МУК 4.2.3034-12. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum TW-420 ВКМ F-3880D — продуцента целлюлаз, бета-глюканазы и ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания
(утв. и введены в действие Роспотребнадзором 20.07.2012)
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
20 июля 2012 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК МИЦЕЛИАЛЬНОГО ГРИБА TRICHODERMA LONGIBRACHIATUM TW-420 ВКМ F-3880D — ПРОДУЦЕНТА ЦЕЛЛЮЛАЗ, БЕТА-ГЛЮКАНАЗЫ И КСИЛАНАЗЫ В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.3034-12
с момента утверждения
1. Разработаны ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России (д.б.н. Н.И. Шеина).
2. Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».
3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 20 июля 2012 г.
1. Общие положения и область применения
Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum TW-420 ВКМ F-3880D — продуцента целлюлаз, \beta - \text{глюконазы} и ксиланазы в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 5000 клеток в 1 м3 воздуха.
Методические указания разработаны с целью обеспечения микробиологического контроля штамма Tr. longibrachiatum TW-420 ВКМ F-3880D в атмосферном воздухе и оценки соответствия уровня его содержания гигиеническим нормативам на основе учета требований ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» и ГОСТ 8.563-96 «ГСИ. Методики выполнения измерений».
Методические указания предназначены для применения в организациях Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также в санитарных лабораториях биотехнологических предприятий, микробиологических лабораториях научно-исследовательских институтов, работающих в области гигиены окружающей среды и аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.
2. Биологическая характеристика плесневого гриба Tr. longibrachiatum TW-420 BKM F-3880D и его гигиенический норматив
Штамм мицелиального гриба Trichoderma longibrachiatum TW-420 ВКМ F-3880D является продуцентом комплекса целлюлаз, \beta - \text{глюконазы} и ксиланазы. Получен с помощью методов многоступенчатого мутагенеза и селекции из исходной культуры Tr. longibrachiatum TW-307 BKM F-3865D. Депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН под номером ВКМ F-3880D.
Растет на агаризованных средах (Мальц-агар, глюкозо-картофельный агар, среда Чапека с дрожжевым автолизатом, сусло-агар) при t 29 — 34 °C в течение 7 суток, pH 3,5 — 5,0.
При росте на Мальц-агаре диаметр колоний достигает 80 — 90 мм на 7-е сутки при росте при t 25 °C. Мицелий развит преимущественно субстратный, воздушный мицелий — скудный, белого цвета. Цвет колонии первоначально белый, затем при формировании спор — зеленый. Обратная сторона колоний имеет светло-зеленовато-желтоватую окраску.
При микроскопировании штамм имеет конидии, которые формируются в многочисленных компактных подушечках диаметром до 2 мм. Конидиеносцы бесцветные, гладкостенные формируются на субстратном мицелии, главные ветви которого длинные и прямые, иногда извитые. Боковые ветви короткие, формируются через неравные интервалы под углом к главным ветвям. Фиалиды одиночные, булавовидные или бутыловидные, размер 5 — 10 x 2 — 3 мкм. Конидии одноклеточные, зеленоватые, гладкостенные, эллипсоидные размером 4 — 7 x 2 — 4 мкм собраны в мелкие головки на вершинах фиалид.
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток плесневого гриба в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 5000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.
4. Метод измерений
Метод основан на аспирации из воздуха клеток плесневого гриба на поверхность плотной питательной среды и подсчета выросших колоний по типичным культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1 Средства измерений, вспомогательные
устройства, материалы
Импактор микробиологический "Флора-100" ТУ 9443-001-05031637-02 Прибор для бактериологического анализа ТУ 64-12791-77
воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) Прибор MAS 100 ECO фирмы Merk (Германия) для отбора проб воздуха Термостаты электрические суховоздушные или водяные
Автоклав электрический ГОСТ 9586-75 Бокс, оборудованный бактерицидными лампами Холодильник бытовой Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200 Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211
Лупа с увеличением x10 ГОСТ 25706-83
Чашки Петри бактериологические плоскодонные ГОСТ 23932-90 стеклянные диаметром 90 мм
Пробирки бактериологические П1 и П2 ГОСТ 25336-82 вместимостью 15 и 20 мл
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 1770-74
Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74
Секундомер ГОСТ 9586-75 Барометр ГОСТ 24696-79
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 5556-81
5.2 Реактивы, растворы
D-Глюкоза ГОСТ 6038-79 (возможно заменить раствором глюкозы для инъекций)
Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72
Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67
Кислота молочная пищевая ГОСТ 490-79 (для подкисления среды и подавления посторонней бактериальной флоры) Глюкозо-картофельный агар, г/л (очищенный картофель — 200, агар — 18 — 20, pH 4,5 — 5,0, режим стерилизации 1,1 — 1,2 ати в течение 30 мин, глюкоза — 15 — 20 перед использованием)
Среда Гетчинсона, г/л (KH PO - 0,1; NaCl - 0,1;
2 4
CaCl - 0,1; FeCl - 0,1; MgSO x 7H O - 0,3;
2 3 4 2
NaNO - 2,5; агар - 2,0; дистиллированная вода)
3
0,5%-й водный раствор карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), вязкость \mu 10 мПас, t 25 °C, вискозиметр Брукфильда LVF 0,1%-й раствор Конго красного (congo rot)
6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в атмосферном воздухе соблюдают следующие требования.
