МУК 4.2.3032-12. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток плесневого гриба Penicillium verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D — продуцента комплекса карбогидраз в воздухе рабочей зоны. Методические указания.

(утв. и введены в действие Роспотребнадзором 20.07.2012)

20 июля 2012 года

4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК ПЛЕСНЕВОГО ГРИБА PENICILLIUM VERRUCULOSUM PV2007 ВКМ F-3972D — ПРОДУЦЕНТА КОМПЛЕКСА КАРБОГИДРАЗ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.3032-12

с момента утверждения

1. Разработаны ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова» Минздрава России (д.б.н. Н.И. Шеина).

2. Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».

3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 20 июля 2012 г.

4. Введены впервые.

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Penicillium verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D — продуцента комплекса карбогидраз в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 м3 воздуха.

Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и ГОСТ Р 8.563-96 «ГСИ. Методики выполнения измерений».

Методические указания предназначены для применения в организациях Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также в санитарных лабораториях биотехнологических предприятий, микробиологических лабораториях научно-исследовательских институтов, работающих в области гигиены окружающей среды и аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

2. Биологическая характеристика плесневого гриба Penicillium verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D и его гигиенический норматив

Штамм мицелиального гриба Penicillium verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D является продуцентом ряда карбогидраз (комплекса целлюлаз, целлобиаз и сопутствующих ферментов — ксиланазы и ксилоглюканазы). Получен с помощью методов многоступенчатого мутагенеза и селекции из исходной культуры P. verruculosum 27K ВКМ F-3764D. Депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН под номером ВКМ F-3972D.

Растет на агаризованных средах (среда Чапека с дрожжевым автолизатом, Мальц-агар, глюкозо-картофельный агар, сусло-агар) при t 26 — 30 °C в течение 7 — 10 суток, pH 4,5 — 5,0. При t 5 °C рост колоний не наблюдается.

На среде Чапека с дрожжевым автолизатом колонии достигают 23 — 24 мм, поверхность сильно радиально складчатая, плотная, тонкая, ростовая зона врастает в агар, имеет ширину 1,5 — 2,0 мм. Мицелий светло-желтоватый, шерстистый, центр колонии выпуклый, конидиогенез слабый, серо-зеленоватого оттенка. Экссудата и растворимого пигмента нет. Обратная сторона светлая, в центре колонии — палево-оранжевая.

При микроскопировании штамм имеет конидиеносцы двухъярусные, терминальные, бивертициллятные, гладкие длиной около 150 мкм, шириной 2 — 3 мкм. Метулы расходящиеся размером 10 — 13 x 2,5 — 3,0 мкм, фиалиды ампуллиформные размером 7 — 8 x 2,8 — 3,0 мкм. Конидии округлые, шероховатые размером 3,0 — 3,5 мкм.

3. Пределы измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток плесневого гриба в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 50 до 50000 клеток в 1 м3 воздуха при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод основан на аспирации из воздуха клеток плесневого гриба на поверхность плотной питательной среды и подсчета выросших колоний по типичным культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1 Средства измерений, вспомогательные

Импактор микробиологический "Флора-100"             ТУ 9443-001-05031637-02
Прибор для бактериологического анализа              ТУ 64-12791-77

воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) Прибор MAS 100 ECO фирмы Merk (Германия) для отбора проб воздуха Термостаты электрические суховоздушные или водяные

Автоклав электрический ГОСТ 9586-75 Бокс, оборудованный бактерицидными лампами Холодильник бытовой Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200 Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211

Лупа с увеличением x10 ГОСТ 25706-83

Чашки Петри бактериологические плоскодонные ГОСТ 23932-90 стеклянные диаметром 90 мм

Пробирки бактериологические П1 и П2 ГОСТ 25336-82 вместимостью 15 и 20 мл

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75

Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 1770-74

Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74

Секундомер                                          ГОСТ 9586-75
Барометр                                            ГОСТ 24696-79

Марля медицинская ГОСТ 9412-77

Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 5556-81

5.2 Реактивы, растворы

Агар микробиологический ГОСТ 17206-84

D-Глюкоза ГОСТ 6038-79 (возможно заменить раствором глюкозы для инъекций)

Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72

Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67

Кислота молочная пищевая ГОСТ 490-79 (для подкисления среды и подавления посторонней бактериальной флоры) Глюкозо-картофельный агар, г/л (очищенный картофель — 200, агар — 18 — 20, pH 4,5 — 5,0, режим стерилизации 1,1 — 1,2 ати в течение 30 мин, глюкоза — 15 — 20 перед использованием)

Среда Гетчинсона, г/л (KH PO  - 0,1; NaCl - 0,1;
                         2  4
CaCl  - 0,1; FeCl  - 0,1; MgSO  x 7H O - 0,3;
    2            3            4     2
NaNO  - 2,5; агар - 2,0; дистиллированная вода)

3

0,5%-й водный раствор карбоксиметилцеллюлозы (КМЦ), вязкость \mu 10 мПас, t 25 °C, вискозиметр Брукфильда LVF 1%-й раствор Конго красного (congo rot)

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.

