МУК 4.2.3033-12. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток плесневого гриба Penicillium verruculosum PV2007 BKM F-3972D — продуцента комплекса карбогидраз в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 20.07.2012)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации Г. Г. Онищенко 20 июля 2012 года

4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК ПЛЕСНЕВОГО ГРИБА PENICILLIUM VERRUCULOSUM PV2007 BKM F-3972D — ПРОДУЦЕНТА КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.3033-12

Дата введения: с момента утверждения

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Penicillium verruculosum PV2007 BKM F-3972D — продуцента комплекса карбогидраз в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 5000 клеток в 1 м3 воздуха.

Методические указания разработаны с целью обеспечения микробиологического контроля штамма P. verruculosum PV2007 BKM F-3972D в атмосферном воздухе и оценки соответствия уровня его содержания гигиеническим нормативам на основе учета требований ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ» и ГОСТ 8.563-96 «ГСИ. Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для применения в организациях Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также в санитарных лабораториях биотехнологических предприятий, микробиологических лабораториях научно-исследовательских институтов, работающих в области гигиены окружающей среды и аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

2. Биологическая характеристика плесневого гриба Penicillium verruculosum PV2007 BKM F-3972D и его гигиенический норматив

Штамм мицелиального гриба Penicillium verruculosum PV2007 BKM F-3972D является продуцентом ряда карбогидраз (комплекса целлюлаз, целлобиаз и сопутствующих ферментов — ксиланазы и ксилоглюканазы). Получен с помощью методов многоступенчатого мутагенеза и селекции из исходной культуры P. verruculosum 27K BKM F-3764D. Депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН под номером BKM F-3972D.

Растет на агаризованных средах (среда Чапека с дрожжевым автолизатом, Мальц-агар, глюкозо-картофельный агар, сусло-агар) при t 26 — 30 °C в течение 7 — 10 суток, pH 4,5 — 5,0. При t 5 °C рост колоний не наблюдается.

На среде Чапека с дрожжевым автолизатом колонии достигают 23 — 24 мм, поверхность сильно радиально складчатая, плотная, тонкая, ростовая зона врастает в агар, имеет ширину 1,5 — 2,0 мм. Мицелий светло-желтоватый, шерстистый, центр колонии выпуклый, конидиогенез слабый, серо-зеленоватого оттенка. Экссудата и растворимого пигмента нет. Обратная сторона светлая, в центре колонии — палево-оранжевая.

При микроскопировании штамм имеет конидиеносцы двухъярусные, терминальные, бивертициллятные, гладкие длиной около 150 мкм, шириной 2 — 3 мкм. Метулы расходящиеся размером 10 — 13 x 2,5 — 3,0 мкм, фиалиды ампуллиформные размером 7 — 8 x 2,8 — 3,0 мкм. Конидии округлые, шероховатые размером 3,0 — 3,5 мкм.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток плесневого гриба в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 50 до 5000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод основан на аспирации из воздуха клеток плесневого гриба на поверхность плотной питательной среды и подсчете выросших колоний по типичным культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы

Импактор микробиологический «Флора-100» ТУ 9443-001-05031637-02

Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791-77

Прибор MAS-100 ECO фирмы Merk (Германия) для отбора проб воздуха

Термостаты электрические суховоздушные или водяные

Автоклав электрический ГОСТ 9586-75

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

Холодильник бытовой

Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200

Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211

Лупа с увеличением x 10 ГОСТ 25706-83

Чашки Петри бактериологические плоскодонные стеклянные диаметром 90 мм ГОСТ 23932-90

Пробирки бактериологические П1 и П2 вместимостью 15 и 20 мл ГОСТ 25336-82

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 1770-74

Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74

Секундомер                                       ГОСТ 9586-75
Барометр                                         ГОСТ 24696-79

Марля медицинская ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81

5.2. Реактивы, растворы

Агар микробиологический ГОСТ 17206-84

D-Глюкоза (возможно заменить раствором глюкозы для инъекций) ГОСТ 6038-79

Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72

Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67

Кислота молочная пищевая (для подкисления среды и подавления посторонней бактериальной флоры) ГОСТ 490-79

Глюкозо-картофельный агар, г/л (очищенный картофель — 200, агар — 18 — 20, pH 4,5 — 5,0, режим стерилизации 1,1 — 1,2 ати в течение 30 мин, глюкоза — 15 — 20 перед использованием)

Среда Гетчинсона, г/л ( KH_{2}PO_{4} — 0,1; NaCl — 0,1; CaCl_{2} — 0,1; FeCl_{3} — 0,1; MgSO_{4} \times 7H_{2}O — 0,3; NaNO_{3} — 2,5; агар — 2,0; дистиллированная вода)

0,5%-й водный раствор карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), вязкость \mu 10 мПас, t 25 °C, вискозиметр Брукфильда LVF

0,1%-й раствор Конго Красного (congo rot)

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в атмосферном воздухе соблюдают следующие требования.