6.1. СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами».
6.2. ГОСТ 12.1.005-88 «Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами».
6.3. ГОСТ 12.1.019-79 «Электробезопасность при работе с электроустановками» и инструкции по эксплуатации прибора.
6.4. Руководство «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980), «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).
6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, атмосферном давлении (760 +/- 20) мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.
9. Проведение измерения
9.1 Условия отбора проб воздуха
Для определения концентрации клеток мицелиального гриба воздух аспирируют при помощи одного из пробоотборников со скоростью 10 — 100 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (5 — 20 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента и вида пробоотборника.
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2 Выполнение анализа
При выполнении анализа воздуха прямым методом глюкозо-картофельный агар расплавляют, остужают до 50 — 60 °C, добавляют глюкозу из расчета 15 — 20 г/л и молочную кислоту из расчета 2,0 мл на 500 мл среды (для подкисления среды и подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.
Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °C, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 29 °C. Через 4 — 7 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам и характерной окраске колоний микромицета с обратной стороны чашки.
При выполнении анализа атмосферного воздуха дополнительным методом пробы воздуха отбирают на среду Гетчинсона с добавлением 0,5%-й карбоксиметилцеллюлозы. Культивируют в термостате при t 28 °C в течение двух суток и проводят окрашивание 0,1%-м раствором Конго красным. Учет колоний штамма производится по зонам просветления, образующимся в результате ферментации целлюлозы под действием комплекса целлюлаз.
Ростовые свойства всех используемых питательных сред должны быть проверены в соответствии с «Требованиями к ростовым свойствам питательных сред» (Государственная Фармакопея СССР, изд. XI, вып. 2, с. 208), что позволит более полно оценить пределы ошибки метода. Для этого эталонный музейный штамм-продуцент высевается на 2 — 3 чашки каждой используемой среды.
10. Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м3 воздуха производят по формуле:
где X — концентрация клеток продуцента в воздухе;
N — количество колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 — коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;
V — объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).
В случае невозможности использования аппарата Кротова, рекомендуем применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 мин. При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента.
Эмпирически установлено, что за 5 мин на площадь 100 см2 оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, следовательно за 1 мин — количество бактерий из 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54 см2. Составляя пропорцию, определяем, что за 1 мин на стеклянную чашку Петри оседают клетки из 1,57 л/мин. Количество клеток в 1 м3 воздуха определяем по вышеприведенной формуле, где V = 1,57 л/мин x t (время аспирации, мин).
Предлагаемый метод является ориентировочным и может быть использован как вспомогательный метод.
11. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол № количественного микробиологического анализа штамма Tr. longibrachiatum TW-420 ВКМ F-3880D в атмосферном воздухе населенных мест
1. Дата проведения анализа ________________________________________________
2. Рабочее место (профессия работающего) __________________________________
3. Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы) _______________________________
4. Вид пробоотборника _____________________________________________________
5. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб ____
6. Питательная среда, время инкубации _____________________________________
7. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний, морфологические признаки, окраска по Грамму и др.) ____________________________________________________________________
8. Результаты идентификации микроорганизмов с указанием метода ____________
9. Результаты расчета концентрации штамма _________________________________
10. Соотношение полученных результатов с уровнем ПДК __________________ р.з.
11. Отбор пробы произведен (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _____________
12. Идентификация штамма и расчет концентрации произведены (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _________________________________________________
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. РД 52.04.186-96. Руководство по контролю загрязнения атмосферы
2. ГОСТ 8.563-96. ГСИ. Методики выполнения измерений
3. ГОСТ 17.2.4.02-81. Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ.