МУК 4.2.2725-10. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток дрожжевого гриба Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 — продуцента липазы в воздухе рабочей зоны. Методические указания
(утв. Роспотребнадзором 04.08.2010)
Примечание
Документ введен в действие с 4 октября 2010 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
Г. Г. Онищенко
4 августа 2010 года
4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК ДРОЖЖЕВОГО ГРИБА YARROWIA LIPOLYTICA ВКПМ Y-3323 - ПРОДУЦЕНТА ЛИПАЗЫ В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ
МУК 4.2.2725-10
4 октября 2010 года
1. Разработаны ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет.
2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 10.06.2010 № 1).
3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 4 августа 2010 г.
4. Введены в действие с 4 октября 2010 г.
1. Общие положения и область применения
Настоящие Методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 — продуцента липазы в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 5 до 50000 клеток в 1 куб. м воздуха.
Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования» и ГОСТ Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений».
Методические указания предназначены для применения учреждениями Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, а также лабораториями организаций, аккредитованными в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.
Методические указания одобрены и рекомендованы секцией «Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды» Проблемной комиссии «Научные основы гигиены окружающей среды».
2. Биологическая характеристика дрожжевого гриба Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 и его гигиенический норматив
Штамм Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 является продуцентом липазы. Штамм создан с помощью генетических методов в ГосНИИ «Генетика» и депонирован в ВКПМ.
Для дрожжей данного вида липолитическая активность является таксономическим признаком. Оптимум температуры для продукции липазы дрожжами составляет 29 °C, pH среды 5,5. При температуре 42 °C не растет.
Способен расти в присутствии циклогексимида, обладает уреазной активностью, нитрат не использует, сахара не сбраживает. В роде один вид, известный своей способностью к интенсивному образованию липолитических и протеолитических ферментов. Телеоморфа — Candida paralipolytica. Встречается у человека и других млекопитающих, в зерне, маслинах и нефтепродуктах.
Систематическое положение микроорганизма
Класс Fungi imperfecti Порядок Blastomycetales Род Yarrowia Вид lipolytica Штамм ВКПМ Y-3323
На LB-агаре на 2-е и 3-и сутки вырастают колонии белого цвета, сухие, круглые, поднимающиеся над агаром. Края колонии ровные, у старой культуры возможно образование складок и концентрических кругов различной плотности. Максимальный диаметр — 10 — 12 мм.
Клетки круглые, эллипсоидные или удлиненные. Бесполое размножение — многосторонним почкованием на узком основании. Образуется псевдомицелий или истинный мицелий, который может иногда распадаться на артроспоры. Аски не конъюгативные, образуются из диплоидных клеток гиф. Оболочка аска быстро растворяется. В аске 1 — 4 аскоспоры шаровидные, полусферические или шляповидные.
Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны — 500 кл./куб. м, пометка А.
3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток плесневого гриба в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 5 до 50000 клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной вероятности 0,95.
4. Метод измерений
Метод основан на аспирации из воздуха клеток дрожжевого гриба на поверхность агаризованной среды и подсчете выросших колоний по типичным культурально-морфологическим и физиолого-биохимическим признакам на 3-и сутки.
5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.
5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы
Импактор микробиологический «Флора-100» ТУ 9443-001-05031637-2002
Прибор для бактериологического анализа воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791-77
Прибор MAS-100 ECO фирмы «Merk» (Германия) для отбора проб воздуха
Термостаты электрические суховоздушные или водяные
Автоклав электрический ГОСТ 9586-75
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа «Биолам» Л-211
Лупа с увеличением х10 ГОСТ 25706-83
Чашки Петри бактериологические плоскодонные стеклянные диаметром 90 мм ГОСТ 23932-90
Пробирки бактериологические П1 и П2 вместимостью 15 и 20 мл ГОСТ 25336-82
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 1770-74
Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74
Секундомер ГОСТ 9586-75 Барометр ГОСТ 24696-79
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81
5.2. Реактивы, растворы
LB-агар (дрожжевой экстракт 5 г/л, триптон 10 г/л, NaCl 5 г/л, агар 15 г/л, режим
стерилизации 1,1 — 1,2 ати в течение 30 мин.)
Желточный агар (пептон - 20 г, Na HPO - 2,5 г, 2 4 NaCl - 1 г, MgSO 0,5%-ный раствор - 1 мл,
4
глюкоза — 1 г, агар — 12,5 г, дистиллированная вода — 500 мл, 1 куриный желток)
Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72
Спирт этиловый ректификат ГОСТ 5962-67
6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие требования.
6.1. Санитарные правила СП 1.2.731-99 «Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами».
6.2. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88.
6.3. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
6.4. Руководство «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980), «Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности» (1977).
6.5. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
8. Условия измерений
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °C, атмосферном давлении 740 — 760 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 70%.
9. Проведение измерения
9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения концентрации клеток микроорганизма воздух аспирируют при помощи пробоотборника со скоростью 100 л/мин. на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1 — 5 мин.) зависит от предполагаемой концентрации клеток штамма.
Аппарат перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора; наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
9.2. Выполнение анализа
Метод предполагает учет количества типичных колоний, выросших на 2 — 3-и сутки после посева проб воздуха по культурально-морфологическим признакам. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.
LD-агар расплавляют, остужают до 50 — 60 °C, добавляют циклогексемид из расчета 0,5 г на 1 л среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры и микромицетов), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности.
Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °C, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при температуре 29 — 30 °C. Через 2 — 3 суток производят подсчет выросших типичных по морфологическим признакам колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.
Дополнительным функциональным методом является отбор пробы воздуха на чашки Петри с желточным агаром.
Для приготовления желточного агара смешивают указанные выше компоненты, смесь кипятят до растворения агара, стерилизуют автоклавированием при 0,5 атм. и охлаждают до 60 °C. Скорлупу яйца дезинфицируют спиртом. Яйцо разбивают, отделяют желток от белка и переносят с соблюдением правил асептики в расплавленный агар. Агар перемешивают до получения однородной суспензии, разливают по чашкам и оставляют по полного затвердевания.
После отбора проб воздуха чашки инкубируют в термостате при 29 °C в течение 48 — 72 ч и внимательно просматривают в косом освещении. Вокруг колоний штамма, продуцирующего липазу, образуются маслянистые, блестящие с переливами или перламутровые зоны.
Ростовые свойства всех используемых питательных сред должны быть проверены в соответствии с «Требованиями к ростовым свойствам питательных сред» (Государственная Фармакопея СССР, изд. XI, вып. 2, с. 208), что позволит более полно оценить пределы ошибки метода. Для этого эталонный музейный штамм-продуцент высевается на 2 — 3 чашки каждой используемой среды.
10. Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле:
N х 1000
X — концентрация клеток продуцента в воздухе;
N — количество колоний продуцента, выросших на чашке;
V — объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).
11. Оформление результатов измерений
штамма-продуцента Yarrowia lipolytica ВКПМ Y-3323 в воздухе рабочей зоны
1. Наименование и адрес испытательной лаборатории (центра), проводящей измерения, аттестат аккредитации лаборатории.
2. Юридический и фактический адрес организации-заказчика.
3. Идентификация используемого метода, методики, ссылки на методы, используемые испытательной лабораторией.
4. Описание состояния объекта исследования.
Результаты микробиологического анализа
| Шифр или № пробы | Определяемый микроорганизм | Концентрация, кл./куб. м |
|---|
Список литературы
1. ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования».
2. ГОСТ Р 8.563-96 «ГСИ. Методики выполнения измерений».
3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. М., 1980, 27 с.
4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977, 7 с.