 +/- 1) °C. Для подавления роста посторонней микрофлоры в готовую и охлажденную до температуры (48 +/- 2) °C среду добавляют по 100 мг бензилпенициллина и тетрациклина, после чего разливают в чашки Петри.
Среду хранят в герметично закрытой упаковке в помещении с относительной влажностью не более 60% и температурой от 5 до 25 °C.
10. Проведение измерения
10.1 Условия отбора проб воздуха
Отбор проб воздуха проводят в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» и Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».
Для этого воздух аспирируют при помощи пробоотборника на поверхность плотной питательной среды в соответствии с технической документацией (инструкцией) на прибор. Время аспирации и объем отбираемого воздуха зависит от предполагаемой концентрации микроорганизма.
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают 96%-м этиловым спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенки прибора, наружную и внутреннюю стенки крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо (количество питательной среды в чашки вносят в соответствии с инструкцией к прибору). После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
10.2 Выполнение анализа
При выполнении анализа воздуха стерильную среду Сабуро расплавляют, остужают до температуры (48 +/- 2) °C и разливают в чашки Петри.
Контроль чистоты розлива проводят в соответствии с п. 7.1.1 МУК 4.2.2316-08. Для этого чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °C не менее чем на 18 часов. Проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. Разлитую в чашки питательную среду хранят при температуре (2 — 8) °C не более 10 дней.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат с температурой (27 +/- 2) °C. Через 5 — 7 суток проводят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам.
Ростовые свойства используемой питательной среды должны быть проверены до проведения анализа воздуха в соответствии с требованиями к ростовым свойствам питательных сред, руководствуясь МУК 4.2.2316-08. Для этого эталонный музейный штамм Trichoderma asperellum OPF-19 высевается на 2 — 3 чашки используемой среды.
Лиофилизованную культуру музейного штамма необходимо использовать 2 — 3 пассажа во избежание потери заданных ей ростовых свойств.
11. Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации клеток проводят по формуле:
\text{К } = \frac{\text{П } \cdot 1000}{\text{С } \cdot \text{Т}} \text{кл}./\text{м}^{3}, где
К — концентрация Trichoderma asperellum OPF-19 в воздухе, кл./м3;
П — количество типичных колоний, выросших на чашке Петри;
1 000 — коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;
С — скорость аспирации воздуха, л/мин;
12. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по следующей форме.
Протокол № количественного микробиологического анализа штамма Trichoderma asperellum OPF-19 в атмосферном воздухе населенных мест
1. Дата проведения анализа ________________________________________________
2. Рабочее место (профессия работающего) __________________________________
3. Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы) ____________________________
4. Вид пробоотборника _____________________________________________________
5. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб ____
6. Питательная среда, время инкубации _____________________________________
7. Результаты испытания ростовых свойств питательной среды ________________
8. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний) __________________________________________
9. Результаты идентификации микроорганизмов Trichoderma asperellum OPF-19 (микроморфологические признаки) ________________________________________
10. Результаты расчета концентрации штамма
11. Соотношение полученных результатов с уровнем \text{ПДК}_{\text{а}.\text{в}.} ___________________
12. Отбор пробы проведен (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _______________
13. Идентификация штамма и расчет концентрации проведены (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _________________________________________________