6.1. Санитарные правила СП 1.3.2322-08 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами».

6.2. ГОСТ 12.1.005-88 «Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами».

6.3. ГОСТ 12.1.019-79 «Электробезопасность при работе с электроустановками» и инструкции по эксплуатации прибора.

6.4. Руководство «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980), «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).

6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускаются лица с высшим или средним специальным образованием, прошедшие соответствующую подготовку и имеющие навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, атмосферном давлении (760 +/- 20) мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.

9. Проведение измерения

9.1 Условия отбора проб воздуха

Для определения концентрации клеток плесневого гриба воздух аспирируют при помощи пробоотборника «Флора» со скоростью 100 л/мин на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1 — 10 мин) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма-продуцента и марки пробоотборника.

Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска, прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.

9.2 Выполнение анализа

При выполнении анализа воздуха прямым методом глюкозо-картофельный агар расплавляют, остужают до 50 — 60 °C, добавляют глюкозу из расчета 15 — 20 г/л и молочную кислоту из расчета 2,0 мл на 500 мл среды (для подкисления среды и подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри.

Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °C, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 29 °C. Через 4 — 7 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам и характерной окраске колоний микромицета с обратной стороны чашки.

При выполнении анализа дополнительным методом пробы воздуха отбирают на среду Гетчинсона с добавлением 0,5%-й карбоксиметилцеллюлозы. Культивируют в термостате при t 28 °C в течение двух суток и проводят окрашивание 0,1%-м раствором Конго красным. Учет колоний штамма производится по зонам просветления, образующимся в результате ферментации целлюлозы под действием комплекса целлюлаз.

Ростовые свойства всех используемых питательных сред должны быть проверены в соответствии с «Требованиями к ростовым свойствам питательных сред» (Государственная Фармакопея СССР, изд. XI, вып. 2, с. 208), что позволит более полно оценить пределы ошибки метода. Для этого эталонный музейный штамм-продуцент высевается на 2 — 3 чашки каждой используемой среды.

10. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 м3 воздуха производят по формуле:

где X — концентрация клеток продуцента в воздухе;

N — количество колоний продуцента, выросших на чашке;

1000 — коэффициент пересчета на 1 м3 воздуха;

V — объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).

В случае невозможности использования аппарата Кротова, рекомендуем применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 30 мин. При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента.

Эмпирически установлено, что за 5 мин на площадь 100 см2 оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, следовательно за 1 мин — количество бактерий из 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм равна 78,54 см2. Составляя пропорцию, определяем, что за 1 мин на стеклянную чашку Петри оседают клетки из 1,57 л/мин. Количество клеток в 1 м3 воздуха определяем по вышеприведенной формуле, где V = 1,57 л/мин x t (время аспирации, мин).

Предлагаемый метод является ориентировочным и может быть использован как вспомогательный метод.

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Протокол № количественного микробиологического анализа штамма Penicillium verruculosum PV2007 ВКМ F-3972D в воздухе рабочей зоны

1. Дата проведения анализа ________________________________________________

2. Рабочее место (профессия работающего) __________________________________

3. Место отбора пробы (название и адрес организации, производство, технологическая стадия, точка отбора пробы) _______________________________

4. Вид пробоотборника _____________________________________________________

5. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб ____

---

6. Питательная среда, время инкубации _____________________________________

7. Количественная и качественная характеристика выросших колоний (количество типичных колоний, морфологические признаки, окраска по Грамму и др.) ____________________________________________________________________

8. Результаты идентификации микроорганизмов с указанием метода ____________

9. Результаты расчета концентрации штамма _________________________________

10. Соотношение полученных результатов с уровнем ПДК __________________ р.з.

11. Отбор пробы произведен (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _____________

12. Идентификация штамма и расчет концентрации произведены (Ф.И.О., должность, дата, подпись) _________________________________________________

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. ГОСТ 12.1.005-88. ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования

2. ГОСТ 8.563-96. ГСИ. Методики выполнения измерений

3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности

4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности.

---