МУК 4.2.2656-10. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток штамма-продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 09.07.2010)

9 июля 2010 года

4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ.

БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК ШТАММА-ПРОДУЦЕНТА ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ ASPERGILLUS NIGER ВКПМ F-171 В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.2.2656-10

с момента утверждения

1. Разработаны Государственным образовательным учреждением высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И. Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», Государственным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом пищевых ароматизаторов, кислот и красителей Российской академии сельскохозяйственных наук (ГУ ВНИИПАКК РАСХН).

2. Рекомендованы Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека.

3. Утверждены Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 9 июля 2010 г.

4. Введены в действие с момента утверждения.

5. Введены впервые.

1. Общие положения и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма-продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171, селекционированного в ГУ ВНИИ пищевых ароматизаторов, кислот и красителей РАСХН (ГУ ВНИИПАКК), в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 куб. м воздуха.

Методические указания разработаны с целью обеспечения микробиологического контроля концентрации конидий штамма Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе производственных помещений биотехнологического производства лимонной кислоты и оценки соответствия уровня их содержания гигиеническим нормативам на основе учета требований ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования», ГОСТ Р 8.563-96 «Методики выполнения измерений» и Р 2.2.2006-05 «Руководство по гигиенической оценке факторов рабочей среды и трудового процесса. Критерии и классификация условий труда».

Методические указания предназначены для применения в лабораториях организаций, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.

2. Биологическая характеристика штамма-продуцента Aspergillus niger ВКПМ F-171 и его гигиенический норматив

Продуцент лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171 относится к микромицетам. Уже на 2-е сутки на поверхности среды Чапека или сусло-агара при температуре 32 °C клетки (кл.) образуют округлые колонии диаметром 2,0 см с плоским субстратным мицелием, аспорогенные. На 5-е сутки роста они достигают максимального диаметра в среднем 8,1 см на среде Чапека и 8,6 см — на сусло-агаре. Окраска гигантской колонии бежевая — на среде Чапека, светло-бежевая — на сусло-агаре. Воздушный мицелий сильно развит: от поверхности субстратного мицелия вертикально поднимаются несептированные клетки — конидиеносцы. Минимальная длина конидиеносца 48 мкм, максимальная — 1265 мкм. Диаметр поперечного сечения конидиеносца — от 9 до 20 мкм. Верхний конец конидиеносца расширяется, образуя вздутие — пузырек диаметром от 20 до 60 мкм. От поверхности пузырька синхронно образуются цилиндрические выросты — стеригмы двуслойной структуры. От каждой стеригмы первого слоя отделяются, в основном, две вторичные стеригмы. Стеригмы первого слоя вдвое крупнее, чем стеригмы второго слоя. Длина стеригм первого слоя — от 6 до 32 мкм, второго слоя — от 5 до 10 мкм. Стеригмы второго слоя образуют цепочки конидий, созревание которых начинается на вторые сутки. Конидии имеют шарообразную форму, диаметр — 4,1 мкм, толстую пигментированную оболочку с шипами. Вздутие конидиеносца, стеригмы и конидии являются составляющими конидиальной головки, диаметр сечения которой колеблется от 44 до 132 мкм. В центре колонии конидиальные головки расположены плотно. От центра к краю колонии конидиальные головки мельче. По краю колонии в радиусе 0,5 см — на среде Чапека и 0,6 см — на сусло-агаре наблюдается светлая зона с незрелыми белыми конидиальными головками, плотно прижатыми к субстратному мицелию. Обратная сторона колонии гладкая, белая.

Систематическое положение микроорганизма

    Царство                                         Fungi
    Подцарство                                      Neomycota
    Отдел                                           Ascomycota
    Подотдел                                        Euascomycotina
    Класс                                           Plectomycetes
    Порядок                                         Hyphomycetales
    Род                                             Aspergillus
    Вид                                             Niger
    Штамм                                           ВКПМ F-171, ГУ ВНИИПАКК

Штамм Aspergillus niger ВКПМ F-171 получен в ГУ ВНИИПАКК методом мутагенеза из штамма Aspergillus niger Л-1 с использованием химических мутагенов и УФ-облучения в сочетании с отбором спонтанных вариантов и депонирован в ВКПМ как продуцент лимонной кислоты.

Штамм растет на жидких агаризованных средах. Оптимальная температура — от 28 до 32 °C. Для размножения используется сусло-агар (значение Баллинга 7°).

Предельно допустимая концентрация Aspergillus niger ВКПМ F-171 в 3 воздухе рабочей зоны — 1 x 10 кл./куб. м, пометка А, класс опасности 3.

3. Пределы измерений

Методика позволяет выполнить измерения количества клеток продуцента лимонной кислоты в воздухе рабочей зоны в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 куб. м.

4. Метод измерений

Метод измерения концентрации конидий штамма-продуцента Aspergillus niger ВКПМ F-171 основан на аспирации из воздуха конидий микромицета на поверхность среды Чапека или сусло-агар, подсчета выросших колоний по типичным культурально-морфологическим признакам на 2-е сутки роста и контроля их развития на 5-е сутки роста.

5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы

При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.

5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства

Импактор воздуха микробиологический «Флора-100» ТУ 64-098-33-95

Термостаты электрические суховоздушные типа ТС ТУ 64-1-1382-76

Автоклав электрический

Бокс, оборудованный бактерицидными лампами

Холодильник бытовой ГОСТ 16317-87

Весы лабораторные аналитические ВЛА-200-М

Чашки Петри бактериологические плоскодонные, стеклянные, диаметром 100 мм ГОСТ 25336-82

Колбы конические ГОСТ 25336-82

Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа МБИ-15 ГОСТ 25706-83

Термометр

Прибор для определения влажности воздуха

5.2. Реактивы, растворы

Среда Чапека (или сухой бакто-агар Czapek) ТУ 9229-014-00419789-95 (или импортного производства)

Среда сусло-агар с массовой концентрацией лимонной кислоты 1,0% ГОСТ 10444.1-84

Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья ГОСТ Р 51652-2000

6. Требования безопасности

При выполнении измерений концентрации конидий продуцента Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны соблюдают:

• правила техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.005-88;
• правила электробезопасности при работе с электроустановками в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкциями по эксплуатации приборов;
• требования, изложенные в руководстве «Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности» (1980);
• положения инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности (1977);
• санитарные правила по работе с микроорганизмами СП 1.3.2322-08;
• требования безопасности при работе с продуцентом лимонной кислоты, изложенные в инструкции по контролю производства лимонной кислоты (1997).

Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.

7. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.

8. Условия измерений

Измерение концентрации конидий штамма-продуцента лимонной кислоты Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны проводят с помощью прибора «Фора-100» при температуре окружающей среды от 0 до 50 °C и относительной влажности воздуха не более 80%.

9. Проведение измерения

9.1. Условия отбора проб воздуха

Определение концентрации конидий микромицета Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе производственных помещений проводят в результате их аспирации на плотную питательную среду Чапека или сусло-агар с последующей инкубацией в термостате и подсчетом выросших колоний по типичным морфологическим признакам.

    Воздух  аспирируют  с  помощью  импактора  "Флора-100" в автоматическом
режиме  со  скоростью  10  куб.  дм/мин.  на  поверхность  среды Чапека или
сусло-агара  на  чашки  Петри.  Линейная  скорость  анализируемого  воздуха
автоматически   поддерживается   на  уровне,  позволяющем  осаждать  с  50%
эффективностью   частицы   диаметром  не  менее  1,4  мкм  (D  ).  Контроль

                                                         50

параметров (заданный отбираемый объем воздуха, текущий отобранный объем) осуществляется методом индикации.

Аспирацию воздуха проводят с интервалом 2 мин. и отбирают по 5 проб (через 2, 4, 6, 8 и 10 мин.) в каждой точке контроля. Выбор точек контроля определяется в соответствии с МУК 4.2.734-99.

Отбор проб сопровождается составлением акта отбора с указанием места, времени и условий отбора по форме:

Акт отбора проб

1. Дата, Ф.И.О. работающего (рабочее место) _______________________________

2. Профессия ______________________________________________________________

3. Предприятие (лаборатория, подразделение) _______________________________

4. Участок (технологическая стадия, операция) _____________________________

5. Место отбора (наименование рабочей зоны) _______________________________

6. Прибор для отбора проб _________________________________________________

7. Количество проб и точка их отбора ______________________________________

8. Условия отбора проб (объем прокаченного воздуха и время аспирации) _____

---

9. Дата последней метрологической поверки оборудования для отбора проб ____

---

10. Микроорганизм, содержание которого контролируется (род, вид, штамм) ___

---

11. Питательная среда, оптимум роста, время инкубации _____________________

Ответственный исполнитель Руководитель (технологического участка,

9.2. Выполнение анализа

Агаризованную среду Чапека (сухой бакто-агар Czapek готовят согласно документации фирмы-производителя) или сусло-агар расплавляют, остужают до 50 — 60 °C и разливают в стерильные чашки Петри по 20 куб. см. Чашки с застывшей средой помещают в термостат при температуре 37 °C на сутки, после чего проросшие чашки бракуют.

После отбора проб воздуха на чашки Петри их помещают в термостат при температуре 32 °C на 48 ч, по истечении которых производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. Микроскопирование культуры проводят с помощью микроскопа биологического с иммерсионной системой типа МБИ-15 в следующих условиях: объектив — планапохроматический; увеличение — 40,0 x 0,65; система — сухая; поле зрения с окуляром 10x в плоскости объекта 1,14 мм; рекомендуемый окуляр — К-6,3x.

10. Вычисление результатов измерения

Расчет концентрации микробных клеток Aspergillus niger ВКПМ F-171 в 1 куб. м воздуха выполняют на основании 5 проб, полученных при разном времени аспирации (через 2, 4, 6, 8 и 10 мин.) в каждой точке контроля, и производят по формуле:

                               П x 1000

K = --------, C x t

где:

K — концентрация клеток продуцента в воздухе, кл./куб. м;

П — количество колоний продуцента, выросших на чашке Петри;

1000 — коэффициент пересчета 1 куб. дм в 1 куб. м воздуха;

t — время аспирации, мин.

11. Оформление результатов измерений

Результаты измерений оформляют протоколом по форме.

Протокол № количественного микробиологического анализа штамма-продуцента Aspergillus niger ВКПМ F-171 в воздухе рабочей зоны

1. Дата проведения анализа ________________________________________________

2. Место отбора пробы _____________________________________________________

3. Название лаборатории ___________________________________________________

4. Юридический адрес организации __________________________________________

Результаты микробиологического анализа

Шифр или № пробы	Определяемый микроорганизм	Концентрация, кл./куб. м

Ответственный исполнитель __________________________________

Список литературы

1. ГОСТ 12.1.005-88 «ССБТ. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны». М.: Стандартинформ, 1988. 49 с.

2. ГОСТ Р 8.563-96 «Государственная система обеспечения единства измерений. Методики выполнения измерений». М.: Госстандарт России, 1997. 19 с.

3. Р 2.2.2006-05 «Руководство по гигиенической оценке факторов рабочей среды и трудового процесса. Критерии и классификация условий труда». М.: Госстандарт России, 2005. 40 с.

---