6.1. Санитарные правила СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами».

6.2. ГОСТ 12.1.005-88 «Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами».

6.3. ГОСТ 12.1.019-79 «Электробезопасность при работе с электроустановками».

6.4. Руководство «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980), «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, атмосферном давлении (760 +/- 20) мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

9. Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Для определения концентрации клеток плесневого гриба воздух аспирируют при помощи одного из пробоотборников со скоростью 10 — 100 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (5 — 20 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента и вида пробоотборника.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2. Выполнение анализа

При выполнении анализа воздуха прямым методом глюкозо-картофельный агар расплавляют, остужают до 50 — 60 °C, добавляют глюкозу из расчета 15 — 20 г/л и молочную кислоту из расчета 2,0 мл на 500 мл среды (для подкисления среды и подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °C, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 29 °C. Через 4 — 7 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам и характерной окраске колоний микромицета с обратной стороны чашки.

При выполнении анализа воздуха дополнительным методом пробы воздуха отбирают на среду Гетчинсона с добавлением 0,5%-й карбокси-метилцеллюлозы. Культивируют в термостате при t 28 °C в течение двух суток и проводят окрашивание 0,1%-м раствором Конго красным. Учет колоний штамма производится по зонам просветления, образующимся в результате ферментации целлюлозы под действием комплекса целлюлаз.

Ростовые свойства всех используемых питательных сред должны быть проверены в соответствии с «Требованиями к ростовым свойствам питательных сред» (Государственная Фармакопея СССР, изд. XI, вып. 2, с. 208), что позволит более полно оценить пределы ошибки метода. Для этого эталонный музейный штамм-продуцент высевается на 2 — 3 чашки каждой используемой среды.

10. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м3 воздуха производят по формуле:

X = \frac{N \cdot 1000}{V} \text{кл}./\text{м}^{3} ,

где X — концентрация клеток продуцента в воздухе;

N — количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 — коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;

V — объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

В случае невозможности использования аппарата Кротова рекомендуем применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 мин. При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента.

Эмпирически установлено, что за 5 мин на площадь 100 см2 оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, следовательно, за 1 мин — количество бактерий из 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54 см2. Составляя пропорцию, определяем, что за 1 мин на стеклянную чашку Петри оседают клетки из 1,57 л/мин. Количество клеток в 1 м3 воздуха определяем по вышеприведенной формуле, где V = 1,57 л/мин x t (время аспирации, мин).

Предлагаемый метод является ориентировочным и может быть использован как вспомогательный метод.

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Протокол № количественного микробиологического анализа штамма P. verruculosum PV2007 BKM F-3972D в атмосферном воздухе населенных мест

1. Дата проведения анализа ________________________________________________

2. Рабочее место (профессия работающего) __________________________________

3. Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы) _______________________________

4. Вид пробоотборника _____________________________________________________

5. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб ____

6. Питательная среда, время инкубации _____________________________________

7. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний, морфологические признаки, окраска по Грамму и др.) ______________________________________________________________________

8. Результаты идентификации микроорганизмов с указанием метода ____________

9. Результаты расчета концентрации штамма _________________________________

10. Соотношение полученных результатов с уровнем ПДК __________________ а.в.

11. Отбор пробы произведен (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _____________

12. Идентификация штамма и расчет концентрации произведены (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _________________________________________________

Список литературы

1. РД 52.04.186-96 «Руководство по контролю загрязнения атмосферы». М., 1991, 693 с.

2. ГОСТ 8.563-96 «ГСИ. Методики выполнения измерений».

3. ГОСТ 17.2.4.02-81 «Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ». М.: Изд-во стандартов, 1981, 3 с.

---